"인간 답게"를 생성 초파리 S2 세포주 민감성

이 실험의 전반적인 목표는 Kinesin-5 모터의 소분자 억제제에 민감한 초파리 S2 세포주를 생성하여 오류 보정을 연구하는 데 사용할 수 있도록 하는 것입니다. 세포 분열 중 오류 보정은 잘못된 동포코어와 미세소관의 상호 작용이 불안정화되어 세포가 적절한 부착물을 형성할 수 있는 두 번째 기회 또는 또 다른 기회를 제공하여 게놈이 적절하게 분리될 수 있도록 하는 과정입니다. 이 방법은 오류 수정 프로세스와 관련된 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 염색체 수가 적고 Kinesin-5 억제제에 민감한 Drosophila S2 세포주를 사용할 수 있다는 것인데, 이 두 가지 모두 개별 오류 수정 이벤트의 시각화를 용이하게 합니다. S2 세포를 발현하는 100% 융합 GFP-알파 튜불린의 이전에 배양한 25cm 정사각형 플라스크로 시작하여 배양액 2ml를 35mm 접시에 옮깁니다. 그런 다음 세포를 실온에서 약 1시간 동안 배양하여 반접착시킵니다.

접시에서 배지를 제거하고 FBS가 보충된 Schneider's 배지 1ml를 Eg5-mCherry 구조체 및 transfection 시약 2마이크로그램에 첨가하여 제조업체의 프로토콜에 따라 세포를 transfection합니다. 파라필름을 사용하여 접시를 밀봉하고 섭씨 25도에서 16-18시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 Schneider's medium(슈나이더 배지) 1ml를 추가하고 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.

transfection 후 3일차에 500μl의 transfection된 세포를 1.5ml의 Schneider's medium이 들어 있는 새로운 35mm 조직 배양 접시에 옮겨 테스트 유도를 합니다. Eg5-mCherry의 발현을 유도하려면 최종 농도 500 마이크로 몰에 황산구리를 첨가하십시오. 파라필름으로 접시를 밀봉하고 섭씨 25도에서 밤새 배양합니다.

미리 준비한 22mm x 22mm Concanavalin A 코팅된 커버 슬립을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 넣습니다. 그런 다음 500%confluent 유도 세포 500마이크로리터를 커버 슬립에 파종하고 세포가 실온에서 접착되도록 합니다. Eg5-mCherry 발현을 확인하려면 텍스트 프로토콜의 지침에 따라 형광 현미경을 사용하여 실온에서 이미지 및 배지가 있는 장미 챔버에 커버 슬립을 조립합니다.

세포가 Eg5-mCherry 및 GFP 알파 튜불린을 모두 발현하는 것을 확인한 후, 형질주입된 유도되지 않은 세포의 나머지 부분을 4밀리리터의 슈나이더 배지가 함유된 25cm 정사각형 조직 배양 플라스크로 옮깁니다. 최종 농도인 밀리리터당 25마이크로그램의 Blasticidin S HCL을 플라스크에 첨가하고 세포 사멸이 멈출 때까지 Blasticidin S HCL이 있는 상태에서 세포를 계속 분할합니다. Text Protocol에 따라 KLP61F double-stranded RNA를 준비한 후, Eg5-mCherry를 발현하는 S2 세포를 35mm 배양 접시에 25% confluency로 seed하고 1시간 동안 부착시킵니다.

접시에서 배지를 제거하고 1ml의 무혈청 Schneider's 배지 5마이크로그램의 이중 가닥 KLP61F RNA를 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후 10%FBS가 함유된 슈나이더 배지 1ml를 추가합니다. 세포를 섭씨 25도에서 배양합니다.

dsRNA 처리 24시간 후 최종 농도 500마이크로몰에 황산구리를 첨가하여 Eg5-mCherry의 발현을 유도합니다. 섭씨 25도에서 추가로 24시간 동안 세포를 배양합니다. 라이브 셀 이미징을 수행하려면 22mm x 22mm Concanavalin A 코팅된 커버 슬립을 깨끗한 35mm 조직 배양 접시에 넣습니다.

하룻밤 동안 유도된 dsRNA 처리 세포 500마이크로리터를 커버 슬립에 파딩하고 약 1시간 동안 접착시킵니다. 텍스트 프로토콜에 따라 바이폴라 스핀들의 타임 랩스 이미지를 수집한 후 로즈 챔버에서 매체를 제거하고 1개의 마이크로몰 STLC가 포함된 Schneider의 배지를 추가하고 STLC 배지를 두 번 더 교체하고 각 세척 후 배지를 폐기하여 스핀들 붕괴를 시각화합니다. 약물 및 리버스 스핀들 붕괴를 세척하려면 로즈 챔버에서 STLC 함유 배지를 조심스럽게 제거하여 폐기물 용기에 버리고 총 6-8mm의 Schneider's 배지를 사용하여 세포를 4회 세척하고 세척할 때마다 배지를 폐기합니다.

그런 다음 챔버를 다시 채우기 위해 새로운 매체를 추가한 후 이미징을 계속합니다. 약물 세척 및 세척을 위한 매체에 접근하려면 현미경에 고정한 상태에서 장미 챔버에서 상단 덮개 슬립을 조심스럽게 제거합니다. 또는, 커버 슬립과 유사하게 Concanavalin A로 처리된 유리 바닥 페트리 접시를 라이브 셀 이미징에 사용할 수 있습니다.

KLP61F dsRNA로 처리된 S2 세포 500마이크로리터를 Concanavalin A 커버 슬립에 파종하고 세포가 부착되도록 한 후 1.5ml의 Schneider 배지를 추가하여 최종 부피를 2ml로 만듭니다. 텍스트 프로토콜에 따라 유사분열에서 세포가 정지되면 하나의 마이크로몰 STLC를 추가하고 1시간 동안 배양하여 단극이 형성될 수 있도록 합니다. 2ml의 신선한 Schneider's 매체를 사용하여 커버 슬립을 세 번 헹구어 STLC를 세척합니다.

양극성 방추체 형성의 다른 시점에서 세포를 고정하고 동역학 부착 부위를 평가하려면 먼저 1X BRB80 2ml를 사용하여 커버 슬립을 빠르게 헹굽니다. 화학 물질 후드에 1X BRB80에 10%PFA 2ml를 넣고 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 세포를 투과화하기 위해 1X PBS에 1%Triton X를 첨가하고 10분 동안 배양합니다.

그런 다음 1X PBS에 0.1% Triton X 2밀리리터를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다. 다음으로, 셀 면이 위를 향하도록 커버 슬립을 150mm 페트리 접시에 담긴 파라필름 시트로 옮깁니다. 150마이크로리터의 삶은 당나귀 혈청(BDS)을 커버 슬립에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 항체 결합을 차단합니다.

배양 후 블록을 제거하고 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 150마이크로리터의 1차 항체를 추가한 후 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 커버 슬립을 3회 세척한 후 BDS에 희석된 Fluoro-4 접합 2차 항체를 첨가하고 실온에서 30-60분 동안 배양합니다. 커버 슬립을 세 번 세척한 후 DAPI 150마이크로리터당 1마이크로그램이 포함된 BDS 150마이크로리터로 5분 동안 배양합니다.

그런 다음 커버 슬립을 두 번 세척한 후 8마이크로리터의 장착 매체를 사용하여 셀 면이 아래를 향하게 하여 샘플을 3 x 1인치 슬라이드에 장착합니다. 매니큐어를 사용하여 모서리를 칠하십시오. 마지막으로, 100X 대물렌즈를 사용하여 Eg5-mCherry를 발현하는 양극성 방추체가 있는 세포를 이미지화합니다.

모든 채널에서 0.2마이크로미터 간격으로 30개의 평면으로 구성된 Z 시리즈를 예로 들어 보겠습니다. 부착 상태를 결정하기 위해 kinetochore와 microtubules를 주의 깊게 분석합니다. KLP61F는 초파리 S2 세포에서 양극성 방추체를 형성하는 데 필요합니다. 그러나 저분자 Kinesin-5 억제제는 이에 대해 효과가 없습니다.

이 이미지는 인간 Kinesin-5 Eg5가 초파리 S2 세포에서 KLP61F의 기능을 구할 수 있음을 보여줍니다. Kinesin-5 억제제인 STLC가 추가되면 미세소관 관련 모터 수치가 떨어지고 방추체가 붕괴되어 RNA I.의 성공으로 내인성 KLP61F가 결핍된 세포에서 단극이 발생합니다. 이 그림은 Kinesin-5 억제가 약물을 씻어냄으로써 역전될 수 있으며 시간이 지남에 따라 양극성 방추체의 회복을 따를 수 있음을 보여줍니다. 억제제가 제거되면 Eg5-mCherry는 미세소관과 재결합하고 세포는 양극성 아나페이즈로 진행할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 Kinesin-5의 소분자 억제제에 민감한 초파리 S2 세포주를 생성하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 약 6시간 안에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 이 방법은 며칠 전에 준비해야 하기 때문에 미리 계획하는 것이 중요합니다.

저분자 억제제를 사용하는 것은 위험할 수 있으므로 항상 장갑을 착용해야 한다는 점을 잊지 마십시오. 인간화 초파리 세포를 만드는 것은 Crispr-Cas 9 기술의 적용을 통해 입증될 수 있으며, 초파리 Kinesin-5를 인간 초파리로 대체하는 것입니다. 인간화 초파리 세포의 개발은 향후 오류 수정 및 기타 필수 세포 과정에 대한 이해를 증진해야 합니다.