Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용

본 실험의 전반적인 목표는 생태학적 및 기술적 관점에서 제시된 박테리아 균주의 S-층 단백질에 의한 금 흡착 거동을 조사하는 것입니다. 이러한 방법들은 흡착 과정과 금속의 제거 및 회수와 같은 환경 관련 과학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 금속 흡착과 나노입자 흡착을 서로 다른 스케일 범위에서 검출할 수 있다는 점입니다.

QCM-D를 사용하면 이를 실시간 측정으로 검출할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 유체 셀에 센서 더미를 장착하십시오. 초순수에 희석한 2% 알칼리성 액체 세정제를 모듈당 최소 20 mL씩 QCM-D 및 튜브 시스템으로 펌핑하십시오.

그 다음, 제조사의 프로토콜에 따라 모듈당 5배 부피의 초순수를 분당 최대 300 microliters의 유속으로 시스템에 펌핑합니다. 유동 모듈 외부에 있는 이산화규소 센서를 2% sodium dodecyl sulfate 용액에 최소 20분 동안 배양하여 세척합니다. 그런 다음, 초순수로 센서를 여러 번 헹굽니다.

여과된 압축 공기로 결정을 건조시킨 후, 오존 세척 챔버에 20분 동안 넣습니다. 그 후, 모든 유기물을 제거하기 위해 세척 절차를 두 번 더 반복합니다. 센서 표면에서 결합된 금속을 제거하려면 1 M 질산으로 센서를 헹굽니다.

그런 다음 초순수로 센서를 여러 번 세척합니다. 다음으로, 층별 적층법(layer by layer 또는 LBL 기술)을 이용한 딥 코팅을 통해 3 g/L의 폴리에틸렌이민과 폴리스티렌 설포네이트를 교대로 적층하여 센서를 표면 개질합니다. 딥웰 플레이트에 담긴 적절한 고분자 전해질 용액에 센서를 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다.

그 다음, 센서를 고분자 전해질 용액에서 꺼내고, 매 딥 코팅 단계 사이마다 초순수로 충분히 헹굽니다. 외부 표면 개질이 완료되면 센서를 유체 모듈 내부에 배치합니다. 실험을 시작하기 전, 초순수로 센서를 헹구어 평형 상태로 만듭니다.

이 단계에서, 이전에 분리 및 정제한 Slp1을 폴리머를 모노머로 전환하기 위해 포뮬러 요소(formula urea)에 녹입니다. 모노머화된 단백질을 15,000 ×g, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리하여 더 큰 단백질 응집물을 제거합니다. 가용화 및 원심분리된 Slp1 상층액을 재결정 완충액과 혼합하여 최종 단백질 농도를 0.2 g/L로 맞춥니다.

유동 모듈 내부의 폴리전해질로 변형된 센서 상에서 단백질 재결정화가 성공적으로 완료되면, 주파수 및 소산 변화 값이 안정적으로 검출될 때까지 재결정화 완충액으로 코팅된 센서를 125 microliters per minute의 유속으로 충분히 헹굽니다. 유동 모듈 내에서 Slp1 코팅이 성공적으로 수행되면, 주파수 및 소산 변화 값이 안정적으로 검출될 때까지 얻어진 Slp1 층을 1.6 millimolar citrate buffer pH 5.0으로 충분히 헹굽니다. 그다음, 미리 준비한 1 millimolar 나노입자 용액을 125 microliters per minute의 유속으로 유동 모듈에 펌핑합니다.

그런 다음, Slp1 층으로의 질량 흡착을 추적합니다. 금속 나노입자 상호작용을 완료한 후, 약하게 결합된 금속이나 나노입자를 제거하기 위해 나노입자가 없는 버퍼로 층을 헹굽니다. 도립 광학 현미경이 장착된 원자힘 현미경(AFM)을 사용하여, 코팅된 QCM-D 센서 위에서 초순수를 이용해 액상 이미지를 기록합니다.

QCM-D 실험 후 센서를 초순수로 헹구고 AFM 유체 셀 안에 배치합니다. 물속에서 공진 주파수가 약 25 kHz이고 강성이 0.1 N/m 미만인 캔틸레버를 사용하십시오. 스캔 속도는 2.5에서 10 µm/s 사이로 조정합니다.

캔틸레버가 피에조(Piezo)에 의해 공진 주파수로 진동하는 상태에서 동적 접촉 모드로 이미지를 촬영합니다. 마지막으로, 진동 감쇠를 통해 캔틸레버와 표면 사이의 거리를 결정합니다. gold three by suspended Slp1의 최대 금속 결합 용량은 조사된 pH 범위 내의 24시간 배양 동안 안정적으로 결합되었음을 보여줍니다.

주파수의 즉각적인 감소는 단백질이 폴리전해질로 변형된 표면에 빠르게 흡착되었으며 높은 친화력을 가짐을 나타냅니다. 소산 값 또한 즉각적으로 증가하는데, 이는 빠른 댐핑으로 인해 소산 값이 증가함으로써 점탄성 분자가 표면에 흡착되었음을 시사합니다. 미리 합성된 금 나노입자를 Slp1과 함께 배양한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과, 나노입자가 Slp1 구조를 방해하지 않는다는 QCM-D 데이터가 확인되었습니다.

미리 합성된 금 제로 나노입자의 흡착이 QCM-D 실험의 delta F-delta D 도식과 두께 및 질량 프로파일로 나타나 있습니다. 폴리전해질로 변형된 센서 상에 재결정화된 Slp1 단백질 격자가 여기에 표시되어 있습니다. 격자 상수는 13~14 nanometers로 결정되었으며, 층 두께는 10 ± 2 nanometers인 것으로 확인되었습니다.

AFM 분석을 통해 금 3가 상호작용 후에도 Slp1 격자가 완전히 온전하게 유지됨을 확인했으며, 이는 코팅의 안정성을 예측한 QCM-D 결과와 일치합니다. AFM은 Slp1 격자 상에 금 0가 나노입자가 흡착되었음을 입증하지만, 입자 크기로 인해 Slp1의 p4 대칭을 따르지는 않습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 영업일 기준 하루 안에 완료할 수 있습니다.

이러한 방법을 통해, 특정 결합 부위나 금 또는 금 나노입자와의 상호작용과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 적외선 분광법이나 헬륨 이온 현미경과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 제시된 기술은 금속과 생체 분자의 상호작용, 예를 들어 다양한 종류의 표면에서의 흡착 및 탈착 거동을 연구하기 위한 uzrachem의 기반을 마련했습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 금속과 생물학적 용매의 상호작용을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 방법을 사용할 때는 반드시 보안경, 실험복, 그리고 당연히 장갑을 착용하는 것을 잊지 마십시오.