염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

본 이미징 프로토콜의 전반적인 목표는 염증이 발생한 피부 내 CD4 양성 T 세포의 역동성을 시각화하는 것입니다. 이 방법은 염증성 조직에서 면역 세포의 운동성과 기능의 기초가 되는 메커니즘은 무엇인가와 같은 면역학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 CD4 T 세포의 역동적 행동을 In Situ에서 연구할 수 있는 최소 침습적 방법을 제공한다는 점입니다.

귀를 촬영하기 위해 준비하는 단계는 습득하기 어렵고, 고품질의 이미지를 캡처하려면 귀의 적절한 위치 선정이 필수적이므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 저는 대학원생 Alison Gaylo이며, 이 프로토콜의 시연을 진행하겠습니다. 먼저 마우스당 300 µL의 형광 표지 effector T cell 현탁액을 27.5G 바늘이 장착된 주사기로 흡입하십시오.

그 후 시린지의 바늘 쪽을 위로 향하게 하고, 플런저를 필요에 따라 위아래로 움직이며 시린지 몸통을 가볍게 튕겨 기포를 제거합니다. 세포가 준비되면 생쥐를 깨끗한 케이지로 옮기고, 꼬리 정맥이 확장될 때까지 가열 램프 아래에 둡니다. 그런 다음 첫 번째 생쥐를 보정기에 넣고 알코올 솜으로 꼬리를 닦아냅니다.

측면 꼬리 정맥을 확인한 후, 200 µL의 세포를 정맥에 천천히 주입합니다. 모든 세포가 전송되면, 28.5 gauge 인슐린 주사기에 complete fluorescens emulsion 50 µL를 취하고 플런저를 세게 눌러 큰 기포를 제거합니다. 그런 다음 왼손 검지에 골무를 끼우고, 귀의 복면이 위로 향하게 하여 왼손 엄지와 골무 사이로 마우스의 귀를 조심스럽게 잡습니다.

그 다음 바늘의 사면이 위를 향하게 하여 귓바퀴 외측 1/3 지점의 진피층에 중심에서 약간 벗어난 위치로 삽입하고, 10 µL의 에멀젼을 조직 내에 천천히 주입합니다. 모든 동물에 주입을 마친 후, 마우스가 완전히 회복될 때까지 관찰합니다. 면역화 3일 후, 방금 시연한 것과 같이 주입된 동물의 꼬리 정맥을 혈관 확장시킵니다.

마취 후, 포셉을 사용하여 첫 번째 마우스의 꼬리를 고정합니다. 알코올 솜으로 꼬리를 닦아낸 다음, 30.5 gauge 바늘 카테터를 꼬리 외측 정맥에 조심스럽게 삽입하고, 시린지 플런저를 가볍게 눌러 개통 여부를 확인합니다. 카테터가 제대로 삽입되면, 주사 부위에 시아노아크릴레이트 조직 접착제를 1~2방울 바르고 접착제가 약 30초 동안 마르도록 둡니다.

그런 다음 가위를 사용하여 수염과 귀 뒷면 및 측면의 털을 조심스럽게 다듬습니다. 다음으로 면봉을 사용하여 PBS로 귀의 내면을 적십니다. 그런 다음 마우스를 회전시켜 주입한 귀를 24 by 50 millimeter 1.5번 유리 커버슬립 위에 유리 표면에 밀착될 때까지 평평하게 폅니다.

과잉의 PBS를 닦아냅니다. 그다음, 두 쌍의 곡선 핀셋을 사용하여 약 20 mm 길이의 패브릭 테이프 상단 모서리 부분을 세로 방향으로 잡고, 테이프의 하단을 마우스 귀 상단의 커버 슬립 위에 배치합니다. 테이프를 귀의 나머지 부분 위로 굴려 붙이되, 필요에 따라 핀셋으로 잔털을 밀어내어 정리합니다. 마른 면봉을 사용하여 귀 주변의 테이프를 부드럽게 눌러 밀착시키며, 이때 귀 자체를 누르지 않도록 주의합니다.

양측에 밀봉이 잘 되고 기포가 최소화되도록 귀를 커버 슬립에 적절히 테이프로 고정하는 것이 필수적이며, 이는 획득하는 이미지의 품질에 영향을 미칩니다. 이제 형광 현미경 이미징 플랫폼을 37 °C 가열 블록에 테이프로 고정하고, 플랫폼의 귀 배치 구역 양측에 진공 그리스를 도포하십시오. 마우스를 회전시켜 커버 슬립을 플랫폼 위에 놓되, 귀가 펠트의 중앙에 오도록 정렬하십시오.

귀의 위치가 잡히면, 이소플루란 노즈콘이 마우스의 코를 완전히 덮고 단단히 고정되었는지 확인하며 플랫폼의 홀더에 끼웁니다. 그런 다음 면봉을 사용하여 커버슬립을 이미징 플랫폼 위에 단단하면서도 조심스럽게 누르고, 커버슬립 아래의 진공 그리스를 넓게 폅니다. 20 mm 길이의 테이프 두 조각과 더 긴 테이프 두 조각을 플랫폼 상단에 감아 커버슬립을 플랫폼에 고정합니다.

다음으로, 생쥐를 현미경 스테이지로 옮깁니다. 플랫폼을 테이프로 더 단단히 고정하고, 귀 주변의 커버슬립 위에 진공 그리스를 이중층으로 도포합니다. 그런 다음 물을 채운 가열 담요로 생쥐를 감싸고, 진공 그리스 저장소에 37 °C의 증류수를 채웁니다.

In Vivo 타임랩스 이미징을 위해, 먼저 대물렌즈를 귀의 중심 위에 배치하고 대물렌즈가 저장조의 수면에 닿을 때까지 내립니다. 다음으로, 외부 광원을 사용하여 귀의 표면이 초점으로 잡힐 때까지 대물렌즈를 천천히 내립니다. 그런 다음 현미경 스테이지 주변의 내부 및 외부 커튼을 내리고, MP 레이저 컨트롤러 창에서 레이저 파장을 900 nanometers로, 획득 설정 레이저 창에서 레이저 출력으로, 그리고 이미지 획득 제어 창에서 PMT 전압을 조정합니다.

획득 설정의 크기 및 모드 창에서 현미경 해상도를 512 x 512 픽셀로 설정하고, 픽셀당 체류 시간(dwell time)을 2 µs로 설정한 후, XY 반복(XY repeat)을 선택하여 조직 스캔을 위한 라이브 이미징 모드를 활성화합니다. 적절한 이미징 영역을 찾으면 진피에서 가장 높게 위치한 세포를 찾아 'set zero' 버튼을 클릭하여 Z 위치를 0으로 설정합니다. Z 방향으로 스크롤하여 내려가며 세포 깊이의 범위를 측정합니다.

그런 다음 현미경 획득 설정 창에서 시작 및 종료 위치를 설정하고, 밝은 Z 창에서 기기 PMT 전압과 레이저 출력을 조정하여 이미징 필드의 전체 깊이에서 세포 시각화를 최적화하십시오. 깊이 및 시간 버튼을 확인하고, 이미지 획득 제어 필터 모드 창에서 공통 필터를 설정하여 라인당 이미지를 세 번 스캔하도록 설정하십시오. 시간 뷰 창에 표시된 대로 전체 스택을 캡처하는 데 약 1분이 소요되도록 이미지 획득 현미경 창에서 Z 슬라이스 깊이를 조정하십시오.

그런 다음, 조직의 안정성을 평가하기 위해 획득 설정의 타임 스캔(time scan) 창에서 반복 횟수를 5회로 설정하고, 스캔 버튼을 클릭하여 해당 영역의 5분 타임랩스 이미지를 캡처합니다. 5분 후에도 조직이 안정적이라면, 획득 설정의 타임 스캔 창에서 반복 횟수를 30회에서 45회 사이로 설정하고, 이미지를 수집하는 동안 미세한 조직 표류(drift)가 발생하는지 모니터링하며 30분에서 45분 동안의 타임랩스 이미지를 수집합니다. 항체 처리 전 이미지를 적절한 형식으로 저장한 후, 공기 방울이 모두 제거되었는지 주의하며 1mL 투베르쿨린 주사기에 항체 혼합액을 흡입합니다.

플런저를 부드럽게 눌러 바늘 끝에 항체 용액 방울이 맺히게 하고, 스테이지 주변의 커튼을 들어 올려 카테터의 위치를 확인합니다. PBS 시린지를 항체 시린지로 교체한 후, 카테터 내로 항체를 천천히 주입합니다. 항체 주입이 완료되면 커튼을 다시 내리고 주입 시간을 기록합니다.

그 후, 항체 처리 전 이미지와 동일한 기기 설정을 사용하여 동일한 위치에서 20분에서 40분 분량의 새로운 이미징 시퀀스 수집을 즉시 시작하십시오. 마지막으로, 항체 처리 후 이미지 파일을 적절한 형식으로 저장하고, 마우스가 완전히 회복될 때까지 관찰하며 현미경 스테이지에서 조심스럽게 제거하십시오. 이 프로토콜을 통한 온전한 귀 진피의 이미징은 염증이 생긴 진피 내 작동 T 세포 역동성의 고해상도 및 타임랩스 이미지 획득을 용이하게 합니다.

이 영상에서는 녹색으로 표시된 입양 이식된 작동 T 세포가 진피 조직 전체를 이동하는 것을 관찰할 수 있습니다. 그러나 카테터를 통해 antibeta one 및 antibeta three entogrin 차단 항체를 투여한 후, 이전에 이동하던 세포들이 진피 내에서 정지합니다. 항체 투여 후 세포들의 평균 속도가 감소하며, 구불구불함 지수(meandering index) 또한 유의미하게 감소하는 것이 나타납니다.

즉, 총 변위와 총 경로 길이의 비율을 의미합니다. 모낭의 자가형광, 덮여 있는 털로 인한 섀도잉 및 자가형광, 그리고 귀 표면과 커버슬립 사이에 갇힌 기포는 모두 이미징 아티팩트를 유발할 수 있으며, 이는 T 세포의 가시화를 방해하고 자동 이미지 분석 소프트웨어의 작동에 간섭을 일으킵니다. 또한, 여러 열원을 사용하는 것은 조직 안정성 문제를 야기하여 이미징 도중 큰 진동을 유발함으로써 결과 해석을 어렵게 만들 수 있습니다.

숙달되면, 절차가 정확하게 수행되었을 때 진피 내 CD4 T 세포의 이미징은 2~3시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 마우스 실험을 위한 적절한 동물 관리 및 사용 가이드라인을 준수하는 것이 중요합니다. 이 절차는 다른 감염 모델이나 다른 염증 유도 방법을 사용하여 귀에 있는 다른 T 세포 하위 집단 또는 면역 세포 유형을 시각화하는 데 응용될 수 있습니다.

생체 내 이미징(intravital imaging) 기술의 발전은 면역학 분야의 연구자들이 살아있는 동물 내에서 진행 중인 면역 반응의 역동성을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 다중 인광 레이저(multi-phosphor laser)를 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행하는 동안 적절한 차폐와 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 유의하십시오. 이 영상을 시청하고 나면 생쥐의 귀 진피에 염증을 유도하는 방법과 생체 내 이미징을 사용하여 항체 투여 전후의 CD4 T 세포 활동에 대한 타임랩스 이미지를 캡처하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.