Name: Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용 Lysinibacillus 스패 리 쿠스 JG-B53 - QCM-D, 생체 분자 - 금속 연구 도구로서 ICP-MS와 AFM (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 배우세요 QCM-D, ICP-MS, AFM을 활용하여 S-layer 단백질과 금의 흡착 상호작용을 실시간으로 분석하는 방법을. 환경 과학 및 바이오기술 연구에 활용할 수 있습니다.

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본 연구는 부분적으로 BMWi과 BMBF 프로젝트 &quot;Aptasens&quot;(BMBF / DLR 01RB0805A)에 의해 투자 IGF-프로젝트 &quot;S-체&quot;(490 ZBG / 1)에 의해 투자되었다. AFM 연구 중과 영어를 모국어 스피커로 원고를 읽는 에릭 V. 존스턴에 그의 귀중한 도움을 토비아스 J. 귄터 특별 감사. 또한, 본 논문의 저자 (ICP-MS 측정에 도움을 자원 생태 연구소)에서 알린 리터와 사브리나 Gurlit 감사드립니다, Manja 보겔, 낸시 엉거, 카렌 E. Viacava와 헬름홀츠 연구소의 그룹 생명 공학 자원 기술에 대한 프라이 부르크.

저자가 공개하는 게 없다.

이 연구에서 상이한 분석 방법의 조합을 이용하여 조사 하였다 S 층의 Au 단백질의 결합을 연구 하였다. 특히, 금의 결합은 광산 물 또는 공정 용액에서 금의 회복뿐만 아니라, 물질, 예를 들면, 감각 표면의 건설을위한뿐만 아니라 매우 매력적이다. 금 상호 작용의 연구를 위해 (금 (III) 및 금 (0) -NPs)에 현탁하고 Slp1의 단층을 재결정 화하여, 단백질이 가지고 격리된다. 따라서 본 연구는 그람 양성 균주 L.의 성공적인 재배를 보여 주었다 스패 JG-B53과 표면층 Slp1 단백질의 분리. 그럼에도 불구하고, 재배 및 단백질 분리 도전을 유지하고 최적화해야합니다. 바이오 매스와 S-층 단백질의 대규모 생산은 금속 선택적 필터 재료의 제조에 모두 산업 응용 예를위한 전제 조건이다. 그들의 응용 가능성이있다 undoubtedl독성 금속의 제거 처리 또는 물에 용해 된 유가 금속의 회수, 폐수 또는 배출수 높은 Y. 또한, S-층에 대한 응용 가능성은 ...

전자 인해, 촉매, 바이오 센서, 또는 의료 기기 등 여러 가지 응용 프로그램에 대한 금의 사용 증가로,이 귀금속의 수요는 최근 몇 년 6-9 시간 동안 성장했다. 무거운 또는 귀금속에 의해 대부분의 환경 오염에 대한 진행 과정이지만 골드뿐만 아니라 많은 다른 귀금속과 중금속, 광업 활동을 통해, 묽은 농도의 산업 폐수를 통해 환경으로 배출, 폐기물 처리 7,8,10된다 주로 과학 기술 활동에 의해 발생. 이는 자연 생태계의 중요한 간섭에 이르게 잠재적으로 인간의 건강 (9)을 위협 할 수 있습니다. 이러한 부정적인 결과를 아는 것은 새로운 기술은 산업 폐수에서 금속을 재활용 오염 된 생태계와 개선에서 금속을 제거하는 대한 검색을 촉진합니다. 침전 또는 이온 교환 등의 노포 물리 화학적 방법은 특히 높은에서, 그렇게 효과적이지 않다LY 솔루션 7,8,11 희석. Biosorption는 하나의 생활 또는 죽은 바이오 매스로, 폐수 처리 (10, 12)에 대한 매력적인 대안이다. 생물학적 물질의 사용은 독성 화학 물질의 소비를 줄일 수있다. 많은 미생물이 축적 또는 금속을 고정화 기술되었다. 예를 들어, Lysinibacillus 스패 리 쿠스의 셀 (L. 스패) JG-A12은 귀금속, 높은 결합능을 도시 한 예를 들면, 팔라듐 (II), 백금 (II), 금 (III), 및 납과 같은 다른 독성 금속 (II) 또는 U (VI) 4,13, CR (VI) 14 바실러스 메가 테 리움의 세포), 금 (Au에 대한 백금 (II) 및 Pd (II) (15), 그리고 클로렐라 저속한위한 사카로 마이 세스 세레 비지에의 세포 (III)과 U (VI) (16) 17. 금과 같은 금속의 결합 이전 (III), (II)도 Desulfovibrio보고 된 팔라듐 (II), 및 Pt는 18 L.를위한 desulfuricans 스패 리 쿠스 JG-B53 (19, 20). 그럼에도 불구하고,하지 등L 미생물은 금속의 높은 금액을 결합하여 흡착 물질로서의 응용이 제한 12,21입니다. 또한, 용량을 결합 금속은 예를 들어, 다른 매개 변수, 세포 구성, 사용 된 바이오 구성 요소, 또는 환경 및 실험 조건 (PH, 이온 강도, 온도 등)에 따라 달라집니다. 고립 된 세포 벽 조각 (22, 23)의 연구는 막 지질, 펩티도 글리, 단백질, 또는 다른 구성 요소와 같이 복잡한 구성 전체 세포 8,21의 프로세스를 결합 금속을 이해하는 데 도움이됩니다. 이 연구에 초점을 맞추고 세포 구성 요소는 S-층 단백질이다. S-층 단백질은 많은 박테리아 및 고세균의 외부 세포 외피의 일부이며, 이들은 약 15 구성 - 이들 유기체의 총 단백질 질량의 20 %. 환경에 대한 제 1 인터페이스로서, 이러한 화합물은 세포 강하게 세균성 흡착 특성 (3)에 영향을 미친다. 분자량이 마흔에 이르기까지와 S-층 단백질kDa의 수백 개의 셀 내에서 발생되지만, 외부의 조립에 그들은 지질 또는 폴리머 막 세포벽 성분에 층을 형성 할 수있게한다. 고립되면, 거의 모든 S 계층 단백질이 자발적으로 인터페이스에서, 또는 평면 또는 튜브와 같은 구조 (3)을 형성하는 표면에, 정지에 자기 조립 고유 속성이 있습니다. 단백질 단일 층의 두께는, 세균에 따라, 5의 범위 내에 - 25 내지 24. 일반적으로, S-층 형성 단백질 구조는 35 내지 3,24에 경사 (P1 또는 P2), 정사각형 (P4), 또는 육방 정 (P3 또는 P6) 2.5의 격자 상수와 대칭을 가질 수있다. 격자 형성은 이가 양이온에 의존하고, 주로 칼슘 25, 26, 라프, J. 등의 많은 경우에 보인다. S-층 단백질을 기반으로 설계된 나노 구조의 산업용 애플리케이션에 기반 나노 복합체. (EDS Tijana (Z) 그 로브 및 Aitziber L. Cortajarena) (스프링, 2016 (제출)). 그럼에도 불구하고, 특히 칼슘 및 마그네슘 2+와 같은 이가 양이온 단량체 폴딩, 단량체 단량체의 상호 작용, 격자의 형성, 및 다른 금속의 역할의 전체 반응 캐스케이드는 아직 완전히 이해되지 않는다. 그람 양성 균주 L. 27 (새로운 계통 분류 후 바실러스 스패 리 쿠스에서 이름) 스패 리 쿠스 JG-B53는 우라늄 광산 폐기물 더미 &quot;Haberland&quot;(Johanngeorgenstadt, 작센, 독일) 4,28,29에서 분리 하였다. 기능적 S 층 단백질 (Slp1)가 정사각형 격자 116 30 kDa의 분자량, 및 박테리아 세포를 살아있는 31 ≈에 10 nm의 두께를 갖는다. 이전 연구에서, 약 10 nm의 두께를 가진 닫힌 안정된 단백질 층의 형성은 시험 관내에서 10 미만 19 분에서 달성되었다. 관련 균주 L. 스패 리 쿠스 JG-A12은, 또한 &quot;Haberland&quot;더미로부터 분리가 높은 금속 결합 능력을 보유하고 그 격리 S 층 단백질은 금과 같은 귀금속에 대한 높은 화학적, 기계적 안정성 및 우수한 수착 속도를 보여 주었다 (III), 백금 (II), 및 Pd (II) 4,32,33를. 귀금속의 결합이 어느 정도 특정 금속의 일부이고, 중합체의 외측 및 내측 표면에 단백질 및 기공의 관능기, 이온 강도의 가용성 및 pH 값에 의존한다. , OH-, PO 4 - -, SO 4 -, 및 SO-단백질에 의해 금속의 상호 작용을위한 관련 기능 그룹은 COOH-, NH 2이다. 원칙적으로, 금속 결합 용량은 응용 프로그램, 라프, 제이 등의 다양한 스펙트럼을 엽니 다. S-층 단백질을 기반으로 설계된 나노 구조의 산업용 애플리케이션에 기반 나노 복합체. (EDS Tijana (Z) 그 로브 및 Aitziber L. Cortajarena) (스프링 2016 (제출)). 예를 들어, 같은 제거 또는 복구를위한 biosorptive 구성 요소용해 독성 또는 유가 금속의 합성 또는 정기적으로 구조화 된 금속 나노 입자 NPS () 촉매를 들어, 바이오 감각 층 3,5,18,33 같은 다른 생물 공학 물질의 정의 증착을위한 템플릿. 금 등을 규칙적으로 배열 NP 어레이 (0) -NPs는 CO 산화 34-37위한 분자 전자 및 바이오 센서, 초 고밀도 저장 장치 등이 있으며, 촉매에서부터 주요 애플리케이션에 사용될 수있다. 이러한 응용 프로그램 및 이들 재료의 세련된 디자인의 개발은 기본 금속 바인딩 메커니즘의 깊은 이해를 필요로한다. 이러한 바이오 기초 물질의 개발을위한 전제 조건은 상기 생체 분자와 기술 (38, 39) 표면 사이의 계면 층의 신뢰성 구현이다. 예를 들어, 고분자 전해질 층은 S-39 단백질의 재결정 계면 층으로 사용 된 층별 (LBL) 기술 40,41 조립 </&gt; SUP. 이러한 인터페이스는 재현성 및 정량 방법으로 단백질 코팅을 수행하는 비교적 쉬운 방법을 제공한다. 접착 촉진제와 함께 수정없이 상이한 실험을 수행함으로써, 코팅 동력학, 층의 안정성 및 생 분자 19,42, 라프, J. 등의 금속과의 상호 작용에 관한 설명은 할 수있다. S-층 단백질을 기반으로 설계된 나노 구조의 산업용 애플리케이션에 기반 나노 복합체. (EDS Tijana (Z) 그 로브 및 Aitziber L. Cortajarena) (스프링 2016 (제출)). 그러나, 단백질 흡착 단백질과 표면의 복잡한 상호 작용 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다. 특히, 형태, 패턴 방향 및 코팅 밀도에 대한 정보는 아직 행방 불명입니다. 분산 모니터링 (QCM-D) 기술로 수정 진동자 마이크로 밸런스는 단백질 흡착, 코팅 동력학 연구를위한 도구와 상호 작용 친로서 최근 주목 받고있다나노 미터 크기 19,43-45에 세 스. 이 기술은 실시간 질량 흡착 상세한 검출을 허용하고, 단백질에 격자 19,20,42,46-48 단백질 자기 조립 공정 및 기능성 분자의 결합을위한 지표로 사용될 수있다. 또한, QCM-D 측정은 천연 생물학적 조건 하에서 단백질 성 금속 층 상호 작용 과정을 연구 할 수있는 가능성을 연다. 최근의 한 연구에있어서, Eu와 같은 선택된 금속과 S 층 단백질의 상호 작용 (III), 금 (III), 팔라듐 (II), 및 Pt가 (II) QCM-D (19, 20)과 함께 연구되어왔다. 흡착 된 단백질 층은 그람 양성 박테리아의 세포벽의 단순화 된 모델이 될 수있다. 이 단일 성분의 연구는 금속의 상호 작용에 대한 깊은 이해에 기여할 수있다. 그러나 전적으로 QCM-D 실험은 표면 구조와 단백질에 금속의 영향에 관한 진술을 허용하지 않습니다. 다른 기술들이 이러한 정보를 얻기 위해 필요하다. 하나의 POS구조적 특성에 촬상을위한 바이오 나노 대한 접근성 및 취득 정보는 원자력 현미경 (AFM)이다. 제시된 연구의 목적은 L.의 특정 Slp1에서 ((0) -NPs을 금 (III) 및 금) S-층 단백질에 금의 흡착을 조사했다 스패 리 쿠스 JG-B53. ICP-MS를 사용하여 5.0 QCM-D를 사용하여 고정화 S-레이어 - 실험은 2.0의 pH 범위에서 배치 규모에 현탁 단백질로 이루어졌다. 또한, 격자의 안정성에 금속염 용액의 영향이 후속 AFM 연구하여 조사 하였다. 이러한 기술들의 조합은 특정 금속 친화 관한 전체 박테리아 세포에 대한 이벤트를 바인딩에 대해 더 학습하기위한 도구로서 시험관 금속 상호 작용 과정의 이해에 기여한다. 이 기술뿐만 아니라 환경 보호를위한 금속의 회수를위한 적용 가능한 필터 재료의 개발 및 재의 보존을위한 중요(49)뿐만 아니라, 다양한 애플리케이션을위한 고도의 기술 순서 금속 NP에 어레이의 개발을위한 소스.

<table><tbody><tr><td>equiment 및 소프트웨어</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bioreactor, Steam In place 70L 파일럿 시스템</td><td>Applikon Biotechnology, 네덜란드</td><td>Z6X</td><td>dO2, Applikon Biotechnology 및 BioXpert 소프트웨어의 pH 센서 V2</td></tr><tr><td>비침습적 바이오매스 모니터 BugEye 2100</td><td>BugLab, Concord (CA), USA</td><td>Z9X</td><td>---</td></tr><tr><td>분광계 Ultrospec 1000</td><td>Amersham Pharmacia Biotech, 영국</td><td>80-2109-10</td><td>회사 현재 GE Healthcare Life Sciences</td></tr><tr><td>MiniStar 마이크로 원심분리기</td><td>VWR, 독일</td><td>521-2844</td><td>배양 시료의 원심분리용</td></tr><tr><td>Research system microscope BX-61</td><td>Olympus Germany LLC, Germany</td><td>037006</td><td>이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Cell^P와 결합된 현미경(버전 3.1)</td><td>Olympus 소프트 이미징 솔루션 LLC, M&uuml; nster, Germany</td><td>---</td><td>현미경과 함께</td></tr><tr><td>Powerfuge 파일럿 분리 시스템 Serie 9010-S</td><td>Carr Centritech, Florida, USA</td><td>9010PLT</td><td>바이오매스 수확용</td></tr><tr><td>T18 basic Ultra Turrax</td><td>IKA Labortechnik, Germany</td><td>431-2601</td><td>편모 제거 및 샘플 균질화용</td></tr><tr><td>Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, 미국</td><td>728411</td><td>단백질 분리에 사용됨</td></tr><tr><td>모바일 고전단 유체 프로세서, M-110EH-30 Pilot</td><td>Microfluidics, Massachusetts, USA</td><td>M110EH30K</td><td>세포 파열에 사용</td></tr><tr><td>Alpha 1-4 LSC 동결 건조기</td><td>Martin Christ 동결 건조기 LLC, Osterode, Germany</td><td>102041</td><td>---</td></tr><tr><td>UV-VIS 분광 광도계(NanoDrop 2000c)</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>91-ND-2000C-L</td><td>단백질 측정용 concentration</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 수직 전기영동 챔버</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, 뮌헨, 독일</td><td>165-3322</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>VersaDoc 이미징 시스템용 3000</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH, 뮌헨, 독일</td><td>1708030</td><td>SDS-PAGE 젤</td></tr><tr><td>ICP-MS Elan 9000</td><td>PerkinElmer, Waltham (MA), USA</td><td>N8120536</td><td>금속 농도</td></tr> <tr><td>측정용Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern Instruments, 우스터셔, 영국</td><td>ZEN3600</td><td>나노 입자 크기 측정용</td></tr><tr><td>Q-Sense E4 장치&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, 스웨덴 예테보리</td><td>QS-E4</td>, <td>LOT를 통해 주문됨 양자 설계(E4 플랫폼에 포함된 소프트웨어)</td></tr><tr><td>Q-Soft 401(데이터 기록)</td><td>Q-Sense AB, 스웨덴</td><td></td><td></td>예테보리</tr><tr><td>Q-Tools 3(데이터 평가 및 모델링)</td><td>Q-Sense AB, 스웨덴</td><td></td><td></td>예테보리</tr><tr><td>QCM-D 유량 모듈 QFM&nbsp; 401&nbsp;</td><td>Q-Sense AB, 스웨덴 예테보리</td><td>QS-QFM401</td>, <td>LOT 양자 디자인</td></tr><tr><td>QSX를 통해 주문&nbsp; 303 SiO2 압전 AT-cut 석영 센서</td><td>Q-Sense AB, 예테보리, 스웨덴</td><td>QS-QSX303</td><td>LOT를 통해 주문 양자 설계</td></tr><tr><td>오존 세척 챔버</td><td>Bioforce Nanoscience, Ames (IA), 미국</td><td>QS-ESA006</td><td>LOT를 통해 주문 양자</td></tr><tr><td>설계 원자력 현미경 MFP-3D Bio AFM</td><td>망명 연구, 산타 바바라 (캘리포니아), 미국</td><td>MFP-3DBio</td><td>AFM 측정 및 이미징 소프트웨어</td></tr><tr><td>Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td></td>--- <td>Cat에 포함된 이미징 소프트웨어. 아니요. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>Igor Version Pro 6.3.2.3 소프트웨어</td><td>WaveMetrics, Inc., USA</td><td></td>--- <td>이미징 소프트웨어는 Cat에 포함되어 있습니다. 아니요. MFP-3DBio</td></tr><tr><td>BioHeater</td><td>Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA</td><td>Bioheater</td><td>AFM 측정을 위한 샘플 히터</td></tr><tr><td>Biolever 미니 캔틸레버,&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>올림푸스 독일 LLC, 독일</td><td>&nbsp; BL-AC40TS-C2</td><td>AFM 측정에 선호되는 캔틸레버</td></tr><tr><td>WSxM 5.0 개발 6.5 (2013)</td><td>Nanotec Electronica S.L. , 스페인</td><td>AFM 분석용</td> <td>프리웨어</td> 소프트웨어</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Detergents and other equiment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>산성산, 100%, p.A.</td><td>칼 로스 GmbH+CO. KG</td><td>3738.5</td><td>위험, 인화성 및 부식성 액체 및 증기 피부에 심한 화상을 입히거나 눈에 손상을 일으킵니다.</td></tr><tr><td>소포제 204</td><td>시그마-알드리치 주식회사 LLC.</td><td>A6426</td><td>거품 억제</td></tr><tr><td>용 브로 모페놀 블루, 나트륨 염</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>B5525</td><td>---</td></tr><tr><td>쿠마시 브릴리언트 블루 R (C45H44N3NaO7S2)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3862.1</td><td>---</td></tr><tr><td>돼지 비장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제 II</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>D4138</td><td>일반 IV , 2,000 - 6,000&nbsp; Kunitz units/mg 단백질</td></tr><tr><td>에탄올, 95%</td><td>VWR, 독일</td><td>20827.467</td><td>위험, 가연성</td></tr><tr><td>글리세린, p.A.</td><td>칼 로스 GmbH+CO. KG</td><td>3783.1</td><td>---</td></tr><tr><td>구아니딘 염산염 (GuHCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>0037.1</td><td>---</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma GmbH & Co. KG</td><td>9-307-011-4-507</td><td>---</td></tr><tr><td>염산 (HCl) (37%)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>4625.2</td><td>위험; 부식성, pH 조정에 사용되는</td></tr><tr><td>닭 달걀 흰자</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC의 Lysozyme.</td><td>L6876&nbsp;</td><td>동결건조 분말, 단백질 = 90 %, = 40,000 units/mg 단백질 (시그마)&nbsp;</td></tr><tr><td>가열 기능이 있는 자석 교반기,&nbsp; MR 3000K</td><td>Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany</td><td>504.10100.00</td><td>실험 내 표준 교반기</td></tr><tr><td>NB-Media DM180</td><td>Mast Diagnostica GmbH</td><td>121800</td><td>---</td></tr><tr><td>질산(HNO3)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN50.1</td><td>위험; 산화, 부식</td></tr><tr><td>PageRuler 염색되지 않은 단백질 사다리</td><td>ThermoScientific-Pierce</td><td>26614</td><td>---</td></tr><tr><td>Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>243051</td><td>평균 Mw ~ 70,000</td></tr><tr><td>폴리 에틸 렌 이민 (PEI),</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td> 분기<td>408727</td><td>경고; 유해하고, 자극적이며, 환경에 위험합니다. 평균 Mw ~25,000</td></tr><tr><td>무수 탄산칼륨 (K2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>60108</td><td>경고; </td></tr><tr><td>소 췌장에서 유해한 리보뉴클레아제 A&nbsp;</td><td>시그마-알드리치 주식회사 LLC.</td><td>R5503</td><td>유형 I-AS, 50 - 100 Kunitz 단위/mg 단백질&nbsp;</td></tr><tr><td>아지드화 나트륨 (NaN3)</td><td>Merck KGaA</td><td>106688</td><td>위험; 매우 독성이 있고 환경에 위험</td></tr>하다 <tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3957.2</td><td>---</td></tr> <tr><td>황산나트륨 (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC.</td><td>L-5750</td><td>위험; 독성</td></tr><tr><td>수산화나트륨 (NaOH)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>6771.1</td><td>위험; 부식성, 재배 및 pH 조정 내에서 pH 조절에 사용</td></tr><tr><td>Spectra/Por 6, 투석 막, MWCO 50,000&nbsp;</td><td>칼 로스 GmbH+CO. KG</td><td>1893.1</td><td>---</td></tr><tr><td>황산 (H2SO4)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>HN52.2</td><td>위험; 부식성, 재배 내 pH 조절에 사용</td></tr><tr><td>탄닌산 (C76H52O46)</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>16201</td><td>---</td></tr><tr><td>TRIS HCl (C4H11NO3HCl)</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>9090.2</td><td>---</td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>CARL ROTH GmbH+CO. KG</td><td>3051.3</td><td>경고; 유해하고 환경에 위험함</td></tr><tr><td>VIVASPIN 500, 50,000 MWCO 한외여과 튜브</td><td>Sartorius AG</td><td>VS0132</td><td>---</td></tr><tr><td>&beta;-메르캅토에탄올</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>M6250</td><td>위험, 유독성</td></tr></tbody></table> 물질

slp1 중합체 및 단층의 au-상호 작용<em&gt; lysinibacillus 스패 리 쿠스</em&gt; jg-b53 - qcm-d, 생체 분자 - 금속 연구 도구로서 icp-ms와 afm

Au-Interaction of Slp1 Polymers and Monolayer from Lysinibacillus sphaericus JG-B53 - QCM-D, ICP-MS and AFM as Tools for Biomolecule-metal Studies

이 간행물에서는 Lysinibacillus sphaericus JG-B53의 표층(S-layer) 단백질(Slp1)의 금 흡착 거동에 대해 설명합니다. 이러한 생체 분자는 표면에 paracrystalline 2차원 배열로 배열되어 금속과 결합하므로 환경 및 산업 공정에서 다양한 원소를 제거하거나 회수하기 위한 생체 흡착 재료와 같은 여러 생명 공학 응용 분야에 흥미를 느낍니다. S-layer directed synthesis 1 또는 나노 입자의 흡착에 의한 Au(0) 나노 입자의 S-층 상에 증착은 다양한 감각 응용을 위한 새로운 가능성을 열어줍니다. 수많은 연구에서 S층 2-5의 생흡착 특성을 설명했지만, 단백질-단백질 및 단백질-금속 상호 작용에 대한 심층적인 이해는 여전히 어렵습니다. 다음 연구에서는 유도 결합 질량 분석법(ICP-MS)을 사용하여 부유 S-층에 의한 금속 흡착을 감지했습니다. 이는 QCM-D(quartz crystal microbalance with dissipation monitoring)의 측정과 상관관계가 있으며, 이를 통해 단백질질 단층 형성 및 금속 증착을 온라인으로 검출할 수 있으므로 금속 결합에 대한 보다 자세한 이해를 얻을 수 있습니다.
ICP-MS 결과는 부유 S-층 폴리머에 대한 Au(III)의 결합이 pH에 의존적임을 나타냅니다. Au (III)의 최대 결합은 pH 4.0에서 얻어졌다. QCM-D 조사를 통해 현장 실험 중에 실시간으로 Au(0)-NP의 증착뿐만 아니라 Au(III) 흡착을 검출할 수 있었습니다. 또한 이 방법을 통해 Slp1의 단백질 격자 안정성에 대한 금속 결합의 영향을 연구할 수 있었습니다. 구조적 특성과 단백질층 안정성은 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 QCM-D 실험 직후에 시각화할 수 있었습니다. 결론적으로, 이러한 다양한 방법의 조합은 현탁액 또는 박테리아 세포 또는 재결정화된 표면에서 단층으로 사용되는 박테리아 S-layer 단백질에 의한 금속 결합에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다.

미생물과 Slp1 특성의 재배 박테리아의 성장의 기록 데이터는 약 5 시간의 지수 성장기의 끝을 나타낸다. 이전 조사는 Slp1 수확의이 점 (4.36 G / L 젖은 바이오 매스 (≈ 1.45 그램 / 리터 (BDW)) 최대 수율 (19)와 분리 될 수 있음을 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 정의 된 미디어 구성 요소 또는를 사용하여 재배의 최적화 FED- 일괄 재배 전략. 이것은 산업용 애플리케이션을위한 바이오 매스의 높은 양의 사용에 대한 양도 할 수없는 것입니다 높은 바이오 매스 수율로 이어질 것입니다. 온라인의 값과 오프라인 기록 재배 매개 변수도 3a에 요약되어있다. 현미경 제어 (그림 3B)를시 L...

수성 시스템에서 금의 흡착 및 재활용에 대한 기본 정보를 얻기 위해 S층 단백질에서 Au(III) 및 Au(0) 나노 입자의 상호 작용을 조사했습니다. 단백질 고분자의 흡착은 ICP-MS에 의해, 단백질성 단층의 흡착은 QCM-D에 의해 조사되었습니다. 후속 AFM은 나노 구조의 이미징을 가능하게 합니다.

Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용<em&gt; Lysinibacillus 스패 리 쿠스</em&gt; JG-B53 - QCM-D, 생체 분자 - 금속 연구 도구로서 ICP-MS와 AFM

In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These ...

본 실험의 전반적인 목표는 생태학적 및 기술적 관점에서 제시된 박테리아 균주의 S-층 단백질에 의한 금 흡착 거동을 조사하는 것입니다. 이러한 방법들은 흡착 과정과 금속의 제거 및 회수와 같은 환경 관련 과학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술들의 주요 장점은 금속 흡착과 나노입자 흡착을 서로 다른 스케일 범위에서 검출할 수 있다는 점입니다.QCM-D를 사용하면 이를 실시간 측정으로 검출할 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 유체 셀에 센서 더미를 장착하십시오. 초순수에 희석한 2% 알칼리성 액체 세정제를 모듈당 최소 20 mL씩 QCM-D 및 튜브 시스템으로 펌핑하십시오.그 다음, 제조사의 프로토콜에 따라 모듈당 5배 부피의 초순수를 분당 최대 300 microliters의 유속으로 시스템에 펌핑합니다. 유동 모듈 외부에 있는 이산화규소 센서를 2% sodium dodecyl sulfate 용액에 최소 20분 동안 배양하여 세척합니다. 그런 다음, 초순수로 센서를 여러 번 헹굽니다.여과된 압축 공기로 결정을 건조시킨 후, 오존 세척 챔버에 20분 동안 넣습니다. 그 후, 모든 유기물을 제거하기 위해 세척 절차를 두 번 더 반복합니다. 센서 표면에서 결합된 금속을 제거하려면 1 M 질산으로 센서를 헹굽니다.그런 다음 초순수로 센서를 여러 번 세척합니다. 다음으로, 층별 적층법(layer by layer 또는 LBL 기술)을 이용한 딥 코팅을 통해 3 g/L의 폴리에틸렌이민과 폴리스티렌 설포네이트를 교대로 적층하여 센서를 표면 개질합니다. 딥웰 플레이트에 담긴 적절한 고분자 전해질 용액에 센서를 넣고 상온에서 10분 동안 배양합니다.그 다음, 센서를 고분자 전해질 용액에서 꺼내고, 매 딥 코팅 단계 사이마다 초순수로 충분히 헹굽니다. 외부 표면 개질이 완료되면 센서를 유체 모듈 내부에 배치합니다. 실험을 시작하기 전, 초순수로 센서를 헹구어 평형 상태로 만듭니다.이 단계에서, 이전에 분리 및 정제한 Slp1을 폴리머를 모노머로 전환하기 위해 포뮬러 요소(formula urea)에 녹입니다. 모노머화된 단백질을 15,000 ×g, 4 °C에서 1시간 동안 원심분리하여 더 큰 단백질 응집물을 제거합니다. 가용화 및 원심분리된 Slp1 상층액을 재결정 완충액과 혼합하여 최종 단백질 농도를 0.2 g/L로 맞춥니다.유동 모듈 내부의 폴리전해질로 변형된 센서 상에서 단백질 재결정화가 성공적으로 완료되면, 주파수 및 소산 변화 값이 안정적으로 검출될 때까지 재결정화 완충액으로 코팅된 센서를 125 microliters per minute의 유속으로 충분히 헹굽니다. 유동 모듈 내에서 Slp1 코팅이 성공적으로 수행되면, 주파수 및 소산 변화 값이 안정적으로 검출될 때까지 얻어진 Slp1 층을 1.6 millimolar citrate buffer pH 5.0으로 충분히 헹굽니다. 그다음, 미리 준비한 1 millimolar 나노입자 용액을 125 microliters per minute의 유속으로 유동 모듈에 펌핑합니다.그런 다음, Slp1 층으로의 질량 흡착을 추적합니다. 금속 나노입자 상호작용을 완료한 후, 약하게 결합된 금속이나 나노입자를 제거하기 위해 나노입자가 없는 버퍼로 층을 헹굽니다. 도립 광학 현미경이 장착된 원자힘 현미경(AFM)을 사용하여, 코팅된 QCM-D 센서 위에서 초순수를 이용해 액상 이미지를 기록합니다.QCM-D 실험 후 센서를 초순수로 헹구고 AFM 유체 셀 안에 배치합니다. 물속에서 공진 주파수가 약 25 kHz이고 강성이 0.1 N/m 미만인 캔틸레버를 사용하십시오. 스캔 속도는 2.5에서 10 µm/s 사이로 조정합니다.캔틸레버가 피에조(Piezo)에 의해 공진 주파수로 진동하는 상태에서 동적 접촉 모드로 이미지를 촬영합니다. 마지막으로, 진동 감쇠를 통해 캔틸레버와 표면 사이의 거리를 결정합니다. gold three by suspended Slp1의 최대 금속 결합 용량은 조사된 pH 범위 내의 24시간 배양 동안 안정적으로 결합되었음을 보여줍니다.주파수의 즉각적인 감소는 단백질이 폴리전해질로 변형된 표면에 빠르게 흡착되었으며 높은 친화력을 가짐을 나타냅니다. 소산 값 또한 즉각적으로 증가하는데, 이는 빠른 댐핑으로 인해 소산 값이 증가함으로써 점탄성 분자가 표면에 흡착되었음을 시사합니다. 미리 합성된 금 나노입자를 Slp1과 함께 배양한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과, 나노입자가 Slp1 구조를 방해하지 않는다는 QCM-D 데이터가 확인되었습니다.미리 합성된 금 제로 나노입자의 흡착이 QCM-D 실험의 delta F-delta D 도식과 두께 및 질량 프로파일로 나타나 있습니다. 폴리전해질로 변형된 센서 상에 재결정화된 Slp1 단백질 격자가 여기에 표시되어 있습니다. 격자 상수는 13~14 nanometers로 결정되었으며, 층 두께는 10 ± 2 nanometers인 것으로 확인되었습니다.AFM 분석을 통해 금 3가 상호작용 후에도 Slp1 격자가 완전히 온전하게 유지됨을 확인했으며, 이는 코팅의 안정성을 예측한 QCM-D 결과와 일치합니다. AFM은 Slp1 격자 상에 금 0가 나노입자가 흡착되었음을 입증하지만, 입자 크기로 인해 Slp1의 p4 대칭을 따르지는 않습니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 영업일 기준 하루 안에 완료할 수 있습니다.이러한 방법을 통해, 특정 결합 부위나 금 또는 금 나노입자와의 상호작용과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 적외선 분광법이나 헬륨 이온 현미경과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 제시된 기술은 금속과 생체 분자의 상호작용, 예를 들어 다양한 종류의 표면에서의 흡착 및 탈착 거동을 연구하기 위한 uzrachem의 기반을 마련했습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 금속과 생물학적 용매의 상호작용을 조사하는 방법에 대해 충분히 이해하셨을 것입니다. 이 방법을 사용할 때는 반드시 보안경, 실험복, 그리고 당연히 장갑을 착용하는 것을 잊지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 나노 구조 기질과 고정화된 단백질 및 압타머와 인터페이스하는 나노 생물학적 시스템의 제조 및 특성화를 설명합니다. 나노 구조 기판의 리소그래피 제작, 생체 기능화 및 표면 강화 라만 분광법(SERS) 특성화와 관련된 관련 실험 단계가 보고됩니다. 표면 고정 단백질의 SERS 검출 및 단백질-리간드 및 압타머-리간드 결합의 프로빙이 입증되었습니다.

표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

단백질 기능화 평면 유리 지지 지질 이중층의 준비, 내 단백질 이동성 측정 및 단백질 밀도 측정이 여기에 나와 있습니다. 노이즈를 줄인 내부 전반사(Total Internal Reflection) 현미경을 구축하기 위한 로드맵이 요약되어 있으며, 이를 통해 높은 시공간 해상도로 단일 이중층 상주 형광 색소를 시각화할 수 있습니다.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

이 작업은 수용액 중의 단백질의 생체 시츄 비행 시간 형 2 차 이온 질량 분석기 분석을위한 마이크로 액체 취급 및 샘플 도입을위한 프로토콜을 나타낸다.

SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

여기 선물이 조립과 해체 biolayer 간섭계 (씨)를 사용 하 여 탄 저 균 독 소의 모니터링 하는 프로토콜. 조립/분해 바이오 센서 표면에, 다음 큰 단백질 복합물 시각화 및 각각 전자 현미경 검사 법 및 질량 분석를 사용 하 여 단지의 구성 요소 식별에 대 한 표면에서 해제 됩니다.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

배우세요 QCM-D, ICP-MS, AFM을 활용하여 S-layer 단백질과 금의 흡착 상호작용을 실시간으로 분석하는 방법을. 환경 과학 및 바이오기술 연구에 활용할 수 있습니다.

Slp1 중합체 및 단층의 AU-상호 작용

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