ELISA 기반 바인딩과 경쟁 방법은 신속 리간드 - 수용체 상호 작용을 확인하는 방법

제시된 프로토콜은 리간드-수용체 상호 작용의 신속한 조사를 위한 두 가지 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 기반 기술을 설명합니다. 첫 번째 분석법은 리간드와 수용체 사이의 해리 상수를 결정할 수 있도록 합니다. 두 번째 분석은 리간드-수용체 상호 작용에 대한 차단 펩타이드의 신속한 스크리닝을 가능하게 합니다.

이 ELISA 기반 방법의 목표는 첫째, 사이토카인과 수용체의 결합 친화도를 결정하는 것이고, 둘째, 리간드-수용체 상호작용의 억제 펩타이드의 차단 효과를 측정하는 것입니다. 이 방법은 사이토카인-수용체 결합과 같은 단백질-단백질 상호 작용 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이들의 결합 친화력과 봉쇄는 상호 작용 역학에 대한 일반적인 이해를 증가시킬 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 수행하기 쉽고, 라벨 수용체를 생성하며, ELISA 리더와 같이 쉽게 구할 수 있기 때문에 상대적으로 저렴하다는 것입니다. 이 방법은 사이토카인 수용체 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 일반적인 단백질-단백질 상호 작용 및 특정 상호 작용을 억제하기 위한 차단 화합물 설계와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 솔루션을 준비합니다.

탄산염 코팅 버퍼를 0.22미크론 PES 멤브레인으로 필터링해야 합니다. 진공 청소기를 사용하십시오. 또한 각 리간드 또는 펩타이드를 10가지 농도로 만듭니다.

이 비디오에는 두 가지 분석이 설명되어 있으며, 첫 번째는 직접 리간드 수용체 상호 작용인 ELISA입니다. 수용체-리간드 해리 상수를 측정하는 데 사용할 수 있으며, 이는 수용체-리간드 결합 친화도를 나타냅니다. 두 번째 분석은 최근에 최적화된 경쟁 리간드-수용체 상호 작용 ELISA입니다.

이를 통해 펩타이드 및 기타 차단 화합물을 스크리닝할 수 있으며, 이는 수용체-리간드 상호 작용을 방해하는 역할을 합니다. 효율성을 위해 96웰 플레이트에 멀티채널 피펫을 사용할 준비를 하고, 디캔팅할 때는 내용물을 버리기만 하면 됩니다. 플레이트를 재조합 수용체로 코팅하여 이 절차를 시작합니다.

먼저, 탄산염 완충액의 수용체를 마이크로리터당 100나노그램으로 희석합니다. 그런 다음 플레이트 웰에 100마이크로리터의 수용체 용액을 로드합니다. 플레이트 가장자리 아티팩트를 처리하지 않도록 외부 벽을 제외합니다.

접시를 덮고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 부드러운 소용돌이로 모든 플레이트 배양을 수행합니다. 다음날 코팅 용액을 제거하고 Tween 20을 터치하여 세척 용액 PBS로 플레이트를 세 번 세척합니다.

다음으로, 200마이크로리터의 5%PSA를 첨가하여 유리 수용체 결합 부위를 차단합니다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양하여 블록을 완성합니다. 나중에 우물을 비우고 이전과 같이 접시를 씻으십시오.

이제 웰에 100마이크로리터의 다양한 희석액을 재조합 his-tag 리간드를 로드합니다. 각 농도를 중복하여 로드합니다. PBS만으로 블랭크 웰을 로드합니다.

그런 다음 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다. 리간드로 배양한 후 세척액으로 플레이트를 세 번 씻습니다. 그런 다음, 1차 항-히스 마우스 단클론 항체 100마이크로리터 분취액을 각 웰에 피펫팅하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

항체를 세척한 후 각 웰에 100마이크로리터의 HRP 결합 염소 항-마우스 IGG 2차 항체 용액을 첨가합니다. 빛을 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 감쌉니다. 그런 다음 실온에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다.

표준 세척 기술을 사용하여 2차 항체를 제거합니다. 이제, 각 우물에, 동일한 양의 재고 기질 해결책 A와 B.Then.Then에서, 15 30 분 동안 실내 온도에 판을 지키기 위하여 한 갓 준비된 TMB의 100 마이크로리터를 추가하십시오. 그런 다음 충분한 발색 후 각 웰에 50마이크로리터의 원액을 첨가합니다.

프로토콜은 메시지가 전송된 신호가 특정 바인딩에서 발생한다는 가정을 기반으로 합니다. 신호에 대한 비특이적 결합의 기여도를 추정해야 할 수도 있습니다. 그런 다음 450나노미터에서 플레이트 흡광도 값을 읽고 KD 값 계산을 진행합니다.

경쟁 LRA 절차는 몇 가지 중요한 변경 사항을 제외하고는 직접 LRA 절차와 동일한 단계를 따릅니다. 플레이트에서 여분의 코팅 리간드를 씻어낸 후 플레이트 웰을 막습니다. 각 웰에 200마이크로리터의 5%BSA 용액을 넣고 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양합니다.

배양 중에 PBS에서 밀리리터당 10나노그램의 고정 농도로 재조합 his-tag 리간드를 준비합니다. 그런 다음 10 나노몰에서 100 마이크로몰에 이르는 PBS의 다양한 농도로 차단 펩타이드를 준비하여 용량-반응 곡선을 보장합니다. 따라서, 블로킹 펩타이드에 대한 IC50 값을 찾을 수 있습니다.

control wells에서 펩타이드 없이 고정된 리간드 농도를 로드하여 최대 결합을 유도합니다. 빈 웰에서 리간드 또는 펩타이드가 없는 PBS만 추가합니다. 다른 웰에서 50마이크로리터의 리간드와 50마이크로리터의 각 펩타이드 농도를 추가합니다.

그런 다음 실온에서 2시간 동안 플레이트를 배양하고 평소와 같이 진행합니다. 3개의 서로 다른 인터페론 리간드 펩타이드와 수용체 알파 소단위 IL28R-a 사이의 해리 상수는 직접 LRA를 사용하여 결정되었으며, 점유된 결합 부위의 비율은 각 인터페론 농도의 로그에 대해 표시되었습니다. 이러한 결과는 데이터를 Hill 방정식에 피팅하여 KD 값을 추정하기 위해 분석할 수 있는 결합 곡선을 보여줍니다.

Scatchard 플롯은 리간드 결합의 협력성을 보여주며, 궁극적으로 인터페론 리간드 1이 가장 높은 결합 친화도를 가지며 인터페론 리간드 2와 인터페론 리간드 3이 그 뒤를 잇습니다. Hill 계수 값이 1 이상이면 초기 리간드 수용체 상호 작용 후 추가 리간드에 대한 친화도가 증가했음을 시사합니다. 다음으로, 인터페론 리간드 펩타이드와 수용체 소단위 사이의 상호 작용에 대한 차단 펩타이드의 영향을 정량화하기 위해 경쟁력 있는 LRA를 사용했습니다.

밀리리터당 10나노그램에서 인터페론 리간드 펩타이드에 대한 점유 결합 부위의 분율은 인터페론 펩타이드 농도의 로그와 비교하여 표시됩니다. 이 데이터에서 IC50 값이 추정되었습니다. 계산된 값에 따르면, 차단 펩타이드는 인터페론 리간드 3과 IL28R-a 사이의 상호작용을 최대한 억제했습니다.

이 기술을 마스터하면 8 시간 안에 완료 할 수 있습니다. 제대로 수행되는 경우. 이 절차를 시도하는 동안, 리간드 수용체 결합의 각 포화 농도는 이 절차에 따라 다음과 같은 다른 방법을 수행하여 보다 상세한 KD 값을 얻을 수 있음을 기억하는 것이 중요합니다.

개발 후 이 기술은 리간드-수용체 상호 작용 분야의 연구자들이 이러한 상호 작용을 차단하기 위한 억제 물질을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.