Photoconvertible PSmOrange 시스템을 사용하여 GFP 유전자 변형 Zebrafish의 세포를 추적

PSmOrange 사진 변환 기술의 전반적인 목표는 배아 발달 및 질병 발생 시 살아있는 동물의 세포를 추적하는 것입니다. 이 방법은 조직과 장기로 발달하는 세포의 기원을 밝히는 것과 같은 발생 생물학의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 GFP 형질전환 배경에 적용할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 재생, 종양 진행 및 침습과 같은 다양한 연구 분야에도 적용할 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 발현하는 PSmOrange 및 GFP를 생성하고 삽입한 후, 배아를 컨포칼 현미경 아래에 놓고 20x 공기 대물렌즈와 488 및 561 나노미터 레이저를 사용하여 표본을 스캔하여 광변환할 영역을 식별합니다. 광변환 전에 PSmOrange 단백질을 검출하려면 대물렌즈 위의 초점면에서 측정된 0.74밀리와트의 출력으로 561나노미터 레이저를 사용하고 필요에 따라 레이저 출력을 조정합니다.

확대/축소 계수를 조정하여 관심 영역을 강조하고 이미지 획득 시간과 사진 독성을 줄입니다. 순차 모드에서 488 및 561 나노미터 레이저를 사용하고 1.0에서 2.0 마이크로미터 사이의 Z 단계를 사용하여 관심 구조를 포함하는 Z 스택을 획득합니다. 라인 평균과 스캔 주파수를 조정하여 이미지 품질을 최적화합니다.

그런 다음 샘플을 스캔하고 관심 영역 또는 ROI 도구를 선택하여 ROI를 자극 영역으로 고정하기 전에 광변환할 영역을 강조 표시합니다. 광활성화 표백 모듈을 선택하고 확인란을 선택하여 488 나노미터 레이저를 활성화한 다음 488 나노미터 레이저를 80%로 설정하고 스캔 속도를 프레임당 0.5초로 설정합니다. 그런 다음 사진 변환 유틸리티를 열고 추가'를 클릭하여 사진 변환 프로토콜을 지정합니다.

획득 자극 메뉴에서 Phase One을 획득으로 설정하고 루프 메뉴에서 광변환 전에 획득할 이미지 수를 표시합니다. Phase Two(단계 2)를 stimulation(자극)으로 설정하고 수행할 자극 이벤트의 수를 입력합니다. 1단계에 대해 설명된 대로 3단계를 조정합니다.

선택적으로, 이미지 획득의 마지막 라운드 전에 대기할 시간을 입력하여 2단계 이후에 대기 단계를 삽입합니다. 매개변수가 설정되면 자극 설정을 적용하고 광 변환을 실행합니다. Miscroscopic 설정은 PSmOrange 사진 변환에 매우 중요합니다.

성공적인 광변환을 보장하기 위해 실험 직후 배아를 이미지화하여 광변환된 PSmOrange 단백질을 검출합니다. 변환에 성공하지 못하면 절차가 반복됩니다. 488, 561 및 640 나노미터 레이저를 사용하고 640 나노미터 레이저를 최대 4.5밀리와트의 고출력으로 설정하면 방금 설명한 설정으로 최종 z 스택을 얻을 수 있습니다.

배아를 분리하려면 현미경에서 챔버를 제거하고 집게를 사용하여 아가로스에서 배아를 제거합니다. 배아를 E3에 0.2 밀리몰 PTU를 함유한 새로운 멸균 플라스틱 페트리 접시 또는 멸균된 6웰 플레이트로 옮깁니다. 원하는 발달 단계까지 섭씨 28도에서 배아를 배양합니다. 세포를 발현하는 광변환된 PSmOrange 단백질의 운명을 분석하려면, 텍스트 프로토콜에 따라 배아를 다시 삽입하십시오.

컨포칼 현미경으로 검체를 스캔하여 관심 있는 GFP 형질전환 구조에서 광변환된 세포를 식별합니다. 488, 561 및 640 나노미터 레이저를 사용하여 구조를 포괄하는 순차 모드에서 1-2마이크로미터의 고정 스택이 있는 z 스택을 획득합니다. Image J Fiji 소프트웨어를 사용하여 GFP와 광변환 단백질을 동시에 발현하는 세포를 식별합니다.

원본 스택을 복제하고 Gaussian Blur 플러그인과 이미지 계산기를 사용하여 원본에서 부드러운 스택을 뺍니다. 광변환된 셀을 강조하기 위해 녹색 및 원적외선 채널에 특정 임계값을 적용합니다. 그런 다음 Analyze Particles 도구를 사용하여 적절한 설정으로 녹색 채널의 임계값 영역을 감지합니다.

원적외선 채널에 대해 이 단계를 반복합니다. 이미지 계산기 플러그인을 열어 공동 지역화 셀을 감지합니다. Analyze Particles 툴을 사용하여 겹치는 ROI를 녹색 또는 연적색 채널로 노란색으로 표시합니다.

NIS-Elements 소프트웨어를 사용하여 3D 날짜 평가를 수행하고 볼륨 보기 표시 옵션을 사용하여 스택을 3D로 표시합니다. 그런 다음 그래픽 인터페이스를 사용하여 녹색, 빨간색 및 근적외선 채널을 선택하고, 밝기와 대비를 조정하고, 3D 스택을 잘라 사진 변환 영역을 강조 표시합니다. 여기에 표시된 것은 얼룩말 물고기 형질전환 FOXD3 부유 머리 GFP 배아에서 PSmOrange 광전환 시스템의 예입니다.

수정 후 26시간이 지났을 때, 송과체의 앞쪽에 있는 두 개의 세포 클러스터를 광변환하여 즉시 이미지화했습니다. 단백질은 640 나노 미터 원적외선 레이저로 검출되었지만 561 나노 미터 레이저로는 검출되지 않았습니다. 이 세포에서 GFP 발현은 광표백으로 인해 초기에 감소했습니다.

52 HPF에서, GFP 및 H2B PSmOrange는 광변환된 H2B PSmOrange 단백질 발현 세포에서 검출되었습니다. 이 세포들 중 일부는 뇌의 왼쪽에 있는 주위(parapineal)를 형성했다. 이 결과는 송과체 전방의 parapineal cell origin에 대한 이전 보고와 일치하며 살아있는 GFP 형질전환 척추동물 배아에서 PSmOrange 기술의 적용 가능성을 보여줍니다.

이 절차에 따라 세포 발달의 기저에 있는 분자 계층에 관한 추가 질문에 답하기 위해 유전적으로 조작된 배아에서 세포 추적 분석을 수행할 수 있습니다.