Name: Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: 학습하세요 고해상도 원위 구조 분석을 위한 고처리량 냉동전자단층촬영법을 Shigella flexneri 미니세포에 적용하여 자동화된 데이터 처리 파이프라인을 구축하는 방법을. 이 기술은 연구자가 방대한 데이터를 효율적으로 처리하고 생물학적 질문에 집중할 수 있게 합니다.

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우리는 의견 박사 윌리엄 Margolin 감사합니다. 우리는 박사에서 SerialEM의 지원에 감사합니다. 데이비드 Mastronarde과 첸 쑤. DM, BH와 JL은 웰치 재단 알레르기 및 전염병 국립 연구소, 일반 의료 과학 국립 연구소 (NIGMS)에서 보조금 R01GM110243과 R01GM107629, 그랜트 AU-1714에서 그랜트 R01AI087946에 의해 지원되었다. 직접 전자 검출기는 건강 상 S10OD016279의 국립 연구소에 의해 투자되었다.

1. Minicell 준비 <ol><li> S.을 만들려면 flexneri minicells는 구조적으로 스펙 티노 마이신 내성 플라스미드 5 μL electrocompetent 스트렙토 마이신 내성 혈청 형 5A (M90T-SM) 전기에 의해 세포로 낮은 복사본에서 대장균 세포 분열 유전자 ftsQ, ftsA 및 ftsZ을 표현 플라스미드 pBS58, 1 μl를 변환 1mm 큐벳에 5 밀리 2.5 kV의에. </li><li> 1.5 ml의 극저온 마이크로 튜브 15 % 글리세롤에서 -80 ° C에서 보관 minicell 샘플. 사용하기 위해, 4 ml의 세포를 피펫 팁을 사용하여 unthawed 마이크로 튜브에서 세포의 약 5 μl를 긁어 일시 중지 준비가되면 스펙 티노 마이신과 트립신 간장 국물 / ㎖ 농도 100 μg의 추가. 37 ° C에서 O / N 성장. </li><li> 피펫 다시 100 μg의 / ml의 농도에 추가 스펙 티노 마이신 1.2 (200)에 ㎖의 트립신 간장 국물의 문화 2 ㎖. 늦은 로그 상에 37 ℃에서 성장한다. </li><li> minicells, 원심 분리 농축5 분 1,000 XG에 1.3에서 문화 200 ㎖. 조심스럽게 10 분 동안 20,000 XG에 새로운 원심 분리 튜브에서 원심 분리로 상청액 분획을 붓는다. 조심스럽게 부어과 상청액 분획을 폐기하고, 부드럽게 피펫 팁을 이용하여 잔여 액체로 펠릿을 혼합하여 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 펠릿의 혼합물을 약 100 μl를 옮긴다. </li></ol> 2. EM 그리드 준비 <ol><li> 유리 슬라이드에 R2 / 2 구멍 투성이의 탄소 필름 200 메쉬 구리 그리드 탄소 측면을 놓습니다. 주 : R2 / 2의 200 메시 그리드는 여전히 표본을지지하고 카메라의 분야에서 탄소막의 에지를 배치하는 동안 하나의 그리드 사각형은 취득하기 위해서 설정 될 수 틸트 계의 수를 최대화하도록 선택된다 원하는 배율로. 미세한 메쉬 그리드 및 R1.2 같은 작은 구멍 투성이 탄소막 / 1.3 400 메쉬 높은 배율에서 영상화 시료에 사용될 수있다; 같은 R3.5으로 더 큰 구멍 투성이의 탄소 필름 / 1 200 메쉬 사용 할 수 있습니다샘플 D는 낮은 배율에서 영상화 또는 현미경은 R1과 같은 큰 간격 탄소 에지 구멍 투성이 탄소막 없어야한다면 / 4 200 메쉬 관심 영역으로 스테이지를 정렬로부터 지역을 보호 돕기 위해 사용될 수있다 과다 노출 루틴을 집중하고 추적한다. </li><li> 글로우 방전 장치의 플랫폼에서 슬라이드를 놓습니다. 주 : 우리는 양극과 플랫폼이 진공 데시 케이 터로 가공되었고, 고주파 발생기에 의해 구동되는 내부 소자를 사용한다. 진공을 생성 한 후, 글로우 방전 그리드 1 분간 프로브에 양극과 전원에 고주파 발생기 프로브를 부착. 필요한 시간은 그리드 분 몇 초에 이르기까지 다양 글로우 방전합니다. 글로우 방전 시간을 가변하는 시료 농도없이 유리체 얼음 건조 나타나는 격자의 문제를 진단하는데 사용될 수있다. </li><li> 집게 세트와 그리드를 제거하고 집게가 탄성 B와 닫힌 된 자물쇠과. </li><li> 1.4에서 제조 된 minicells와 microcentrifuge 관에 10 나노 콜로이드 금 용액 100 μl를 추가하고 부드럽게 손가락으로 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 2.2 제조 그리드 혼합물의 새로운 피펫 장소 4 μL와. 주 : 콜로이드 금 크기와 치료의 다양한 가능 금의 크기는, 획득 된 확대 크기로 처리 될 현미경의 화소 사이즈 주어진보다 5 화소 인 것을주의해야한다 모호한 기능에 너무 크게되지 않는 반면 관심. </li><li> 플 런지 동결 장치를 준비; 액체 질소와 외부 냉동 컨테이너를 작성 후 액체 에탄과 내부 챔버를 입력합니다. 플런저로드에 그리드와 집게를 부착하고 상승 된 위치로 플런저로드를 잠급니다. 주 : 20 Iancu 등을 상업적 런지 냉동 장치의 사용을 설명하기위한 프로토콜.. </li><li> 신중 t하는 ​​여과지를 터치함으로써 그리드를 가릴그는 즉시 그리드를 동결, 플런저로드를 해제, 그리드 및 필터 종이 분리하여 정지 필터 종이에 심지 사이의 메 니스 커스 (meniscus)까지의 샘플 놓습니다. 조심스럽게 플런저로드에서 집게를 제거하고 그리드 홀더에 그리드를 배치합니다. </li><li> 액체 질소로 적재 영역과 흡수 펌프 용기를 충전함으로써 크라이 EM 전송 스테이션을 준비한다. 적재 영역은 그리드 홀더 적재 영역에서 현미경 시편 카트리지가 액체 질소 온도 장소되면. </li><li> 조심스럽게 이전 Polara 현미경 이상 모델에 C 스타일의 클립 링에 작은 나사 잠금 고리 중 하나 인 잠금 링을 제거; 집게를 사용하여 카트리지에 EM 그리드를 배치하고 부드럽게 그리드를 고정하는 카트리지에 다시 잠금 고리를 다시 연결합니다. </li><li> 현미경에서 여러 시편 홀더를 제거하고 전송 스테이션에 연결합니다. 카트리지 집게를 사용하여 표본 홀더에 카트리지를 배치적재 영역에서 홀더를 후퇴하고 현미경으로 다시 여러 시험편 홀더를 전송 거라고. 참고 :. 첸 등 21 2.1-2.9을 자세히 설명하는 시각적 프로토콜을 참조하십시오. </li></ol> 3. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 컬렉션 <ol><li> 낮은 배율지도의 컬렉션 <ol><li> SerialEM (10)의 &#39;네비게이터&#39;메뉴에서 &#39;열기&#39;를 클릭하여 새 탐색기 창을 엽니 다 (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM) </li><li> 허용 이미징 조건을 포함 그리드 사각형 찾기 (즉, 얇은 얼음, 아니 오염, 관심의 대상이) 낮은 배율에서 형광 스크린을 사용하여 (~ 2,300X minicell 표본에 대한). 참고 : [선택 :.이 단계는 전체 그리드를 montaging에 의해 SerialEM으로 자동화 할 수 있습니다, 그러나 그것은 단순히 수동으로 몇 지역을 선택 빠를 수 있습니다] </li><li> 다음 조정 50 °에 시편 홀더를 기울여 eucentric 높이로 단계를 조정XY 스테이지의 번역까지 Z-높이 기울어 기울지보기간에 최소이다. </li><li> 그리드 광장의 중심으로 이동하고 현재 단계의 위치를​​ 저장하기 위해 탐색기 창에서 &#39;추가 단계 순위&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 모두 허용 그리드 사각형 무대 위치가 저장 될 때까지 위의 단계 3.1.1-4를 계속합니다. </li><li> &#39;파일&#39;메뉴에서 &#39;새 몽타주&#39;를 클릭하여 새 몽타주 MRC 파일을 엽니 다. 열어 몽타주 설정 대화 상자에서 전체 그리드 광장 (표준 200 메쉬 그리드에 대한 예를 들어, 10 × 10)을 취득한다 X와 Y의 조각의 수를 선택합니다. &#39;대신 이미지 쉬프트의 스테이지를 이동&#39;및 라디오 버튼 &#39;조각 정렬하는 데 사용되는 상관 관계 건너 뛰기&#39;를 8 등 높은 비닝 (binning)을 사용하여 선택합니다. </li><li> 네비게이터 창에서 첫 번째 단계 위치를 클릭하고는 &#39;획득&#39;확인란을 선택하여 얻을 수 설정. 탐색기 창에서 각 단계의 위치에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 네비게이터는 &#39;네비게이터&#39;메뉴에서 &#39;포인트에서 획득&#39;를 클릭하여 대화 상자를 획득 엽니 다. &#39;획득 맵 이미지&#39;와 &#39;거친 eucentricity&#39;확인란을 선택하고 다른 모든 확인란이 체크되어 있는지 확인하십시오. 각 단계의 위치에서 몽타주를 수집하기 위해 &#39;진행&#39;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 틸트 - 시리즈 수집 <ol><li> 네비게이터 창에서 획득 한지도 중 하나를 선택하고 &#39;로드 맵&#39;버튼을 클릭합니다. </li><li> 네비게이터 창에서 틸트 - 시리즈를 취득하는지도에있는 버튼 &#39;점 추가&#39;를 선택 점을 클릭합니다. 그런 다음 버튼 &#39;포인트 추가 중지&#39;를 클릭합니다. 수집 된 각 맵에 대해 반복합니다. </li><li> 카메라 메뉴에서 &#39;매개 변수&#39;를 선택하고 초점, 시험 및 기록 모드에 대한 매개 변수를 정의합니다. [선택 :. 데이터가 기록 모드에 대한 매개 변수를 지정할 수 있습니다 투여 량 - 분획] </li><li> 탐색기 창에서 지점을 선택하고 &#39;틸트 - 시리즈를 확인9; 상자를 선택합니다. 매개 변수를 선택 열리는 틸트 - 시리즈 설정 대화 창에서 틸트 시리즈 수집을 위해 원하는. 탐색기 창에서 선택된 지점의 나머지 부분에 대한 반복하지만,지도를 선택하지 마십시오. </li><li> 탐색기 메뉴에서 다시 &#39;지점에서 취득&#39;을 선택합니다. 네비게이터 대화 선택 &#39;항목을 다시 정렬&#39;, 자동 초점 &#39;과&#39;거친 eucentricity 취득 &#39;예비 작업 등을하고&#39;틸트 시리즈를 취득 &#39;기본​​ 작업으로, 선택&#39;할 때 모든 열을 닫습니다 &#39;끝에 닫기 열 밸브 점으로 수집되었다. 틸트 - 시리즈를 진행하면 각 맵의 각 지점에서 수집됩니다. </li></ol></li></ol> 4. 높은 처리량 자동 기울기 시리즈 처리 및 재건 Tomoauto 사용 <ol><li> 용량 - 분획 데이터 빔에 의한 모션의 보정 [선택 사항] 참고 : Tomoauto는 MOTIONCORR 22 (http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.ht를 사용㎖) 용량 분획 현미경 사진에서 빔 유도 동작을 제거합니다. NOTIONCORR (16)이 시스템에 설치되어 있어야합니다. <ol><li> 명령을 실행 터미널에서 원래의 기울기 시리즈, 현재 작업 디렉토리에 SerialEM (10)의 출력 로그 및 개별 용량 분별 이미지 모두와 함께 : dose_fractioned_to_stack &lt;filename.st&gt; &lt;filename.st&gt; 처리 할 수있는 틸트 시리즈의 이름입니다. </li></ol></li><li> 틸트 - 시리즈의 정렬 및 재건 참고 : 기본적으로는 틸트 Tomoauto 계 자동화 기점 모델 생성, 정렬, 콘트라스트 전송 기능 (CTF), CTF 정정 (23)의 판정 처리 (http://bio3d.colorado.edu/imod/) IMOD (13)을 사용하고 재건. 또한 사용자는 자동 기점 모델 생성, CTF에 대한 (IMOD에 포함) RAPTOR (24)를 사용하는 tomoauto의 옵션이 있습니다FIND4 25 (http://grigoriefflab.janelia.org/ctf) CTF을 결정하고, tomo3d 26 (https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d) 재건 또는 소프트웨어 패키지의 조합에 의한에 구성. 각각의 패키지로 제공이 구성뿐만 아니라, 매개 변수는 로컬 구성 파일은 또한 특정 시료에 사용 세부 파라미터 수집하기 위해 생성 될 수 있지만 가장 일반적으로 실험실에서 사용 된 값에 맞게 편집 할 수있는 전역 구성 파일에서 처리 설정 또는 개별 틸트 시리즈. 사용하고자하는 모든 패키지는 시스템에 설치되어 있어야합니다. <ol><li> 현재 작업 디렉토리의 기울기 시리즈로, 터미널에서 명령을 실행 tomoauto --CTF --mode = 정렬 &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; &lt;filename.st&gt; 처리 할 수있는 틸트 시리즈 및 &lt;fid_diam&gt;는 diame입니다나노 미터의 기준 마커의 터. 이 명령은 정렬과 자동 기울기 시리즈의 CTF을 추정됩니다. 이 명령 --CTF 옵션을 제거하여 CTF 처리를 건너 뛸 수있다. </li><li> 배향 처리에있어서 임의의 에러를 시각적으로 두드러진 경사 배향 계를 조사하고 명령을 실행함으로써 추정 CTF 검사 : 3dmod &lt;파일 이름&gt; .ali submfg &lt;파일 이름&gt; _ctfplotter.com 각각, 여기서 &lt;파일 이름&gt; 접미사없이 기울기 시리즈의 이름입니다. 또한 얼라인먼트 품질 통계치 정량적 인 배향에 의해 생성 평균 예측 오차를 표시 tomoauto 명령의 출력을 확인. </li><li> 허용 정렬 주어진 명령을 실행하여 처리를 진행합니다 : tomoau에 --CTF --mode = 재구성 &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; 4.2.1에서와 같은 사용자와 대체. 이 명령은, CTF를 해결 기울기 시리즈에서 기준 마커를 지우고 재건을 계산합니다. 다시 CTF 처리는 4.2.1에서와 같이 건너 뛸 수 있습니다. </li><li> [선택] 육안 검사 단계를 건너 뛰고 완전히 처리 및 복원 명령을 실행 자동화하는 tomoauto --CTF &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; </li><li> [선택] 로컬 구성 파일을 생성하는 방법에 대한 tomoauto 문서를 참조하십시오, 특정 로컬 구성을 사용하여 다음 명령을 실행합니다 tomoauto [옵션] -L &lt;local_config&gt; &lt;filename.st&gt; &lt;fid_diam&gt; 여기서 &lt;local_config&gt;는 지역의 conf의 이름입니다프린터의 구성 파일. </li></ol></li></ol> 5. 하위 단층 평균화 참고 : 15은 (http://www.electrontomography.org/) 서브 단층 평균화 실험을 처리하기 위해, 그러나 프로토콜 설명 I3 패키지를 사용하는 대부분의 사용 가능한 서브 - 단층 평균화 소프트웨어 packages16to 프로세스 서브 단층 평균화 실험에 일반적으로 적용 그러나 대부분의 프로토콜은 사용 가능한 서브 단층 평균화 된 소프트웨어 패키지에 일반적으로 적용되는 16 ~ 18 기재. <ol><li> 현재 작업 디렉토리에 복원 된 단층 촬영으로 명령을 실행하여 입자 따기위한 단층 촬영을 엽니 다 tomopick &lt;파일 이름&gt; .rec 여기서 &lt;파일 이름&gt; 4.2.2과 같다. injectisome을 선택하고 tomogra의 조각을 통해 서민 위쪽 및 아래쪽 화살표 키를 사용하여 먼저 기초 신체 후 바늘 끝을 클릭 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 열리는 창에서엠. 이러한 방식으로 모든 볼 injectisomes을 선택합니다. 이 구조의 장축을 정의뿐만 아니라 세 개의 오일러의 두 구조의 배향을 나타내는 각도 추정 텍스트 파일의 좌표를 저장한다. </li><li> 계산적 추출 명령을 실행하여 정의 장축의 중앙에 중심을 단층 400 3 복셀 큐브 : 클립 크기 조정 -cx &lt;X&gt; -cy &lt;Y&gt; -cz &lt;Z&gt; -ix 400 -iy 400 -iz 400 &lt;파일 이름&gt; .rec &lt;파일 이름&gt; _001.mrc 여기서 &lt;X&gt;, &lt;Y&gt;, &lt;Z&gt; 구조의 중간 좌표는과 &lt;파일 이름&gt; 4.2.2과 같다. 추출 된 입방체의 크기는 사용 된 구조와 배율에 따라 다양해야하고, 충분히이 샘플 (400) 3 인 관심 복셀 구조를 묶 할만큼 충분히 커야한다. </li><li> 다운 샘플 (BIN) 명령을 실행함으로써, 초기 배향을위한 연산 시간을 줄이기 위해 4 배수로 서브 단층 : binvol -b 4 &lt;파일 이름&gt; _001.mrc &lt;파일 이름&gt; _001.bin4.mrc 여기서 &lt;파일 이름&gt; 5.2과 같다. </li><li> 결정된 오일러 서브 단층 촬영 각도에 적용하고 명령을 실행하여 초기 템플릿을 생성하기 위해 세계 평균을 계산한다. I3totsum.sh </li><li> 정렬하고 세포질 영역의 이진 분류 마스크를 사용하여 다운 샘플링 하위 단층 촬영을 분류합니다. 단층의 특성 누락 쐐기 아티팩트를 최소화하기 위해 푸리에 공간에서 서브 단층 평균을 수행합니다. 4 데이터를 비닝를 들어, SAMPFACT = &quot;4 4 4&quot;를 이용하시기 바랍니다. i3mramsacls.sh </li><li> 5.5 단계를 반복하여 서브 두 단층 촬영 (SAMPFACT = 배만큼 다운 샘플링# 34 2 2 2 &quot;)과 다시 한번 원래 데이터 (SAMPFACT =&quot;1 1 1 &quot;). i3mramsacls.sh </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

여기에 기술 된 고 처리량 방법이 1,917 크라이 틸트 계를 처리하고 그대로 S. 4,500 이상의 서브 단층 촬영을 생성 할 수있었습니다 flexneri 19 injectisome. 수집 된 데이터는 복잡한 정렬 세포질을 포함하여 현장 injectisome에서의 세부 특성화되었다. 방법은 또한 injectisome의 정렬 플랫폼의 구성을 명료하게 도왔다 추정의 단백질 성분의 특정 결실, 여러 돌연변이 세포를 시각화하기 위해 이용 하였다. 우리의 방법은 injectisome의 구조 - 기능 관계를 조사하기 위해 새로운 길을 제공했다. 그 결과, 새로운 스테이지 T3SS 매개 분비 기전을 기본 메커니즘 상기 절개에 대해 설정 하였다. 여기에 제시된 프로토콜은 그대로 S의 높은 처리량 극저온 동부 설명 flexneri,하지만 크라이 ET 적합한 어떤 프로젝트에 적...

유형 III 분비 시스템 (T3SS)는 많은 그람 음성 병원균에 필수적인 독성 결정이다. 또한 바늘 ​​착체라고도 injectisome은 진핵 숙주 세포를 1, 2로 박테리아에서 이펙터 단백질의 직접적인 전좌 필요한 중앙 T3SS 기계이다. injectisome가 외 바늘 기저 체 및 세포질 착체를 포함라고도 정렬 복잡한 3 등. 이전의 연구는 중요한 기초 체 단백질 (4, 5)의 원자 구조와 함께, 살모넬라 및 시겔로부터 정제 injectisomes의 3 차원 구조를 해명했다. 살모넬라, 시겔 라 (Shigella), 및 예 르시 니아에서 injectisomes의 동일계 구조 최근-ET 크라이 (6)에 의해 드러난 7. 그러나, 이펙터 선택 및 니들 어셈블리에 필수적인 세포질 단지는, 그 구조에 가시화되지 않았습니다. 곳을 알아내는 - 동부 MOS입니다(원위치) 네이티브 휴대 맥락 나노 해상도 기계 분자 이미징에 적합한 기술을 t. 그럼에도 불구하고, 극저온 동부에 의해 달성 해상도는 시편의 두께에 의해 제한된다. 단점을 극복하기 위해, 우리는 유 전적으로 크라이 동부 충분히 얇은 minicells을 생산하기 위해 수정 된 악성 시겔 flexneri 변형에 그대로 injectisomes 군데. 극저온 ET의 또 다른 한계는 매우 신속하게 샘플 고해상도 정보를 파괴 전자빔에 의한 조사에 시료의 감도이다. 적합한 투여 량은 전체 기울기 계 사이에 분산 될 수 있도록 그 결과, 매우 낮은 투여 량은 개개의 틸트 - 이미지에 사용된다. 이것은 매우 어려운 단층 소음의 다량에서 피사체의 구조적 특징을 구별 할 수있게하고 cryo-에 의해 달성 될 수있는 해상도를 제한 최종 재구성 된 신호 대 잡음비 (SNR)를 낮춘다 동부. Conventi이러한 푸리에 리얼 공간 필터로서뿐만 아니라, 다운 샘플링 ONAL 화상 처리는 콘트라스트를 높이기 위해 사용하지만, 고해상도 많은 정보를 필터링을 희생 할 수있다. 최근에는, 서브 - 단층 평균화 가능 크게 SNR을 증가시키고 서브 - 나노 미터 수준 (8, 9)에 어떤 경우에는 이후에 최종 해상도로했다. 착물의보다 상세한 분석이 가능해진다 계산적 함유 서브 단층 촬영 수천 추출하여 정렬하고 하위 단층 촬영을 평균 원래 단층 촬영 및 관심 분야는 높은 SNR 및 높은 해상도와 현장 복잡한 구조에서 결정합니다. 이러한 방법은 거대 분자 어셈블리와 네이티브 휴대 문맥에서의 동적 배좌에 더욱 통찰력을 제공하는 유전자 접근법과 통합 될 수있다. 일반적으로 수십 또는 서브 - 단층 촬영 천 수백 고 판정하기 위해 평균화 될 필요현장에서 -resolution 구조. 틸트 시리즈의 충분한 수의 인수는 서브 단층 촬영이 많은 빠르게 병목 현상이 생산하는 데 필요한. 그 결과 틸트 시리즈는 종종 재건하기 전에 정렬로 기울기 시리즈를 가지고 해결해야 빔에 의한 변화, 무대 반발뿐만 아니라, 확대, 회전 및 기울이기 결함에 의해 영향을 받는다. 틸트 시리즈는 일반적으로 또 다른 병목 현상을 일으키는 원인이 전통적으로 수동 기울기 시리즈의 검사를 통해 선택 추적 금 기준 마커,에 의해 정렬됩니다. 많은 소프트웨어 패키지 (11), (12), 틸트 계 정렬 및 재구성 (13) (14)와 서브 - 단층은 평균 15-18 컴퓨터 제어 전자 현미경 (10)을 통해 자동 기울기 계 획득을 위해 개발되어왔다. 이러한 패키지는 극저온 ET의 흐름에서 개별 작업을 처리, 그것은 SYSTEMA에 프로세스에 높은 레벨의 추상화를 구축하는 것이 바람직하게학적으로 하나의 파이프 라인으로 전체 체계를 간소화. 따라서 집중적으로 각 성분의 전체 구성을 유지하면서 간단한 사용자 조작을 허용 하나 반 자동화 기기에이 패키지의 번호를 정리하기위한 &quot;tomoauto&quot;소프트웨어 래퍼 라이브러리를 개발했다. 도서관은 온라인 원격 소스 코드 저장소 (http://github.com/DustinMorado/tomoauto)에 의해 오픈 소스, 잘 문서화 지속적으로 개발 및 사용을위한 자유롭게 사용할 수, 맞춤형 개발 또는 추가 통합이다. 이 높은 처리량 크라이 동부 파이프 라인 (S)에 그대로 injectisomes을 시각화하기 위해 이용되고있다 flexneri minicells. 1,917 단층 촬영의 총 서브 단층 (19)을 평균함으로써 결정 세포질 정렬 플랫폼을 포함한 컴퓨터 본래의 동일계 구조 고해상도을 드러내는,이 방법을 사용하여 생성 하였다. 함께 야생 타입 및 m-의 분자 모델링utant 기계는, 우리의 높은 처리량 파이프 라인은 네이티브 휴대 컨텍스트 손상 injectisome의 구조와 기능을 이해하기위한 새로운 수단을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>티로프틱 소이 국물</td><td>시그마-알드리치</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0692</td><td></td></tr><tr><td>전기천공법 장치</td><td>바이오 라드</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>1mm 큐벳</td><td>BTX</td><td>45-0124</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 극저온 튜브</td><td>열과학</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z336769</td><td></td></tr><tr><td>Holey Carbon Grids</td><td>Quantifoil (전자 현미경 과학)</td><td>Q2100CR2</td><td>R2/2 200 Cu</td></tr><tr><td>글로우 방전 장치</td><td>자체</td><td></td><td>상업용 대안</td></tr><tr><td>진공 데시케이터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z119016&nbsp;</td><td>사내 글로우 방전 장치에 사용</td></tr><tr><td>고주파 발전기</td><td>Electro-Technic 제품</td><td>BD-10A</td><td>는 사내 글로우 방전 장치에 사용됩니다. 주의 : 이 장치는 높은 볼륨을 생성합니다.tag에스.</td></tr><tr><td>원심분리기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>Dumont (전자 현미경 과학)</td><td>72705-D</td><td>스타일 5 항자성</td></tr><tr><td>Colliodal Gold</td><td>Aurion</td><td></td><td>BSA 10nm</td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td></td><td>#2</td></tr><tr><td>Ethane&nbsp;</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>질소</td><td>Matheson Tri-Gas</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>플런저 장치</td><td>사내</td><td></td><td>상용 대안 사용 가능한</td></tr><tr><td>극저온 그리드 보관 상자</td><td>전자 현미경 과학</td><td>71166-30</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>FEI</td><td></td><td>Tecnai Polara F30 (300KeV)</td></tr><tr><td>직접 감지 장치 카메라</td><td>Gatan</td><td></td><td>K2 Summit</td></tr><tr><td>Tomogram 인수 소프트웨어</td><td>SerialEM</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.eud/SerialEM 대안 : UCSF 단층 촬영, Leginon, FEI 배치 단층 촬영</td></tr><tr><td>빔 유도 모션 보정 소프트웨어</td><td>MOTIONCORR</td><td></td><td>http://cryoem.ucsf.edu/software/driftcorr.html 에는 >2GB Nvidia GPU</td></tr><tr><td>틸트 시리즈 정렬 소프트웨어가</td> <td>필요합니다.IMOD</td><td></td><td>http://bio3d.colorado.edu/IMOD 대안 : XMIPP, Protomo</td></tr><tr><td>자동 기준 마커 모델링 소프트웨어</td><td>IMOD</td><td></td><td>대안 : RAPTOR (IMOD0 에 포함됨 (tomoauto에서 사용 가능)</td></tr> <tr><td>CTF 결정 소프트웨어</td><td>IMOD</td><td></td><td>대안 : CTFFIND http://grigoriefflab.janelia.org/ctf (토모오토에서 사용 가능)</td></tr><tr><td>틸트 시리즈 재구성 소프트웨어</td><td>tomo3d</td><td></td><td>https://sites.google.com/site/3demimageprocessing/tomo3d 대안 : IMOD, XMIPP http://xmipp.cnb.csic.es, Protomo</td></tr><tr><td>틸트 시리즈 자동화 처리 소프트웨어</td><td>tomoauto</td><td></td><td>https://github.com/DustinMorado/tomoauto</td></tr><tr><td>입자 따기 소프트웨어</td><td>i3</td><td></td><td>http://www.electrontomography.org 대안 : IMOD</td></tr><tr><td>하위 볼륨 평균화 소프트웨어</td><td>i3</td><td></td><td>대안: PEET http://bio3d.colorado.edu/PEET, Dynamo https://dynamo.bioz.unibas.ch, PyTom http://pytom.org</td></tr></tbody></table>

tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Using Tomoauto: A Protocol for High-throughput Automated Cryo-electron Tomography

Cryo-electron tomography (Cryo-ET)는 분자 수준에서 기본 컨텍스트에서 고분자 복합체를 시각화하기 위한 강력한 3차원(3-D) 이미징 기술입니다. 이 기술은 초기에 표본을 유리체 얼음에서 급속히 동결시켜 샘플을 원래 상태로 보존한 다음, 고배율로 다양한 각도에서 일련의 현미경 사진을 수집하고, 마지막으로 3D 밀도 맵을 계산적으로 재구성하는 것을 포함합니다. 동결된 수화된 표본은 전자빔에 매우 민감하기 때문에 방사선 손상을 제한하기 위해 매우 낮은 전자량으로 현미경 사진을 수집합니다. 그 결과, 원시 초저온 단층촬영은 본질적으로 노이즈가 있는 이미지를 특징으로 하는 매우 낮은 신호 대 잡음 비율을 갖습니다. 관심 피사체를 더 잘 시각화하기 위해 기존 이미징 분석 및 초기 단층 촬영에서 피험자의 하위 단층 촬영을 추출하고 정렬 및 평균화하는 하위 단층 촬영 평균을 사용하여 대비와 해상도를 모두 개선합니다. tilt-series의 대규모 데이터 세트는 다양한 상태, 조건 또는 돌연변이에서 복합체를 이해하고 해결하는 데 필수적일 뿐만 아니라 평균화 및 분류를 위한 충분한 양의 하위 단층 도선 컬렉션을 얻는 데 필수적입니다. 이 데이터를 수집하고 처리하는 것은 추가 분석을 방해하는 주요 장애물이 될 수 있습니다. 여기에서는 컴퓨터 제어 300kV 초저온 전자 현미경, 직접 검출 장치(DDD) 카메라 및 자체 개발한 매우 효과적인 반자동 이미지 처리 파이프라인 소프트웨어 래퍼 라이브러리 tomoauto를 기반으로 하는 고처리량 cryo-ET 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 Shigella flexneri minicell에서 손상되지 않은 III형 분비 시스템(T3SS)을 시각화하는 데 효과적으로 활용되었습니다. cryo-ET에 적합한 모든 프로젝트에 적용할 수 있습니다.

minicells S의 샘플 flexneri 수집 및 그림 2에 설명 된 파이프 라인을 다음 tomoauto 사용하여 회로도 그림 1에서 보여로 처리했다. 틸트 시리즈는 낮은 배율 몽타주 맵에 사용자가 지정한 지점에서 높은 처리량 틸트 계 취득 가능 SerialEM (10) (도 3)를 사용하여 수집 하였다. 현미경은 빔 유도 모션 22 (도 4)을 감소시키기 위해 직접 검출 장치의 카메라에 용량 분별 모드를 사용하여 수집 하였다. Tomoauto MOTIONCORR 22는 각 처리 용량 분획 현미경 사진의 컬렉션을 복용하는 움직임 보정을 조정 및 틸트 - 시리즈로 결과를 상기 (동영상 1) 처리...

우리는 분자 기계 구조의 동일계에서 높은 해상도를 결정하기 위해 높은 처리량 극저온 전자 단층을 활용하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 일반적인 병목 현상을 회피, 대용량의 데이터가 처리 될 수있게하고, 사용자가 중요한 생물학적 질문에 집중할 수 있도록 자원 중단 시간을 감소시킨다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

Cryo-electron tomography (Cryo-ET) is a powerful three-dimensional (3-D) imaging technique for visualizing macromolecular complexes in their native ...

이 절차의 전반적인 목표는 사용자가 초고속 저온 전자 토모그래피 수집 및 처리 파이프라인을 구축하도록 돕는 것입니다. 이 방법은 차세대 검출기로 수집한 데이터를 어떻게 처리하며, 자동 틸트 시리즈 수집 소프트웨어로 생성된 방대한 양의 데이터를 어떻게 처리할 것인가와 같은 저온 전자 토모그래피 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 여러 소프트웨어 패키지를 통합된 방식으로 구성하여 자동 틸트 시리즈 처리를 위한 효율적인 파이프라인을 찾을 수 있으며, 이를 통해 토모그램 분석에 더 많은 시간을 할애할 수 있다는 점입니다.일반적으로 cryo-ET를 처음 접하는 연구자들은 전자현미경에서 생성되는 방대한 데이터를 처리하는 데 필요한 수많은 번거로운 단계들로 인해 어려움을 겪습니다. 저희는 5년 전, 박테리아 하나에 대한 3D 재구성을 얻기 위해 수백 개의 단계를 수동으로 거쳐야 했을 때 처음으로 이번 개발에 대한 아이디어를 얻었습니다. 사전에 Shigella flexneri 미니셀 준비에 관한 텍스트 프로토콜을 참고하시기 바랍니다.그런 다음, 기존 JoVE 논문에 설명되어 있고 텍스트 프로토콜에도 기록된 방식에 따라 전자현미경 그리드를 준비합니다. 유리질 얼음(vitrified ice)에 내포된 미니셀 집합체를 EM 스테이지에 로딩한 후, 틸트 시리즈(tilt-series)를 위한 저배율 맵 수집을 시작합니다. 약 2300배의 저배율로 형광 스크린을 관찰하면서 이미징에 적합한 그리드 영역을 찾습니다.이 위치에는 오염물이 없는 얇은 얼음과 관심 대상이 포함되어 있어야 합니다. 다음으로, 시야를 격자 사각형의 중앙으로 조정한 후, Add Stage Position 버튼을 클릭하여 해당 위치를 저장하십시오. 그런 다음, 사용 가능한 모든 격자 사각형의 위치가 저장될 때까지 이 과정을 반복하십시오.다음 단계는 새로운 몽타주 파일을 여는 것으로 시작합니다. 설정 대화 상자에서 전체 그리드 사각형이 캡처되도록 X 및 Y 값을 설정하십시오. 표준 200 mesh 그리드의 경우, Binning 값을 8과 같이 높게 설정하여 10 by 10 공간을 만듭니다.또한 이미지를 이동시키는 대신 스테이지를 이동시키는 옵션과 조각들을 정렬하는 데 사용되는 상관관계 건너뛰기 옵션을 전환하십시오. 이제 Navigator 창에서 Acquire 토글을 사용하여 획득할 첫 번째 스테이지 위치를 선택하십시오.

using-tomoauto-protocol-for-high-throughput-automated-cryo-electron

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

가까운 원시 상태에서 세균 세포의 ultrastructure 연구를 전자 cryotomography (요법)를 사용하는 방법을 우리는 "macromolecular"(~ 4 NM) 해상도, 여기를 보여줍니다.

세균성 세포의 전자 Cryotomography

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

우리는 수집하고 전체 미토콘드리아의 프로세스 전자 크라이 단층 촬영하는 방법에 대한 프로토콜을 제시한다. 기술은 네이티브 생체막 큰 세포막 단백질 복합체의 구조, 기능 및 구성에 대한 자세한 통찰력을 제공한다.

전자 곳을 알아내는-단층 촬영에 의한 미토콘드리아에서 ATP 합성 효소 이량 체의 시각화

극저온 전자 단층 촬영에서 대규모 데이터 수집에 대한 수요가 증가함에 따라 처리량이 높은 이미지 수집 루틴이 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 지형 데이터 수집의 시간 효율성과 처리량을 최대화하기 위한 고급 인수 전략의 최근 개발을 구현하는 프로토콜입니다.

극저온 전자 단층 촬영 데이터 수집 최적화를 위한 전략

이 프로토콜은 구조적으로 보존된 크로마틴에서 복제 부위의 고해상도 매핑을 위한 기술을 제시하며 , 이 기술은 사전 임베딩 EdU-스트렙타비딘-나노골드 라벨링과 ChromEMT의 조합을 사용합니다.

전자 단층 촬영에 의한 초구조적으로 보존 된 크로마틴의 복제 도메인 이미징

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

본 프로토콜은 Tomo5를 사용한 고분해능 초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집과 emClarity를 사용한 후속 데이터 처리 및 서브 단층 촬영 평균화를 설명합니다. 아포페리틴은 2.86 Å 분해능에서 cryo-ET 구조를 달성하기 위한 자세한 단계별 프로세스를 설명하기 위한 예로 사용됩니다.

초저온 전자 단층 촬영 원격 데이터 수집 및 서브 단층 촬영 평균화

Cryo-STEM 단층촬영은 임베딩, 절편 또는 기타 침습적 제제 없이 손상되지 않은 세포의 세포 소기관을 시각화하는 수단을 제공합니다. 얻어진 3D 해상도는 현재 수 나노미터 범위이며, 시야는 수 마이크로미터이고 접근 가능한 두께는 1μm 정도입니다.

Cryo-STEM 단층촬영에 의한 세포 소기관 In Situ 의 시각화

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

온 - 칩 photopolymerization 기술을 사용하여 폴리머 microarray의 형성에 대한 설명입니다. 원자 힘 현미경, 물 접촉 각도 측정, X-선 광전자 분광법 및 비행 차 이온 질량 분광법과 세포 부착 분석 시간을 사용하여 높은 처리량 표면 특성도 설명되어 있습니다.

Biomaterials 높은 처리량 발견을위한 폴리머 Microarrays

학습하세요 고해상도 원위 구조 분석을 위한 고처리량 냉동전자단층촬영법을 Shigella flexneri 미니세포에 적용하여 자동화된 데이터 처리 파이프라인을 구축하는 방법을. 이 기술은 연구자가 방대한 데이터를 효율적으로 처리하고 생물학적 질문에 집중할 수 있게 합니다.

Tomoauto 사용 : 프로토콜 높은 처리량 자동화 된 곳을 알아내는 - 전자 단층 촬영을 위해

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