Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

이 절차의 전반적인 목표는 사용자가 초저온 전자 단층 촬영의 고처리량 수집 및 처리 파이프라인을 구축할 수 있도록 돕는 것입니다. 이 방법은 차세대 검출기로 수집된 데이터를 어떻게 처리하고 자동화된 틸트 시리즈 수집 소프트웨어로 생성된 엄청난 양의 데이터를 어떻게 처리합니까? 이 기술의 주요 장점은 사용자가 자동화된 틸트 시리즈 처리를 위한 효율적인 파이프라인을 찾기 위해 통합된 방식으로 여러 소프트웨어 패키지를 구성할 수 있어 단층 촬영 분석에 더 많은 시간을 할애할 수 있다는 것입니다.

일반적으로 Cryo-ET를 처음 접하는 개인은 전자 현미경에서 생성된 방대한 데이터를 처리하기 위해 많은 지루한 단계가 필요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 개발에 대한 아이디어는 5년 전 한 가지 박테리아를 3D로 재구성하기 위해 수백 단계를 수동으로 거쳐야 했을 때 처음 떠올랐습니다. 사전에 Shigella flexneri minicells 준비에 대한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

그런 다음 기존 JoVE 간행물에서 설명하고 텍스트 프로토콜에 문서화된 대로 전자 현미경 그리드를 준비합니다. 유리화 얼음에 내장된 미니셀 컬렉션을 EM 스테이지에 로드한 후 틸트 시리즈에 대한 저배율 맵 수집을 시작합니다. 약 2300배의 저배율에서 형광등 화면을 보면서 이미지화할 수 있는 격자 사각형을 찾습니다.

이 위치에는 얇은 얼음과 오염 물질이 없는 관심 대상이 포함되어야 합니다. 그런 다음 보기를 그리드 사각형의 중앙으로 조정하고 Add Stage Position 버튼을 클릭하여 위치를 저장합니다. 그런 다음 허용 가능한 모든 그리드 사각형의 위치가 저장될 때까지 이 과정을 반복합니다.

다음 단계는 새 몽타주 파일을 여는 것으로 시작합니다. 설정 대화 상자에서 X 및 Y를 설정하여 전체 그리드 사각형이 캡처되도록 합니다. 표준 200 메쉬 그리드의 경우 8과 같이 높은 Binning 값으로 10 x 10 공간을 만듭니다.

또한 이미지 이동 대신 스테이지 이동 옵션과 조각을 정렬하는 데 사용되는 상관 관계 건너뛰기 옵션을 토글합니다. 이제 Navigator(탐색기) 창에서 Acquire 토글을 사용하여 획득할 첫 번째 스테이지 위치를 선택합니다. 각 스테이지 위치에 대해 이 작업을 계속합니다.

그런 다음 Navigator 메뉴에서 Acquire at Points를 클릭합니다. 대화 상자가 열리면 Acquire Map Image(맵 이미지 획득)와 Rough Eucentricity(대략적인 동심률)를 토글합니다. 다른 모든 옵션의 토글을 해제합니다.

그런 다음 진행을 클릭하면 각 스테이지 위치에 대한 몽타주가 만들어집니다. SerialEM 소프트웨어로 계속 작업합니다. Navigator에서 획득한 맵을 선택하고 Load Map을 클릭합니다.

그런 다음 Add Points(포인트 추가)를 클릭하고 지도에서 틸트 시리즈를 획득해야 하는 지점을 선택합니다. 선택한 후 포인트 추가 중지를 클릭하고 수집된 각 맵에 대해 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 카메라 메뉴에서 매개변수를 열고 초점, 평가판 및 녹화 모드를 설정합니다.

선량 분획 데이터를 기록하는 옵션은 특별한 관심을 가질 수 있으며, 이는 기록 옵션에서 지정할 수 있습니다. 계속하려면 현재 표시된 맵에서 포인트 중 하나를 선택하고 내비게이터 창에서 틸트 시리즈 옵션을 토글합니다. 대화 상자가 열리면 틸트 시리즈에 대한 매개변수를 선택합니다.

그런 다음 맵에서 선택한 각 포인트에 대해 틸트 시리즈 옵션을 전환하는 프로세스를 반복합니다. 다음으로, 탐색기에서 Acquire at Points 옵션을 시작합니다. 대화 상자에서 Preliminary Tasks(예비 작업), Realign to item(항목에 재정렬), Autofocus(자동 초점) 및 rough eucentricity(대략적인 동심률

그런 다음 기본 작업을 tilt-series를 획득하도록 설정하고, 끝에서 열 값 닫기를 선택하여 모든 포인트가 수집되었을 때 열을 닫습니다. 프로세스가 실행되면 각 맵에서 틸트 시리즈 수집을 위해 토글된 각 지점에서 틸트 시리즈가 수집됩니다. 원래 tilt-series, SerialEM의 출력 로그 및 개별 선량 분별 이미지를 모두 현재 작업 디렉토리의 터미널에 있는 경우 다음 명령을 실행하여 beam-induced motion artifact를 제거합니다.

틸트 시리즈의 정렬 및 재구성을 진행합니다. 터미널에 다음과 같이 tomoauto 명령을 입력합니다. 명령에 프로세스에 tilt-series의 파일 이름을 추가하고 그 뒤에 나노미터 단위의 기준 직경을 추가합니다.

CTF 처리를 원하지 않는 경우 명령에서 옵션을 생략하면 됩니다. 이 명령은 tomoauto의 주요 용도로, 사용자는 원래 수동 사용자 개입이 필요했던 틸트 시리즈 정렬과 관련된 모든 프로세스를 단일 명령으로 실행할 수 있으므로 배치 처리를 신속하게 스크립팅할 수 있습니다. 이제 3dmod 명령을 사용하여 정렬된 틸트 시리즈에 눈에 띄는 오류가 있는지 확인합니다.

여기서 filename은 접미사가 없는 틸트 시리즈의 이름입니다. 그런 다음 여기에 표시된 명령을 사용하여 예상 CTF를 검사합니다. 다시 말하지만, filename은 접미사가 없는 틸트 시리즈의 이름입니다.

또한 tomoauto 명령에 의해 생성된 출력 로그에서 정렬의 잔류 오류를 확인합니다. 이것은 얼라인먼트의 전반적인 품질에 대한 정량적 측정입니다. 정렬이 허용 가능한 경우 재구성 계산을 진행합니다.

이 명령은 CTF를 수정하고 tilt-series에서 정렬에 사용된 기준 마커를 지우도록 설정됩니다. 시각적 검사를 건너뛰고 복원으로 바로 이동하려면 이 명령을 사용합니다. Tomoauto에는 많은 접근 가능한 옵션이 있습니다.

특히 하나는 tomoauto 문서에 따르면 보조 파일에 의해 설명된 로컬 구성을 포함할 수 있는 기능입니다. tilt-series 파일 이름을 추가하기 전에 local configuration 옵션을 사용하여 명령줄 대화 상자에 이 파일의 이름을 포함합니다. 로컬 구성 파일을 생성하는 기능은 tomoauto의 가장 강력한 기능으로, 사용자는 사용되는 모든 명령을 완전히 구성하고 자동화된 처리를 유지하면서 특정 데이터 세트 또는 어려운 데이터 세트에 대한 실행을 조정할 수 있습니다.

테스트 프로토콜 내에는 서브 단층 도포 평균화를 실행하는 방법에 대한 추가 지침이 있습니다. 설명된 프로토콜에 따라, 두 개의 정렬된 틸트 시리즈가 tomoauto로 만들어졌습니다. 미세 정렬은 기준 마커 좌표를 이상적으로 정의하는 모델에서 계산됩니다.

50도에서 하나의 틸트 시리즈가 금 입자를 정확하게 추적하여 허용 가능한 정렬을 나타냅니다. 두 번째 틸트 시리즈의 경우 빨간색으로 표시된 여러 모델 포인트가 해당 금색 마커에서 벗어났으며, 이를 보여주면 모델이 적절한 정렬을 생성하지 못했습니다. 틸트 시리즈가 수집되면 tomoauto는 수집된 틸트 시리즈의 80-90%를 성공적으로 정렬합니다.

재구성 후 최종 단층촬영은 이미지 샘플의 3D 볼륨입니다. 그런 다음 세분화에 의한 세포 주석 또는 샘플 내 분자 기계의 더 높은 해상도 정보를 얻기 위해 sub-tomogram 평균화에 사용할 수 있습니다. EMDB에 증착된 부착된 Shigella flexneri의 2.7나노미터 미만 단층 촬영 평균은 단일 단층 촬영에서 주사제를 보는 것보다 이 기술이 크게 개선되었음을 보여줍니다.

이 동영상을 시청한 후에는 SerialEM 및 tomoauto를 사용하여 자동화된 고처리량 방식으로 초저온 전자 단층 촬영 데이터를 수집하고 처리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행되면 하루에 거의 100개의 틸트 시리즈를 수집하고 20분 안에 틸트 시리즈를 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 항상 틸트 직렬 정렬의 품질을 확인하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

tilt-series 세트가 제대로 정렬되지 않으면 수동으로 정렬을 시도하고 매개변수를 로컬 구성으로 전송하십시오. 이 절차에 따라 고분자 복합체의 고해상도 구조를 결정하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 하위 단층 그래프 평균화와 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 Cryo-EM 분야의 연구자들이 박테리아, 바이러스 및 기타 유기체의 고해상도 in situ 구조를 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.