마우스 림프종 모델의 모니터링 종양의 진행과 치료 효과에 대한 생물 발광 기반 종양 정량 방법

이 이미징 절차의 전반적인 목표는 생물발광 획득 절차와 이미지 분석을 표준화하여 서로 다른 실험 내 또는 실험 간 비교를 위한 정량적 데이터를 얻는 것입니다. 이 방법은 이미징 데이터를 어떻게 재현 가능한 방식으로 정량화할 수 있는가와 같이, 생물발광 이미징 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생물발광 이미저를 보유한 모든 동물 시설에서 쉽게 설정할 수 있으며, 복잡한 계산이 필요하지 않다는 점입니다.

이미징 장치를 켜고, Acquisition 소프트웨어를 엽니다. Initialize를 클릭하여 카메라, 스테이지 및 렌즈를 초기화합니다. 다리 꼬집기 반응이 없는 것을 통해 적절한 진정 수준을 확인한 후, 마우스를 워밍 패드 위에 올리고 안연고를 도포합니다.

그런 다음, 25 gauge 바늘을 사용하여 갓 조제한 D-Luciferin potassium salt 용액 100 µL를 복강 내로 주입합니다. 이 경우, 종양 세포는 firefly luciferase를 발현합니다. 이 단백질은 D-Luciferin을 산화시켜 이미지 분석기로 검출 가능한 빛을 생성합니다.

10분 후, 마우스를 복와위(prone) 상태로 이미지 촬영기 안에 놓고, 등이 카메라를 향하도록 가능한 한 평평하게 배치합니다. 자동 노출 기능을 선택하고 Acquire를 클릭하여 동물의 후면 이미지를 획득합니다. 그 다음, 마우스를 앙와위(supine) 상태로 놓고 앞다리를 벌려 가슴 부위를 가리지 않도록 합니다.

자동 노출 체크박스가 여전히 선택되어 있는지 확인하고 동물의 전면 이미지를 획득하십시오. 그 후, 마우스가 완전히 회복될 때까지 가온 패드 위에 두었다가 케이지로 돌려보냅니다. 생체 발광을 정량화하려면 메뉴에서 View를 클릭하고, Tool Palette가 표시되지 않은 경우 이를 선택하십시오.

다음으로, 관심 영역(region of interest) 도구 탭을 클릭하고, 윤곽선(contour) 버튼을 선택한 후 '자유 그리기(Free Draw)'를 선택하십시오. 자유 그리기 도구를 사용하여 정면 뷰 이미지에서 마우스 전체 또는 특정 영역의 가장자리를 따라 관심 영역을 표시하고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 윤곽선을 닫습니다. 이미지 왼쪽 상단의 단위 스크롤 메뉴에서 Radiance가 선택되어 있지 않은 경우 이를 선택하십시오.

그 다음, Total Flux photons per second 상자의 값을 읽어 광자 플럭스(photon flux)를 측정합니다. 그런 다음, View 메뉴에서 region of interest measurements를 클릭합니다. 배면 이미지에 대해 분석을 반복한 후, 두 뷰에서 획득한 광자 플럭스 값을 합산하여 루미노스코어(luminoscore)를 구합니다.

본 실험에서는 주입 후 10분 만에 종양을 검출할 수 있었습니다. 영상만으로도 종양 세포가 정확한 위치에 존재함을 확인할 수 있습니다. 하지만 생물 발광을 정량화함으로써 주입을 받은 동물과 받지 않은 동물 사이에 분명한 차이가 있음을 입증하였습니다.

흥미롭게도, 피하 모델에서 얻은 신호는 주입된 세포 수와 일치하게 일차 안구 림프종 모델보다 100배 더 높았습니다. 여기서 대조군과 CpG 처리된 일차 안구 림프종 마우스의 대표적인 종양 성장 이미지는 충분한 시간이 지난 후 대조군에서 전이가 나타나기 시작함을 보여줍니다. 일차 종양은 치료에 민감하게 반응하지 않는 것으로 보였으나, CpG 처리군에서는 전이가 더 적게 관찰되었습니다.

실제로 각 그룹의 종양 부담을 정량적으로 분석한 결과, CpG가 종양 발달을 늦추는 것으로 나타났으며, 28일 후 처리군과 대조군 간의 종양 발광 정도에서 통계적으로 유의미한 차이가 확인되었습니다. 이 피하 모델에서는 마우스의 양측에 각각 두 개의 종양을 이식하였으며, 0일째에 한쪽 측면에만 in situ로 처리를 수행하고 반대편 종양을 대조군으로 사용하였습니다. 이후 마우스당 두 개의 관심 영역(region of interest)을 설정하여 처리측과 대조측의 luminoscore 비율을 측정하였습니다.

처치 투여 13일 후, luminoscore 비율이 유의미하게 감소한 것이 관찰되었으며, 이는 해당 종양이 흡수되었음을 나타내며 대응하는 생체 발광 이미지에서도 추가로 확인되었습니다. 일단 투여가 완료되면, 적절하게 수행할 경우 동물당 2분 이내에 이 분석을 마칠 수 있습니다. 이 절차 이후에는 종양 세포의 호밍(homing) 또는 전이 메커니즘에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 종양 부위의 정성적 위치 파악과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 연구자들과 생체 발광 이미징 분야는 전임상 소동물 모델에서 종양 진행 과정을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 재현 가능한 방식으로 종양 부담을 정량화하기 위해 생체 발광 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 소동물 및 수술 도구를 다루는 작업은 매우 위험할 수 있으며, 이 절차를 수행할 때는 도구의 적절한 멸균과 같은 예방 조치를 항상 취해야 함을 잊지 마십시오.