Name: 염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 학습하세요 염증된 피부에서 CD4 T 세포 역학을 비침습적으로 이미징하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 T 세포 이동성 메커니즘을 생체 내에서 연구하는 데 활용됩니다.

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저자는 라이브 영상에 대한 도움말은 로체스터 다중 광자 현미경의 핵심 시설의 대학 감사합니다. DJF에 NIH AI072690 및 AI02851에서 지원; MGO에 AG 및 AI089079에 AI114036.

저자는 공개 아무것도 없어.

의미 여기에서 우리는 그대로 마우스 귀 진피에 전달, 항원 특이 이펙터 Th1 세포의 4D 시각화를위한 완벽한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 여러 가지 이유로 몇몇 현재 영상 방식에 비해 많은 장점을 제공한다. 복부 귀 진피 촬상함으로써 다른 피부 부위를 포함하는 촬상 프로토콜이 필요 제모를 포기 할 수있다. 제모 일반적으로 온화하지만, 이들은 피부 장벽 (42)에 대한 면역 반응을 자극 할 수 43,44 프로세스를 중단을 야기하는 것으로 나타났다. 또한 진피 또는 피하을 노출 침습 수술 절차를 피함으로써,이 프로토콜은 손상에 의한 염증과 진피로 호중구 (37) 및 다른 면역 세포의 빠른 채용을 방지 할 수 있습니다. 키 분자에 대하여 차단하는 항체를 제공하기이 시스템에 정맥 카테터의 사용은 다이나 실시간 심문 허용CD4 T 세포의 마이크 동작. 이 촬상 프로토콜의 사용은 ...

CD4 T 세포의 효과기 기능은 다양한 말초 조직에 빠르게 들어가 횡단하여 손상을 조사하거나, 감염 병소를 찾거나, 만성 감염 또는 자가면역으로 인한 병리를 유발하는 능력에 결정적으로 의존합니다. 염증이 있는 부위1-4로의 귀환 과정과 혈관 구조에서 조직으로의 유출5-7은 잘 규명되었지만, T 세포의 간질 운동성을 유도하고 조절하는 요인은 정의되지 않았습니다. 복잡한 3D 환경에서 T 세포의 이동은 인공 매트릭스8-10 또는 미세유체 장치(11,12)를 사용하여 시험관 내에서 연구되었지만, 이는 생체 내 시스템의 복잡하고 역동적인 환경을 요약하지 못합니다. 최근에야 고해상도 다색 생체 내 이미징의 출현으로 현장에서 면역 세포의 동적 행동을 연구할 수 있게 되어 온전한 면역 반응을 더 잘 이해할 수 있게 되었습니다.
10여 년 전, 면역학적 질문을 해결하기 위해 다광자 현미경을 처음으로 활용한 몇 가지 영향력 있는 연구가 발표되었습니다. 초기 연구는 이식된 림프 기관 내 면역 세포의 행동에 초점을 맞췄고,13-16 마취된 마우스에서 노출된 림프절을 이미지화하는 기술이 곧 뒤따랐습니다17. 이미징을 통해 T 세포18의 림프절 프라이밍 단계, T 세포가 2차 림프 기관에서 이동하는 메커니즘19, T 세포와 다른 면역 세포20, 21 및 림프절22 내 동적 T 세포 위치에 대한 새로운 근본적인 관찰이 가능했습니다. 초기의 많은 연구가 림프절 역학에 초점을 맞췄지만, 그 이후로 생체 내 영상은 뇌23-25, 간26, 폐27, 피부28-30을 포함한 많은 말초 조직의 면역 반응을 영상화하는 데 활용되었습니다. 
쥐의 귀 진피는 귀 피부가 얇고, 털이 상대적으로 적으며, 호흡 운동으로부터 쉽게 분리될 수 있기 때문에 이미징에 특히 적합합니다31. 실제로, 귀 진피는 수지상 세포 32,33, T 세포28,29,34,35 및 호중구36,37의 간질 거동을 이미지화하는 데 사용되어 왔으며 피부 염증을 연구하기 위한 잘 정립된 사이트입니다. 점점 더 많은 비침습적 시술이 국소 염증 환경에 변화를 유도할 수 있는 갈라진 진피38,39, 옆구리39,40 또는 등쪽 피부 피판창39,41 모델을 포함한 피부의 외과적 제제를 대체하고 있습니다. 이식된 in vitro-primed, 항원 특이적 CD4 effector T 세포의 사용은 피부 염증 반응의 맥락에서 균질한 세포 집단에 대한 연구를 가능하게 합니다30. 여기에서는 염증이 있는 마우스 귀의 진피 간질에서 항원 특이적 효과기 CD4 T 세포를 시각화할 수 있는 비침습적 이미징 절차와 정맥 카테터를 통해 차단 항체를 도입하여 이러한 세포를 실시간으로 조작할 수 있는 기능에 대해 설명합니다. 우리는 이 모델이 진피에서 CD4 T 세포의 움직임을 추적하고 이러한 운동성을 제어하는 메커니즘을 쿼리하는 데 효과적임을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000651</td><td>사용된 마우스는 사내에서 사육</td></tr>되었습니다 <tr><td>DO11.10 마우스</td><td>Jackson Laboratories</td><td>003303</td><td>사용된 마우스는 사내에서 사육되었습니다</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>10-013-CV</td><td>Multiple Equivalent</td></tr><tr><td>Newborn Calf Serum (NCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SH30118.03</td><td>56 &deg에서 열 비활성화; C 30분 동안</td></tr><tr><td>기니피그 보충</td><td>Cedarlane</td><td>CL-5000</td><td></td></tr><tr><td>항-CD8 항체</td><td>ATCC</td><td>3.155 (ATCC TIB-211)</td><td>이 하이브리도마</td></tr><tr><td>항-MHC 클래스 II 항체</td><td>ATCC</td><td>M5/114.15.2 (ATCC TIB-120)</td><td>에서 유래한 항체 이 하이브리도마</td></tr><tr><td>항-CD24 항체</td><td>ATCC</td><td>J11d.2 (ATCC TIB-183)</td><td>에서 유래한 항체다음에서 유래한 항체&nbsp; 이 하이브리도마</td></tr><tr><td>anti-Thy1.2 항체</td><td>ATCC</td><td>J1j.10 (ATCC TIB-184)</td><td>항체 유래&nbsp; 이 하이브리도마</td></tr><tr><td>Ficoll (Fico/Lite-LM)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>I40650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>21-040-CV</td><td>Multiple Equivalent</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>15323591</td><td></td></tr><tr><td>biotinylated anti-CD62L 항체 (클론 MEL-14)</td><td>BD</td><td></td><td></td>553149</tr><tr><td>스트렙타비딘 자기 분리 비드</td><td>Miltenyi</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 분리 컬럼</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스 IL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>항-IFNg 항체 (클론 XMG 1.2)</td><td>eBioscience</td><td>16-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>항-IL-4 항체 (클론 11b11)</td><td>eBioscience</td><td>16-7041-85</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>VWR</td><td>45000-412</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>피셔</td><td>15303641</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>피셔</td><td>15323671</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>오브알부민 펩타이드</td><td>바이오펩타이드</td><td></td><td>ISQAVHAAHAEINEAGR-OH 펩타이드</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>Thermo/HyClone</td><td>SV30014.03</td><td>56°C에서 열 비활성화; C 30분 동안</td></tr><tr><td>24-웰 배양 플레이트</td><td>LPS</td><td>3526</td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 인슐린 주사기, 1ml</td><td>BD</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>28 G1/2 인슐린 주사기, 300&mu; l</td><td>BD</td><td>309301</td><td></td></tr><tr><td>27 G1 / 2 TB 주사기, 1ml</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>30 G1 / 2 바늘</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 의료 튜브 BD</td><td></td><td>427400</td><td></td></tr><tr><td>시아 노 아크릴 레이트 수의학 접착제 (Vetbond)</td> <td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>가열판</td><td>WPI</td><td>61830</td><td></td></tr><tr><td>가열판 컨트롤러</td><td>WPI</td><td>ATC-2000</td><td></td></tr><tr><td>물 담요 컨트롤러</td><td>Gaymar</td><td>TP500</td><td>더 이상 생산되지 않음, 더 새로운 동등한 사용 가능한</td></tr><tr><td>물 담요</td><td>Kent Scientific</td><td>TP3E</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>LEI Medical</td><td>Isotec 4</td><td>더 이상 생산되지 않음, 더 새로운 동등한 사용 가능한</td></tr><tr><td>이소 플루란</td><td>Henry Schein</td><td></td><td>수의사를 통해 주문 직원</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>의료 테이프</td><td>3M</td><td>1538-0</td><td></td></tr><tr><td>이소 플루란 노즈 콘</td><td></td><td></td><td>사내 내장, 그림 2</td></tr><tr><td>이미징 플랫폼</td><td></td><td></td> 참조 사<td>내 내장, 그림 2</td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>WPI</td><td>15915-G</td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>가위</td> <td>참조Roboz</td><td>RS-6802</td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>VWR</td><td></td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Fisher</td><td>146355D</td><td></td></tr><tr><td>면봉</td><td></td><td></td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>섬세한 작업 와이프</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>다중 등가</td></tr><tr><td>Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 정립 현미경 (분광 물리학 포함) MaiTai HP DeepSee Ti:Sa 레이저</td><td>Olympus</td><td></td><td>견적 요청</td></tr><tr><td>진동 제어 기능이 있는 광학 테이블</td><td>Newport</td><td></td><td>요청</td></tr><tr><td>견적 25x NA 1.05 다광자 이미징을 위한 침수 대물</td>렌즈 <td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>대물 히터</td><td>Bioptechs</td><td>PN 150815</td><td></td></tr><tr><td>감지 필터 큐브</td><td>Olympus</td><td>FV10-MRVGR/XR</td><td>독점 큐브, 개별 필터/이색성</td></tr><tr><td>anti-integrin &beta에서 근사화할 수 있습니다. 1 항체 (클론 hMb1-1)</td><td>eBioscience</td><td>16-0291-85</td><td>Azide free, low endotoxin</td></tr><tr><td>anti-integrin &beta; 3 항체 (clone 2C9. G3)</td><td>eBioscience</td><td>16-0611-82</td><td>아지드 무함유, 저내독소</td></tr><tr><td>텍사스 레드 덱스트란(70,000MW)</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td></td></tr></tbody></table>

염증이 진피의 이미징 cd4 t 세포 간질 마이그레이션

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

이펙터 기능을 수행하는 CD4 T 세포의 능력은 같은 아직 정의되지 않은 메카니즘을 통해 염증 말초 조직에서 이들 세포를 신속하고 효율적인 이동에 의존한다. 면역계 연구에 다 광자 현미경의 적용은 그대로 조직 내 면역 반응의 동역학을 측정하는 도구를 제공한다. 여기에서 우리는 염증 마우스 귀 진피에 CD4 T 세포의 비 침습적 생체 내에 광자 이미징을위한 프로토콜을 제시한다. 맞춤 이미징 플랫폼을 이용하여 정맥 카테터 운동성에 관여하는 중요한 분자 성분에 대한 항체를 차단의 추가를 통해 실시간으로 이러한 세포를 심문하는 기능, 진피 간질에서 CD4 T 세포 역학 시각화 가능하다. 이 시스템은 체외 모델과 외과 적 침습 이미징 절차 둘다 장점을 제공한다. 운동에 대한 CD4 T 세포에 의해 사용되는 경로를 이해하는 것은 궁극적으로 BASI에 대한 통찰력을 제공 할 수있다C의 CD4 T 세포의 기능뿐만 아니라 만성 감염에서 양자 면역 질환의 발병 기전 및 병리.

면역 환경 변화없이 제자리에서 면역 반응을 연구 할 수있는 능력은 염증 조직으로 T 이펙터 세포의 실시간 상호 작용을 연구하는데 필수적이다. 도 1A 및 B에 요약 된이 프로토콜에 의해 그대로 이어 진피 이미징, 진피 간질 양도 형광 표지 T 이펙터 세포의 시각화를 허용한다. 이것은 고해상도 (도 1C) 및 저속 (도 1D, 영화 1) 염증 진피 이펙터 T 세포 역학 이미지 모두를 허용한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53585/53585fig1.jpg" /> 도 1 고해상도 및 손상 피부 간질에서 이펙터 T 세포 4D 촬상.</...

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

본 이미징 프로토콜의 전반적인 목표는 염증이 발생한 피부 내 CD4 양성 T 세포의 역동성을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 염증성 조직에서 면역 세포의 운동성과 기능의 기초가 되는 메커니즘은 무엇인가와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 CD4 T 세포의 역동적 행동을 In Situ에서 연구할 수 있는 최소 침습적 방법을 제공한다는 점입니다.귀를 촬영하기 위해 준비하는 단계는 습득하기 어렵고, 고품질의 이미지를 캡처하려면 귀의 적절한 위치 선정이 필수적이므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 저는 대학원생 Alison Gaylo이며, 이 프로토콜의 시연을 진행하겠습니다. 먼저 마우스당 300 µL의 형광 표지 effector T cell 현탁액을 27.5G 바늘이 장착된 주사기로 흡입하십시오.그 후 시린지의 바늘 쪽을 위로 향하게 하고, 플런저를 필요에 따라 위아래로 움직이며 시린지 몸통을 가볍게 튕겨 기포를 제거합니다. 세포가 준비되면 생쥐를 깨끗한 케이지로 옮기고, 꼬리 정맥이 확장될 때까지 가열 램프 아래에 둡니다. 그런 다음 첫 번째 생쥐를 보정기에 넣고 알코올 솜으로 꼬리를 닦아냅니다.측면 꼬리 정맥을 확인한 후, 200 µL의 세포를 정맥에 천천히 주입합니다. 모든 세포가 전송되면, 28.5 gauge 인슐린 주사기에 complete fluorescens emulsion 50 µL를 취하고 플런저를 세게 눌러 큰 기포를 제거합니다. 그런 다음 왼손 검지에 골무를 끼우고, 귀의 복면이 위로 향하게 하여 왼손 엄지와 골무 사이로 마우스의 귀를 조심스럽게 잡습니다.그 다음 바늘의 사면이 위를 향하게 하여 귓바퀴 외측 1/3 지점의 진피층에 중심에서 약간 벗어난 위치로 삽입하고, 10 µL의 에멀젼을 조직 내에 천천히 주입합니다. 모든 동물에 주입을 마친 후, 마우스가 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 면역화 3일 후, 방금 시연한 것과 같이 주입된 동물의 꼬리 정맥을 혈관 확장시킵니다.마취 후, 포셉을 사용하여 첫 번째 마우스의 꼬리를 고정합니다. 알코올 솜으로 꼬리를 닦아낸 다음, 30.5 gauge 바늘 카테터를 꼬리 외측 정맥에 조심스럽게 삽입하고, 시린지 플런저를 가볍게 눌러 개통 여부를 확인합니다. 카테터가 제대로 삽입되면, 주사 부위에 시아노아크릴레이트 조직 접착제를 1~2방울 바르고 접착제가 약 30초 동안 마르도록 둡니다.그런 다음 가위를 사용하여 수염과 귀 뒷면 및 측면의 털을 조심스럽게 다듬습니다. 다음으로 면봉을 사용하여 PBS로 귀의 내면을 적십니다. 그런 다음 마우스를 회전시켜 주입한 귀를 24 by 50 millimeter 1.5번 유리 커버슬립 위에 유리 표면에 밀착될 때까지 평평하게 폅니다.과잉의 PBS를 닦아냅니다. 그다음, 두 쌍의 곡선 핀셋을 사용하여 약 20 mm 길이의 패브릭 테이프 상단 모서리 부분을 세로 방향으로 잡고, 테이프의 하단을 마우스 귀 상단의 커버 슬립 위에 배치합니다. 테이프를 귀의 나머지 부분 위로 굴려 붙이되, 필요에 따라 핀셋으로 잔털을 밀어내어 정리합니다. 마른 면봉을 사용하여 귀 주변의 테이프를 부드럽게 눌러 밀착시키며, 이때 귀 자체를 누르지 않도록 주의합니다.양측에 밀봉이 잘 되고 기포가 최소화되도록 귀를 커버 슬립에 적절히 테이프로 고정하는 것이 필수적이며, 이는 획득하는 이미지의 품질에 영향을 미칩니다. 이제 형광 현미경 이미징 플랫폼을 37 °C 가열 블록에 테이프로 고정하고, 플랫폼의 귀 배치 구역 양측에 진공 그리스를 도포하십시오. 마우스를 회전시켜 커버 슬립을 플랫폼 위에 놓되, 귀가 펠트의 중앙에 오도록 정렬하십시오.귀의 위치가 잡히면, 이소플루란 노즈콘이 마우스의 코를 완전히 덮고 단단히 고정되었는지 확인하며 플랫폼의 홀더에 끼웁니다. 그런 다음 면봉을 사용하여 커버슬립을 이미징 플랫폼 위에 단단하면서도 조심스럽게 누르고, 커버슬립 아래의 진공 그리스를 넓게 폅니다. 20 mm 길이의 테이프 두 조각과 더 긴 테이프 두 조각을 플랫폼 상단에 감아 커버슬립을 플랫폼에 고정합니다.다음으로, 생쥐를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 플랫폼을 테이프로 더 단단히 고정하고, 귀 주변의 커버슬립 위에 진공 그리스를 이중층으로 도포합니다. 그런 다음 물을 채운 가열 담요로 생쥐를 감싸고, 진공 그리스 저장소에 37 °C의 증류수를 채웁니다.In Vivo 타임랩스 이미징을 위해, 먼저 대물렌즈를 귀의 중심 위에 배치하고 대물렌즈가 저장조의 수면에 닿을 때까지 내립니다. 다음으로, 외부 광원을 사용하여 귀의 표면이 초점으로 잡힐 때까지 대물렌즈를 천천히 내립니다. 그런 다음 현미경 스테이지 주변의 내부 및 외부 커튼을 내리고, MP 레이저 컨트롤러 창에서 레이저 파장을 900 nanometers로, 획득 설정 레이저 창에서 레이저 출력으로, 그리고 이미지 획득 제어 창에서 PMT 전압을 조정합니다.획득 설정의 크기 및 모드 창에서 현미경 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정하고, 픽셀당 체류 시간(dwell time)을 2 µs로 설정한 후, XY 반복(XY repeat)을 선택하여 조직 스캔을 위한 라이브 이미징 모드를 활성화합니다. 적절한 이미징 영역을 찾으면 진피에서 가장 높게 위치한 세포를 찾아 'set zero' 버튼을 클릭하여 Z 위치를 0으로 설정합니다. Z 방향으로 스크롤하여 내려가며 세포 깊이의 범위를 측정합니다.그런 다음 현미경 획득 설정 창에서 시작 및 종료 위치를 설정하고, 밝은 Z 창에서 기기 PMT 전압과 레이저 출력을 조정하여 이미징 필드의 전체 깊이에서 세포 시각화를 최적화하십시오. 깊이 및 시간 버튼을 확인하고, 이미지 획득 제어 필터 모드 창에서 공통 필터를 설정하여 라인당 이미지를 세 번 스캔하도록 설정하십시오. 시간 뷰 창에 표시된 대로 전체 스택을 캡처하는 데 약 1분이 소요되도록 이미지 획득 현미경 창에서 Z 슬라이스 깊이를 조정하십시오.그런 다음, 조직의 안정성을 평가하기 위해 획득 설정의 타임 스캔(time scan) 창에서 반복 횟수를 5회로 설정하고, 스캔 버튼을 클릭하여 해당 영역의 5분 타임랩스 이미지를 캡처합니다. 5분 후에도 조직이 안정적이라면, 획득 설정의 타임 스캔 창에서 반복 횟수를 30회에서 45회 사이로 설정하고, 이미지를 수집하는 동안 미세한 조직 표류(drift)가 발생하는지 모니터링하며 30분에서 45분 동안의 타임랩스 이미지를 수집합니다. 항체 처리 전 이미지를 적절한 형식으로 저장한 후, 공기 방울이 모두 제거되었는지 주의하며 1mL 투베르쿨린 주사기에 항체 혼합액을 흡입합니다.플런저를 부드럽게 눌러 바늘 끝에 항체 용액 방울이 맺히게 하고, 스테이지 주변의 커튼을 들어 올려 카테터의 위치를 확인합니다. PBS 시린지를 항체 시린지로 교체한 후, 카테터 내로 항체를 천천히 주입합니다. 항체 주입이 완료되면 커튼을 다시 내리고 주입 시간을 기록합니다.그 후, 항체 처리 전 이미지와 동일한 기기 설정을 사용하여 동일한 위치에서 20분에서 40분 분량의 새로운 이미징 시퀀스 수집을 즉시 시작하십시오. 마지막으로, 항체 처리 후 이미지 파일을 적절한 형식으로 저장하고, 마우스가 완전히 회복될 때까지 관찰하며 현미경 스테이지에서 조심스럽게 제거하십시오. 이 프로토콜을 통한 온전한 귀 진피의 이미징은 염증이 생긴 진피 내 작동 T 세포 역동성의 고해상도 및 타임랩스 이미지 획득을 용이하게 합니다.이 영상에서는 녹색으로 표시된 입양 이식된 작동 T 세포가 진피 조직 전체를 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 그러나 카테터를 통해 antibeta one 및 antibeta three entogrin 차단 항체를 투여한 후, 이전에 이동하던 세포들이 진피 내에서 정지합니다. 항체 투여 후 세포들의 평균 속도가 감소하며, 구불구불함 지수(meandering index) 또한 유의미하게 감소하는 것이 나타납니다.즉, 총 변위와 총 경로 길이의 비율을 의미합니다. 모낭의 자가형광, 덮여 있는 털로 인한 섀도잉 및 자가형광, 그리고 귀 표면과 커버슬립 사이에 갇힌 기포는 모두 이미징 아티팩트를 유발할 수 있으며, 이는 T 세포의 가시화를 방해하고 자동 이미지 분석 소프트웨어의 작동에 간섭을 일으킵니다. 또한, 여러 열원을 사용하는 것은 조직 안정성 문제를 야기하여 이미징 도중 큰 진동을 유발함으로써 결과 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.숙달되면, 절차가 정확하게 수행되었을 때 진피 내 CD4 T 세포의 이미징은 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 마우스 실험을 위한 적절한 동물 관리 및 사용 가이드라인을 준수하는 것이 중요합니다. 이 절차는 다른 감염 모델이나 다른 염증 유도 방법을 사용하여 귀에 있는 다른 T 세포 하위 집단 또는 면역 세포 유형을 시각화하는 데 응용될 수 있습니다.생체 내 이미징(intravital imaging) 기술의 발전은 면역학 분야의 연구자들이 살아있는 동물 내에서 진행 중인 면역 반응의 역동성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 다중 인광 레이저(multi-phosphor laser)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 차폐와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 유의하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 생쥐의 귀 진피에 염증을 유도하는 방법과 생체 내 이미징을 사용하여 항체 투여 전후의 CD4 T 세포 활동에 대한 타임랩스 이미지를 캡처하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

imaging-cd4-t-cell-interstitial-migration-in-the-inflamed-dermis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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컨포칼 현미경을 사용한 다양한 종양 영역에서의 상주 T 세포 이동에 대한 실시간 분석

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간의 면역 세포를 안정적으로 생체 내 고해상도 이미징하는 것은 어려운 일입니다. 여기에서는 집중 치료 모니터링과 함께 생체 내 다광자 레이저 스캐닝 현미경을 통해 장기간(약 6시간)에 걸쳐 마우스 간에 있는 면역 세포의 이동 및 세포-세포-상호 작용을 연구할 수 있는 매우 민감하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

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와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

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여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

관절의 생체 영상 촬영은 염증이 생긴 관절 내 백혈구의 이동 행동과 분자 역학을 밝히는 데 매우 유용한 기법입니다. 여기서는 제2형 콜라겐 유발 관절염(CIA) 마우스 모델을 사용한 관절의 생체 내 영상 검사에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다.

생체 내 영상 검사는 관절 내 백혈구의 이동 행동을 밝혀냅니다

학습하세요 염증된 피부에서 CD4 T 세포 역학을 비침습적으로 이미징하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구에서 T 세포 이동성 메커니즘을 생체 내에서 연구하는 데 활용됩니다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

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