세 가지 차원 생체 모방 기술 ​​: 소설 Biorubber는 콜라겐 하이드로 겔에 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 정의 작성합니다

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생체 내 조직의 구조적 특징, 구성 및 기계적 특성과 유사할 수 있는 3차원 콜라겐 골격을 엔지니어링하는 것입니다. 이 방법은 ECM 세포 상호 작용, 조작된 조직 생성에 대한 구조적 특징의 영향, 조직 대체 개발 등과 같은 조직 공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생분해성 재료에서 높은 충실도로 내부 유동 채널 및 경로의 미세 형상을 다시 요약할 수 있는 실행 가능한 절차를 제공한다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 후 연구원인 Veronica Rodriguez-Rivera입니다. BSA 고무를 준비하는 데 사용되는 재료는 BSA 고무가 조기에 굳지 않도록 사용할 준비가 될 때까지 보관하고 차갑게 유지해야 합니다. 무균 상태도 이 절차에서 매우 중요합니다.

먼저 디스펜서를 살균합니다. 비세포 배양 후드에 O 링, 주사기, 캡, 믹스 팁 및 4:1 디스펜서를 배치합니다. 이러한 물질을 30분 동안 UV 살균합니다.

먼저 두 개의 스테인리스 스틸 몰드 조각을 함께 조이고 Luer 잠금 장치를 부착합니다. 디스펜서를 조립하기 전에 피펫과 시약을 후드에 도입하기 전에 70% 에탄올을 분사하십시오. 먼저 팁 캡을 용액 홀더에 부착합니다.

다음으로, 30%BSA 용액을 다른 챔버를 오염시키지 않고 더 큰 챔버에 로드합니다. O 링을 부착할 수 있는 충분한 공간을 남겨 두십시오. 그런 다음 더 작은 디스펜서 챔버에 3%의 글루타르알데히드를 로드하고 다른 O 링을 부착합니다.

이제 주사기를 디스펜서에 부착합니다. 그런 다음 캡이 맨 위에 오도록 어셈블리를 기울이고 캡을 믹싱 팁으로 교체합니다. 그런 다음 측면을 부드럽게 두드려 기포가 위쪽으로 이동할 수 있도록 합니다.

다음으로, 배기 용액을 담을 수 있도록 오토클레이브 백 내부에 디스펜서를 놓습니다. 디스펜서를 똑바로 세운 상태에서 주사기에서 모든 공기를 제거하기 위해 소량의 용액을 가방에 분배합니다. 공기를 제거하는 것은 매우 중요합니다.

그런 다음 스테인리스 스틸 Y 몰드의 Luer 잠금 장치를 주사기 팁에 빠르게 부착합니다. 이제 주로 사용하지 않는 손에 금형을 들고 배출 채널의 왼쪽과 오른쪽 배기구로 배출 용액을 번갈아 가며 넣습니다. 배기 가스를 눌러 내부 공극을 용액으로 채웁니다.

그런 다음 금형을 수평으로 놓고 디스펜서 부피의 절반이 사용될 때까지 더 많은 용액을 주입합니다. 이제 곰팡이를 접시에 넣고 파라필름으로 싸서 섭씨 4도에서 밤새 보관해야 합니다. 이 절차는 산성화된 콜라겐 4g으로 조정됩니다.

사용할 때까지 차갑게 보관하십시오. 콜라겐에 가중치를 부여한 후 감마선으로 용액을 살균합니다. 준비시 물에 신선한 0.2 일반 HEPES 용액을 만드십시오.

그런 다음 내용물을 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 농축 수산화나트륨을 사용하여 pH를 9로 조정합니다. 후드를 UV 살균하고 집게, 주걱 및 메스를 고압 멸균하십시오.

후드에서 1.5 밀리리터의 HEPES 용액과 1.5 밀리리터의 10x MEM을 혼합합니다. 이 혼합물을 얼음에 보관하십시오. 또한 12웰 플레이트와 20ml 주사기를 냉동실에서 10분 동안 식힙니다.

추가 멸균을 위해 70% 에탄올과 관련된 튜브와 플레이트를 후드에 넣기 전에 스프레이하십시오. 몰드 플레이트를 스프레이하고 후드에 놓습니다. 그런 다음 집게로 BSA 고무 몰드를 제거합니다.

그런 다음 메스를 사용하여 금형에서 배기 채널을 잘라냅니다. 다음으로, HEPES-MEM 혼합물을 간단히 와류로 만들고 콜라겐에 1 밀리리터를 첨가합니다. 그런 다음 용액을 멸균 주걱으로 완전히 혼합하십시오.

잠시 소용돌이를 일으킨 다음 용액을 차가운 20ml 주사기로 빠르게 옮깁니다. 이제 웰 내부에 BSA 고무를 고정하면서 콜라겐 하이드로겔 용액의 절반을 웰 바닥에 분배합니다. 다음으로, 핀셋을 사용하여 고무 유입 및 유출 끝이 우물의 벽에 닿도록 금형을 배치합니다.

그런 다음 콜라겐 하이드로겔로 곰팡이를 덮습니다. 이제 파라필름으로 우물을 밀봉하고 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 콜라겐이 중합될 때까지 1시간 동안 기다립니다.

이 시간 동안 후드의 자외선을 켜 두십시오. 또한 UV 가교 장치를 평방 센티미터당 630, 000마이크로줄을 제공하도록 설정합니다. 이제 장갑을 낀 손에 70% 에탄올을 뿌리고 콜라겐으로 덮인 곰팡이가 있는 플레이트를 가교제에 넣고 조사 과정을 시작합니다.

조사 후 장갑을 다시 분사하고 가교제에서 플레이트를 내립니다. 그런 다음 멸균 주걱을 사용하여 웰에서 젤을 제거하고 뒤집은 다음 하이드로겔 바닥을 가교합니다. 최종 가교 주기 후 효소 분해를 진행합니다.

콜라겐 골격을 방해하지 않고 BSA 고무를 제거하려면 pH 7.8에서 멸균 0.25% 트립신 용액을 사용하고 0.20미크론 필터를 통해 누릅니다. 여과된 트립신 용액을 새 50ml 원추형 튜브에 충분히 옮깁니다. 그런 다음 콜라겐 하이드로겔을 효소 용액이 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

하이드로겔이 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 약 1분 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 그런 다음 섭씨 30도에서 튜브를 배양하고 15-24시간 동안 소화를 계속합니다.

처음 4시간 동안은 15-30분마다 튜브를 제거하고 부드럽게 소용돌이치면 BSA 고무 소화가 완료됩니다. 다음 날, 용액에 고무가 뜨지 않거나 하이드로겔에 분해된 고무 조각이 없으면 분해가 완료된 것으로 간주됩니다. 이제 트립신 용액을 멸균 Mosconas 용액으로 교체하고 튜브를 섭씨 4도에서 30분 동안 흔듭니다.

나중에 Mosconas 용액을 흡인하고 이 단계를 두 번 더 반복하여 콜라겐 골격을 완전히 청소합니다. 바이오 고무의 사용을 최적화하기 위해 광범위한 테스트가 사용되었으며 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 최적화된 프로토콜과 3개의 고체 몰드 피스를 사용하여 콜라겐 하이드로겔을 제작하고 자세히 검사했습니다.

필요한 Y 금형은 Microlution 기계에서 제작되었습니다. Y 주형에 30%의 BSA와 3%의 글루타르알데히드를 주입하여 섭씨 4도에서 하룻밤 사이에 반응시켰습니다. 다음으로, BSA 고무를 콜라겐으로 주조하고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 가열했습니다.

고무는 15시간 동안 효소로 소화되어 콜라겐 하이드로겔의 기하학에 영향을 주지 않고 떨어질 정도로 약화되었습니다. 주형에 의해 주조된 4mm 유입 채널은 캘리퍼로 측정하여 콜라겐 하이드로겔에서 정확히 4mm가 되도록 했습니다. 금형의 안정성을 테스트한 결과, 300미크론 정도의 작은 치수도 안정적으로 엔지니어링할 수 있는 것으로 나타났습니다.

또한, Mosconas 세척 후 잔류 글루타르알데히드에 대해 골격을 테스트한 결과 잔류물이 발견되지 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 생체 내 형상을 모방할 수 있는 3D 콜라겐 스캐폴드를 제작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라, 생체 내 조직의 3D 모델을 생성하고 특정 구조적 특징을 가진 금형을 제작하는 것과 같은 이 기술을 보완하는 다른 방법을 수행하여 추가 질문에 답할 수 있습니다.

개발 후 이 기술은 조직 공학 분야의 연구자들이 내부 구조적 특징과 매트릭스 구성 요소와 세포의 체외 모델 간의 상호 작용을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.