Name: 등전위 뇌 상태의 유도는 신경 흥분에 내생 시냅스 활동의 영향을 조사하기 생체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 학습하세요 등전위 뇌 상태 유도를 통해 생체 내 단일 뉴런의 통합 특성을 시냅스 입력 없이 연구하는 방법을. 이 기술은 신경 생리학에서 네트워크 활동이 단일 세포 계산에 미치는 영향을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 파운데이션 부문 드 프랑스,​​ 문화원 국립 드 라 상테 엣 드 라 공들인 MEDICALE, 피에르 &amp; 마리 퀴리 대학 프로그램 &#39;INVESTISSEMENTS 디부 AVENIR&#39;ANR-10 IAIHU-06에서 보조금에 의해 지원되었다.

모든 절차는 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 수행 하였다 (지침 63분의 2,010 / EU) 및 동물 실험에 찰스 다윈 (Charles Darwin) 윤리위원회에 의해 승인했다. 그러나 우리는 대부분의 단계가 모두의 특정 요구에 맞게 적용 할 수 있습니다, 우리가 일상적으로 우리 연구실에서 사용하는 절차를 설명합니다. 1. 수술 준비 참고 : 모든 절개 및 압력 점을 반복해서 국소 마취제 (리도카인 또는 부피 바카)으로 침투한다. 무균 제제 여러 수정이 구현되어야 필요한 경우, 본 절차는 단말이다. <ol><li> 로컬로 분리 복강 내 (IP) 주사를 나트륨 펜 토바 비탈 (40 ㎎ / ㎏) 및 케타민 (50 ㎎ / ㎏)로 쥐를 마취. </li><li> 동물은 전신 마취하에 이동을 반복 마취의 수술 비행기가 (곤란 발끝까지 아무런 반응을) 달성되지 않았 음을 확인하자. 철에 쥐를 놓습니다edback 가열 담요와 37 ° C 주위 코어 온도를 유지하기 위해 직장 프로브를 삽입합니다. </li><li> 마취제의 후속 주입을 용이하게하기 위해 반복 바늘 천공 (30)에 의해 장기 천공 방지하기 위해 복강에 카테터를 놓습니다. <ol><li> 위의 오른쪽 또는 왼쪽 사분면에 위치한 지역 위의 지역 - 작은 (3mm ~ 2)를 통해 머리를 클립. 주 : 탈모 용 크림도 사용할 수있다. </li><li> 날카로운 가위 또는 메스로 피부에 3mm 절개 - 2를 확인합니다. 복강이 관찰 될 때까지 무딘 절개를 사용하여, 지방과 근육 층을 제거합니다. </li><li> 공동의 작은 카테터의 2cm 수술 접착제 상처를 닫습니다 - 1을 삽입합니다. (. 예를 들면,이 프랑스 - 내경 0.043 mm에 대응) 참고 직경 카테터의 전체 길이는 최소화되어야 데드 볼륨을 감소시킨다. 폴리 우레탄 튜브가 가장 적합하다. </li><li> 루프와 봉합 t을그 자리에 고정하는 피부 카테터. </li></ol></li><li> 인공 호흡 동안 환기를 제어하는​​ 기관 튜브를 설치합니다. <ol><li> 이전 단계로서, 관심 영역 준비 (1 - 우측 흉골 상기 기관 위에 2cm)를 모발을 제거하고, 피부를 절개. </li><li> 지방과 근육의 첫 번째 층을 해부 무딘, 다음 옆으로 침샘을 이동하고 부드럽게 근육의 마지막 층을 해부하여 기관을 노출. </li><li> 조심스럽게 기관을 통해 조직을 제거하고 작은 집게를 사용하여 그 아래에 스레드를 밀어 넣습니다. 스레드와 외과 의사의 매듭을 확인했지만 아직 꽉하지 않습니다. </li><li> 이 연골 고리 사이의 기관의 횡 방향을 절개. 기관있는 경우에 면봉 혈액입니다. </li><li> 적절한 직경 기관 튜브를 삽입하고 꾸준한 튜브를 고정하는 나사의 매듭을 조입니다. 추가적인 안정성을 위해 스레드는 상기기도 튜브의 높은 지점에 부착 될 수있다. </li><li> Sutur전자 상처를 촬영하거나 수술 스테이플을 사용합니다. 기관 튜브를 재사용하기위한 것입니다 경우 여기를 수술 접착제를 피하십시오. </li></ol></li><li> 고정대에서 동물을 설치하고 신중하게 다음과 같은 생리 학적 변수 모니터링 : ECOG, SPO 2, ETCO 2, 내부 온도 (심전도, 심전도를 통해) 심장 박동. 모니터링 및 마취 및 생리 학적 상태의 적절한 깊이를 유지하기 위해 이러한 변수를 조정합니다. 구체적으로는, 나트륨 펜 토바 비탈의 작은 투여 량 (10 ㎎ / ㎏)으로 마취 필요한 경우 보충. </li><li> 탈수를 방지하기 위해 두 눈에 눈 연고를 적용합니다. 세로 절개 (~ 2cm)를 확인 두피 위에 머리를 클립과 메스 나 큐렛을 이용하여 두개골을 덮는 결합 조직을 절제. </li><li> 치과 드릴 관심 영역 위에 작은 (~ 1.5 mm 직경) 개두술을 확인합니다. 참고 : 여기에, 차 체 감각 피질의 배럴 필드가 대상 (7~8mm의 전방을 간가 라인에, 4.5- 5.5 mm)의 중심선 (31) 측 방향. 열을 방출하기 위해 반복적으로 씻어. </li><li> 부드럽게 경질에 작은 구멍을 만들기 위해 여분의 미세 집게를 사용합니다. ECOG 전극을 배치 뇌 공술 (Trepanation) 내에 ~ 0.5 mm 영역을 예약 (다음 단계 참조). 영구적으로 0.9 % NaCl 용액 (또는 인공 뇌 - 척수)와 촉촉한 피질을 유지합니다. </li><li> 아니라 수막에 의해 덮여 피질 영역을 피하고, 경질의 저임피던스 (~ 60 kΩ의)은 전극합니다 (ECOG 전극)을 배치하고, 상기 헤드의 반대편에 두피 근육에 기준 전극을 배치. </li><li> 이 단계 (마지막 펜토 바르 비탈 나트륨 주입 후 30 분)에서, IP 카테터를 통한 나트륨 펜 토바 비탈 (10 내지 15 ㎎ / ㎏ / H) 또는 펜타닐 (3-6 μg의 / kg / H)의 반복 주사하여 마취를 유지한다. 후자는 desynchronized, 깨어처럼, 대뇌 피질의 프로필 발생합니다 반면 전자는 느린 진동, 수면 등, ECOG 패턴 발생합니다. </li><li> 인공 V를 조정호흡 주파수 볼륨 래트의 자발 호흡 (- 115 호흡 / 분 (32)이 정상 범위 (70))와 유사하다되도록 entilation 시스템. 그 후, 기관 튜브로 인공 호흡기를 연결하고 (양면) 적절한 흉부 케이지 인플레이션을 확인합니다. 그렇지 않으면, 기관 축 통기 튜브의 위치를​​ 조정한다. 필요한 경우, 주사기 또는 진공 펌프에 연결된 도관과기도 내에 존재하는 분비를 빨아. </li><li> 29,36 패턴이 마취의 안정적인 수술 비행기를 반영하는 32 ~ 35과 ECOG 모든 생리 학적 변수, 쥐, 40 mg의 마비 각 다리에 gallamine의 triethiodide의 근육 주사를 할 경우 / 최초 주입 kg을 한 후 20 ㎎ / ㎏ 매일 2 시간 19,29,36,50. </li></ol> 2. 세포 내 녹음 <ol><li> ~ 0.2 μm의 끝 유리 마이크로 피펫 (날카로운 미세 전극)를 당겨 같은 저항은 betwee 범위N 50 80 MΩ 번이 M 칼륨 아세테이트 (KAC) 가득합니다. </li><li> (머리의 무대를 통해) 세포 내 앰프에 피펫 솔루션을 연결하는 실버 / 실버 염화물은 (Ag / AgCl을) 와이어 특정 홀더에 피펫을 배치합니다. 홀더는 미세 조작기에 연결해야합니다. 쥐의 목 근육 상에 Ag / AgCl 기준 전극을 배치했다. </li><li> 천천히 관심 영역까지 뇌 피펫 삽입 단계 및 전류에 응답하여 상품의 전압을 모니터링함으로써 저항을 확인. 필요한 경우 피펫을 취소 증폭기의 버튼을 버즈를 사용 (또는 보내 겠). </li><li> 개두술 뇌의 움직임을 줄이기 위해 실리콘 엘라스토머 또는 4 % 아가로 오스와 함께 취재에 앞서 (ECOG 또는 세포 내 전극을 만지지 않도록주의를) 건조 면봉 또는 합성 흡수 삼각형을 사용합니다. </li><li> 셀을 접근 할 때의 저항이 증가 할 때까지 2 μm의 단계 - 1의 피펫을 낮 춥니 다. 그런 다음 penetra하기 위해 증폭기의 잡음 기능을 사용신경 세포에 테. </li></ol> 3. 등전위 상태를 유도 <ol><li> 동시에 신경 세포의 막 전위의 ECOG 및 생리 변수를 모니터링하면서,이 단계에서 적절한 실험 프로토콜 (예를 들어, 응답을 소성하는 것은 세포 내로 주입하는 전류를 전류 - 전압 관계 감각 자극 응답)을 수행한다. </li><li> 세포 내 전극이 레코딩 세션에 걸쳐 막 잠재력과 행동 모두 잠재적 인 속성의 끈기를 분석하여 세포에 안정되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 다음 단계로 이동과 기록이 안정 될 때까지 다시 기다리거나 다른 신경 세포를 검색하지 않습니다. </li><li> 나트륨 펜 토바 비탈의 높지만 적외선 치사량 주사는 IP를 거쳐서 (~ / kg 90 mg을 상기 펜 토바 비탈 초기 조건에서 35 ㎎ / ㎏ 등 및 펜타닐의 초기 조건에서 155 ㎎ / ㎏까지 낮게 될 수있다). 참고 : 15 내 - 20 분 세포 내 및 ECOG 웨스턴 오스트 레일 리아veforms는 일시적으로 점진적으로 완벽한 등전위 상태로 붕괴되는, 37, 38 프로파일 소위 &quot;버스트 억제&quot;에 도달하는 간헐적 인 전기 침묵으로 느리게한다. 심장 박동이 크게 (~ 10 - 20 %) 속도가 느려집니다 것으로 예상되지만 SPO 2 ETCO 2는 상대적으로 안정 유지해야한다. </li><li> 등전위 상태에 도달하지 않은 경우, 펜토 바르 비탈 나트륨을 소량 주입 (~ 단계 3.1 용량의 10 %). 등전위 상태가 아직 달성되지 않은 경우 더 많은 마취제를 추가하기 전에 15 분을 기다립니다. </li><li> 기록 된 뉴런의 통합 특성의 네트워크 동력학의 효과를 비교하는 실험 프로토콜을 반복한다. 주 : 마취 주사를 중단 한 후, 전기 뇌 활동이 완전히 3-4 시간 내에 복구한다. </li><li> 실험의 끝에, 나트륨 펜 토바 비탈을 치사량 주사 하였다 (200 mg / kg, IP)을 래트를 안락사. </li></ol>

저자는 공개할 것이 없습니다.

우리는 여기에 네트워크 및 세포 수준에서 모두 생체 내 자연 뇌 전기 활동에 억제하는 새로운 방법을 설명합니다. 이 절차는 등전점 혼수 41라고도 극단적 뇌 상태로 이끈다. 보기의 임상 적 관점에서, 이러한 활동은 electrocerebral EEG에서 알 수있는 가장 심각한 이상이다. 그것은 주로 하나 죽어 또는 식물 인간 (42)에 지속적으로 환자와 비가역 혼수와 관련되어 있지만 (예를 들면 티 오펜 탈 등) 중앙 신경계 진정제 약물와 중독으로 인한 경우, 적어도 부분적으로 실수 저체온증 반전 될 수있다 (42) 또는 질식성 심정지 43. 우리 실험 패러다임에서, 등전위 상태는 점진적으로 먼저 급격히 ECOG 주파수 함량의 감소를 유도 고용량 나트륨 펜 토바 비탈의 전신 주입하는 &quot;버스트 억제&quot;모드에 의해 달성된다41, 42, 완전 평면 ECOG에 마지막으로 선도. 세포 내 수...

어떤 환경 적 자극 또는 행동 태스크가 없으면, 「휴식」뇌 뇌파 (EEG) 파 등의 두피에서 기록 될 수있는 전기적 활성도의 연속 스트림을 생성한다. 이 내인성 뇌 활동의 세포 내 상관 관계가 구 심성 네트워크 -1,2-의 지속적인 활성을 반영 흥분성 및 억제 성 시냅스 전위의 조합으로 구성되어있다 (또한 &quot;시냅스 잡음&quot;이라고도 함) 배경 막의 전압 변동을 특징으로한다. 이 자발적인 활동은 경계의 다른 국가와 주파수 및 진폭에 따라 다릅니다. 단일 뉴런의 흥분성 및 응답에 대한 네트워크 활동의 영향을 해명은 신경 과학 3,4의 주요 문제 중 하나이다. 많은 실험과 계산 연구는 통합 propertie에 지속적인 시냅스 활동의 기능에 미치는 영향을 살펴 보았다뉴런의의. 그러나, 배경 잡음의 영향 시냅스 다른 신경 파라미터의 역할은 애매 남아있다. 예를 들어, 막 탈분극의 평균 수준에 긍정적 또는 부정적 5,6- 7-9 활동 전위를 유발하는 감각 입력의 능력과 상관 밝혀졌다. 일부 연구는 심성 시냅스 입력의 연속적 변화 스트림으로 인한 막 전위의 변동이 강하게 그들의 입출력 관계 3,10-13의 이득을 조절하여 하나의 뉴런의 응답에 영향을주는 것을 제안하는 반면 또, 다른 것을 나타 분로 억제에 의해 매개되는 멤브레인 입력 컨덕턴스의 변화에 관계없이, 막 14,15 변동의 크기 신경 이득을 조절하기에 충분하다. 마지막으로, 웨이크 동물 수행 최근의 연구는 단일 신경 감각 정보의 처리는 매우 조심 (A)의 상태에 의존하는 방법을 강조차 현재의 행동 수요 16, 17. 고도로 상호 연결된 시스템에서 주어진 프로세스의 기능적 역할을 규명하기위한 간단한 전략은 부재 구체적 시스템의 기능을 변경하는 방법을 결정하는 것이다. 이 방법은 광범위의 실험 병변 또는 다른 뇌 영역 18-21 불 활성화 또는 특정 이온 채널 (22, 23)의 약리 봉쇄하여, 예를 들어 신경 과학 연구에 사용되었다. 특히, 기능적 연결성 및 네트워크 역학 단일 셀 계산 24-27에 미치는 영향을 발표 할 생체 내에서 적용되었습니다. 그러나, 현재까지 지역 조작은 신경 세포의 발사를 차단 및 / 또는 부분적으로 효과적 일 수있다 기본적인 생물 물리학 적 특성을 교란하기위한 상대적으로 작은 뇌 볼륨 (28)에 제한된다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 생체 실험 방법의 새로운 개발쥐은 전체 뇌 시냅스 활동 (29)의 완전한 억제 후 얻은 것과 특정 네트워크 동적에 포함 된 특정 뇌 상태에 기록 된 하나의 뉴런, 즉,의 전기 생리 특성을 비교합니다. 제어 상황에서, 두 개의 별개의 피질 역학이 생성 될 수있다. 슬립 등 electrocorticographic (ECOG) 패턴을 펜토 바르 비탈 나트륨의 적당한 용량의 주사에 의해 유도 하였다. 다른 방법으로, 깨어있는 상태 (깨어 같은 패턴)을 기본 대뇌 피질의 활동에 필적하는 작은 진폭의 빠른 ECOG 파도 펜타닐 주사에 의해 생성 될 수있다. 동일한 ECOG 세포 내 기록을 유지해서, 내생 뇌 전기 활동의 완전한 침묵은 등전점 ECOG 및 세포 활동 특징 나트륨 펜 토바 비탈의 높은 투여 량의 전신 주입에 의해 수득 하였다. 이러한 극단적 인 혼수의 유도는 잠재적으로 치명적인 consequen을 가질 수 있기 때문에생물학적 기능에 CES는 생리적 변수의 신중하고 지속적인 모니터링이 필수적이었다. 따라서, 우리는 꼼꼼하게 실험을 통해 심장 박동 주파수, 최종 갯벌 CO 2 농도 (ETCO 2) O (2) 포화 (SPO 2)와 쥐의 핵심 온도를 하였다. 우리는 생체 내에서 길고 안정적인 녹음에 특히 적합하다 날카로운 미소 전극을 사용하여 이러한 여러 가지 상태 중 하나의 신경 세포 특성을 평가한다. 여기에 설명 된 절차는, 다른 전기 생리와 촬상 방법과 결합 될 수 있고, 다른 동물 모델로 확장 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>나트륨 펜토바르비탈</td><td>센트라벳</td><td>펜토바르비탈</td><td></td></tr><tr><td>케타민 500</td><td>Merial</td><td>Imalg&egrave; ne 500</td><td></td></tr><tr><td>펜타닐&nbsp;</td><td>Janssen-Cilag</td><td>Fentanyl</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine</td><td>Centravet</td><td>Xylovet</td><td></td></tr><tr><td>Gallamine triethiodide</td><td>Sigma</td><td>G8134</td><td></td></tr><tr><td>ECoG 증폭기</td><td>A-M Systems</td><td>AC 증폭기, 모델 1700</td><td></td></tr><tr><td>세포 내 증폭기</td><td>Molecular Devices</td><td>Axoclamp 900A</td><td></td></tr><tr><td>데이터 수집 인터페이스</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>CED 전원 1401-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td>Spike2 버전 7</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>Scientifica</td><td>IVM-3000</td><td></td></tr><tr><td>모세관 풀러</td><td>Narishige</td><td>PE-2</td><td></td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150F-10</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire 0.125 mm (intracellular recording)</td><td>WPI</td><td>AGT0525</td><td></td></tr><tr><td>Ag-AgCl 참조</td><td>Phymep</td><td>E242</td><td></td></tr><tr><td>Silver wire 0.25mm(ECoG 기록)</td><td>WPI</td><td>AGT1025</td><td></td></tr><tr><td>인공 호흡 시스템</td><td>Minerve</td><td>Alpha Lab</td><td></td></tr><tr><td>생리학적 매개변수 모니터링</td><td>Digicare</td><td>LifeWindow Lite</td><td></td></tr><tr><td>난방 담요</td><td>Harvard Apparatus</td><td>507215</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>FST</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>펜치 Dumont #5</td><td>FST</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>펜치 Dumont #5SF</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>IP 폴리우레탄 카테터 - 0.43x0.69 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Instech</td><td>BTPU-027</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토미어</td><td>WPI</td><td>KWIK-CAST</td><td></td></tr><tr><td>치과 드릴</td><td>NSK</td><td>Y1001151 및 P496</td><td></td></tr><tr><td>외과용 접착제</td><td>3M</td><td>vetbond</td><td></td></tr></tbody></table>

등전위 뇌 상태의 유도는 신경 흥분에 내생 시냅스 활동의 영향을 조사하기<em&gt; 생체</em

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

방법 뉴런 프로세스 정보는 고유 막 성질과 심성 시냅스 네트워크의 역학에 모두 의존한다. 강하게 각성 상태의 함수로서 변화 특히 내생 적으로 생성 된 네트워크 활동에 크게 신경 계산을 변조한다. 자발적 뇌 역학 단일 뉴런 &#39;통합 특성에 영향을 얼마나 다른지 조사하기 위하여, 우리는 나트륨 펜토 바르 비탈의 고용량의 전신 주사에 의해 생체 내에서 모든 뇌 활성을 억제 이루어진 래트에서 새로운 실험 전략을 개발했다. 연속적으로 결합 electrocorticogram (ECOG)와 세포 내 기록에 의해 모니터링 대뇌 피질의 활동은 점차 안정 등전점 프로필로 이어지는 둔화된다. 깊은 혼수에 래트를 넣고이 극단적 뇌 상태는 신중 걸쳐 실험 동물의 생리 학적 상수를 측정하여 모니터링 하였다. 세포 내 연구ecordings은 우리의 특성 및 수면 - 각성주기에서 발생하는 것과 같은 생리 학적으로 관련된 대뇌 피질의 역학에 포함 동일한 신경 세포의 통합 특성을 비교하도록 허용하고, 뇌는 완전히 침묵 할 때.

유도 및 등전점 뇌 상태를 유지하는 것은 생체 실험 절차의 섬세한이다. 그것은 바로 신경 세포의 흥분과 전달 함수 (29)에 대뇌 피질의 네트워크 활동의 영향을 연구 할 수있는 강력한 도구로 입증되었다. 그림 1 (그림 1A 전에 동물의 생리 학적 상태의 ECOG 및 중요한 상수를 포함하는 다중 매개 변수 감시를 보여줍니다 등전위 상태)과 후 (그림 1B) 유도. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53576/53576fig1.jpg" /> 제어 및 등전 조건의 생리 학적 매개 변수 1. 모니터링 그림. ...

이 절차는 등전점 뇌 상태의 결과, 생리 학적으로 관련된 뇌 상태 동안 지속적인 전기 활동의 완전한 폐지 후 하나의 뉴런에서 오래 지속되는 생체 세포 내 녹음을 수행한다. 동물의 생리적 상수는 조심스럽게 인공 혼수 상태로 전환하는 동안 모니터링됩니다.

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 시냅스 입력이 없는 상태에서 단일 뉴런의 통합적 특성을 연구하기 위해 생체 내(in vivo)에서 뇌의 전반적인 비활성 상태를 유도하는 것입니다. 여기서 제시하는 방법은 네트워크 활동이 단일 세포의 연산에 미치는 영향을 평가하거나 혼수상태에서 뉴런의 반응성을 연구하는 것과 같은 신경생리학의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 손상되지 않은 생체 내 표본에서 네트워크와 분리된 상태로 뉴런의 특성을 연구할 수 있다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 완전히 마취된 쥐를 가열 패드 위에 놓으십시오. 심부 체온을 약 37 °C로 유지하기 위해 동물의 직장에 프로브를 삽입합니다. 이후 마취제의 주입을 용이하게 하기 위해 복강 내에 카테터를 배치하려면, 먼저 제모 크림을 사용하여 복부의 우하단 또는 좌하단 소부위의 털을 제거하십시오.국소 마취제를 주입한 후, 수술 부위를 멸균하고 날카로운 가위를 사용하여 피부에 2~3mm 크기의 절개를 가합니다. 뭉툭한 가위를 사용하여 복강이 보일 때까지 지방층과 근육층을 제거합니다. 그런 다음 작은 카테터를 복강 내로 약 1~2cm 정도 삽입하고, 수술용 접착제로 상처 부위를 봉합합니다.루프를 만들어 카테터를 피부에 봉합하여 제자리에 고정합니다. 인공호흡 중 환기를 조절하기 위해 기관 튜브를 삽입하려면, 털을 제거하고 해당 부위를 소독한 후 흉골병 바로 위의 기관 피부를 절개합니다. 첫 번째 지방층과 근육층을 둔성 박리합니다.타액선을 옆으로 밀어내고 마지막 근육층을 조심스럽게 박리하여 기관을 노출시킵니다. 소형 핀셋을 사용하여 기관을 조심스럽게 분리한 뒤, 기관 아래로 실을 밀어 넣습니다. 그다지 꽉 조이지 않게 실로 외과용 매듭을 만듭니다.두 개의 연골 고리 사이에서 기관을 횡단으로 절개합니다. 다음으로, 적절한 직경의 기관 튜브를 삽입하고 실의 매듭을 조여 튜브를 고정합니다. 추가적인 안정성을 위해, 실을 기관 튜브의 더 높은 지점에 추가로 부착할 수 있습니다.봉합사나 외과용 스테이플러를 사용하여 상처 부위를 폐쇄합니다. 그 후, 동물을 정위 고정 틀로 옮기고 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 그런 다음 심전도, 혈중 산소 포화도 및 호기말 이산화탄소 분압과 같은 생리학적 변수를 모니터링하기 위해 적절한 프로브를 배치합니다.그 후, 두피의 털을 제거하고 수술 부위를 멸균합니다. 메스를 사용하여 2 cm 길이로 종절개하고 두개골 위의 결합 조직을 절제합니다. 그런 다음 두개골과 조직에 수술용 접착제를 도포하여 준비물을 고정합니다.그런 다음 치과용 드릴을 사용하여 관심 영역 위에 직경 1.5 millimeter의 작은 개두술을 시행합니다. 이후 초미세 핀셋과 정맥 가위를 사용하여 경막에 작은 구멍을 조심스럽게 냅니다. 피질전도 전극을 배치하기 위해 두개골 천공 부위 내에 0.5 millimeter 영역을 남겨둡니다.0.9% sodium chloride 용액 또는 aCSF를 사용하여 피질을 촉촉하게 유지하십시오. 다음으로, 대조측 두피 근육에 참조 전극을 배치하고, 경막 위에 저임피던스 피질전도 전극을 배치하십시오. 호흡 빈도와량이 쥐의 자발적 호흡과 유사하도록 인공 환기 시스템을 조정하십시오.모든 생리학적 변수와 전기피질도 패턴이 정상 범위 내에 있다면, 동물을 마비시키기 위해 각 다리에 gallamine triethiodide를 주입하십시오. 그런 다음 기관 튜브에 기계 환기 장치를 연결하고 양측 흉곽이 적절하게 팽창하는지 확인하십시오. 이 단계에서 팁 크기가 0.2 µm인 유리 미세피펫을 뽑아 2 M potassium acetate 용액으로 채우십시오.피펫을 은/염화은(silver/silver chloride) 와이어가 있는 전용 홀더에 고정하여 피펫 용액을 세포 내 증폭기(intracellular amplifier)에 연결합니다. 그다음 쥐의 목 근육에 은/염화은 기준 전극을 배치합니다. 피펫을 관심 영역 위에 위치시킵니다.필요한 경우 앰플리파이어의 buzz 버튼을 사용하여 피펫 내부를 비우면서, 피펫을 뇌의 원하는 깊이까지 천천히 삽입합니다. 앰플리파이어의 브리지 회로를 사용하여 전류 단계에 따른 전압 강하를 0으로 맞춤으로써 피펫 저항을 보정합니다. 다음으로, 면봉이나 합성 흡수 삼각형을 사용하여 개두 부위를 건조시키고, 뇌의 움직임을 줄이기 위해 실리콘 엘라스토머 또는 4% agarose로 덮어줍니다.그 후, 세포에 접근할 때 저항이 증가할 때까지 피펫을 1~2 µm 단계로 내립니다. 앰플리파이어의 buzz 기능을 사용하여 뉴런 내부로 진입합니다. 기록이 안정되면, 뉴런에 소량의 전류 단계를 주입하면서 bridge 파라미터를 조정하여 전극 저항을 보정합니다.그런 다음, 뉴런의 내재적 특성을 추출하기 위해 세포 내로 전류를 주입하거나 감각 자극을 수행하는 등 적절한 실험 프로토콜을 실시합니다. 다음으로, 복강 내 라인을 통해 고용량이지만 치사량 미만의 sodium pentobarbital을 주입합니다. 15~20분 이내에 세포 내 및 피질 전도 활동이 느려지며 간헐적인 전기적 침묵이 나타나 소위 burst suppression 프로파일에 일시적으로 도달하게 되며, 이는 점차 완전히 등전위 상태(isoelectric state)로 붕괴됩니다.심박수는 상당히 느려지지만 SPO2와 EtCO2는 비교적 일정하게 유지될 것으로 예상됩니다. 그런 다음 자극 프로토콜을 반복하여 네트워크 역학이 기록된 뉴런의 통합적 특성에 미치는 영향을 비교합니다. 마취제 주입이 중단된 후, 뇌의 전기적 활동은 3~4시간 이내에 완전히 회복되어야 합니다.이 그림은 수면 초기 단계 또는 깨어 있는 동안 내인성으로 생성되는 피질 역동성을 모방하여, 두 가지 마취 조건에서의 자발적인 세포 내 및 전피질전도(electrocorticogram) 활동을 보여줍니다. 수면 유사 상태는 sodium pentobarbital 주입으로 유도되며, 각성 유사 상태는 fentanyl로 유도됩니다. 두 경우 모두, 이후 고용량의 sodium pentobarbital를 주입하면 ECOG와 동시에 기록된 뉴런에서 자발적인 활동이 완전히 소실되었으며, 이를 등전위(isoelectric) 상태라고 합니다.지속적인 시냅스 활동을 억제한 결과, 뉴런 막 전위의 유의미한 과분극이 유도되었습니다. 등전위 상태 유도 전후로 전류 유발 반응을 생성할 수 있습니다. 이를 통해 강도가 증가하는 단계적 전류 자극에 대한 주요 유발 발화율로 표현되는 뉴런의 입력-출력 전달 함수에 미치는 서로 다른 뇌 활동의 영향을 비교할 수 있습니다.본 실험 절차를 수행할 때, 신뢰할 수 있는 뇌 역동성과 관련된 고품질의 기록을 얻기 위해 동물을 최적의 생리학적 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 이 접근법은 가역적 또는 비가역적 심수면 상태에서 뉴런의 반응성을 연구하기 위한 모델로 추가 활용될 수 있습니다.

induction-an-isoelectric-brain-state-to-investigate-impact-endogenous

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 끝이 가는 유리 마이크로피펫과 특수 설정을 사용하여 단일 뇌 뉴런의 전기 신호를 기록하는 방법을 보여줍니다. 마이크로피펫은 쥐의 뇌에 조심스럽게 삽입되고 윙윙거리며 뉴런을 관통하여 내부 뉴런 전기 신호를 기록합니다.

단일 뉴런(single neuroron)에서 세포 내 신호의 생체 내 기록(In vivo recording of intracellular signals from a single neuroron)

연구에 따르면 음극 경두개 직류 자극은 약물 내성 발작을 억제하는 효과를 낼 수 있습니다. 본 연구에서는 생쥐의 뇌 절편 제제에서 직류 자극 및 발작과 같은 활동의 다전극 어레이 기록을 평가하는 시험관 실험 설정을 고안했습니다. 직류 자극 매개변수를 평가했습니다.

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

깨어 있는 쥐의 기록 부위 부근에서 세포 외 신경 활동을 동시에 기록하고 여러 신경 활성 물질을 방출하는 전극 구성 방법을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 관심 있는 뉴런에 대한 추정 국소 시냅스 입력값을 자세히 분석할 수 있습니다.

깨어 마우스의 신경 활성 물질의 Microiontophoretic 응용 프로그램과 결합하여 신경 활동의 세포 외 기록

이 연구에서 방법론은 우레탄 마취하에 hyperdirect 통로에서 다중 부위 생체 내 생리 학적 기록을 수행하는 방법에 대해 제시됩니다.

심각한<em&gt; In Vivo</em&gt; 마취 된 래트에서의 Hyperdirect 경로로부터의 국소 장 전위 및 다중 단위 활성의 전기 생리 학적 기록

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녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

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Inducing Long-Term Plasticity of Intrinsic Neuronal Excitability in Neurons of the Dorsal Lateral Geniculate Nucleus

학습하세요 등전위 뇌 상태 유도를 통해 생체 내 단일 뉴런의 통합 특성을 시냅스 입력 없이 연구하는 방법을. 이 기술은 신경 생리학에서 네트워크 활동이 단일 세포 계산에 미치는 영향을 평가하는 데 활용됩니다.

등전위 뇌 상태의 유도는 신경 흥분에 내생 시냅스 활동의 영향을 조사하기

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