모델로 제브라 피쉬는 아질산염의 기형 가능성을 평가하는

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 배아를 아질산염으로 처리하고 기형 유발 효과를 결정하는 것입니다. 이 방법은 배아 발달에 대한 화학 물질의 기형 유발 효과 평가와 같은 발달 독성학 분야의 몇 가지 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 절차의 가장 큰 장점은 외부에서 발달하고 현미경으로 관찰할 수 있는 제브라피시 배아를 사용한다는 것입니다.

여기에 시연된 실험을 위해 Tuebingen 균주와 같은 야생형 제브라피시 균주를 섭씨 28.5도에서 유지하고 각각 14시간 및 10시간의 명암 주기를 유지합니다. 알을 수확하기 전날 밤, 물고기 물과 칸막이를 짝짓기 탱크에 넣고 수컷과 암컷 물고기를 칸막이의 별도 면에 놓습니다. 충분한 알을 생산할 수 있도록 30쌍의 물고기를 준비하십시오.

다음날 아침, 불을 켠 후 칸막이를 제거하여 짝짓기를 시작하십시오. 15분마다 짝짓기 탱크에 알이 있는지 확인하십시오. 물고기가 알을 낳으면 차 여과기를 사용하여 배아를 채취하고 E3 완충액이 있는 큰 용기에 모두 결합합니다.

알을 섭씨 28.5도에서 부화시킵니다. 수정 후 1.5시간(HPF)이 되면 해부 현미경으로 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 불투명하게 보이는 수정되지 않은 난자를 버립니다. 각 처리 조건에 대해 50ml의 E3 완충액을 포함하는 100 x 15mm 유리 페트리 접시에 각각 50개의 배아를 3배로 옮깁니다.

예를 들어, 11가지 치료 조건의 경우 각각 50개의 배아로 구성된 33가지 요리를 준비합니다. 2 HPF에서 배아의 페트리 접시 3개에 E3 완충액을 제거하고 E3 완충액에 희석된 300밀리몰 에탄올 50밀리리터를 추가합니다. 에탄올의 증발을 최소화하기 위해 파라 필름으로 접시를 덮으십시오.

에탄올 완충액에 배아를 섭씨 28.5도에서 22시간 동안 배아를 배양한 다음 용액을 제거하고 E3 완충액을 사용하여 에탄올을 씻어내고 접시를 여러 번 휘젓습니다. 세탁을 두 번 더 반복합니다. 2 HPF에서 배아의 페트리 접시 3개에 E3를 제거하고 50ml의 새 E3로 교체합니다. 2 HPF에서 9 개의 페트리 접시의 경우 E3를 제거하고 E3에 용해 된 1, 000 밀리그램 당 아질산 나트륨 50 밀리리터를 추가하고 섭씨 28.5도에서 배양하여 매일 아질산 나트륨 용액을 교체합니다.

46시간 후, 아홉 개의 아질산나트륨 플레이트 중 세 개를 제거하고, 용액을 제거한 다음, E3 버퍼를 사용하여 플레이트를 세 번 세척합니다. 24시간 후에 인큐베이터에서 세 가지 다른 아질산나트륨 플레이트를 제거하고, 용액을 제거한 다음, 새로운 E3 버퍼를 사용하여 배아를 세 번 세척합니다. 24시간 후, 마지막 세 플레이트에 대해 유사한 세척 단계를 수행합니다.

다음으로, 3개의 페트리 접시로 구성된 또 다른 세트의 경우 E3 버퍼를 아질산나트륨 밀리리터당 200밀리그램으로 교체한 다음 아질산나트륨 밀리리터당 400, 600, 800 및 1, 000밀리그램으로 각각 50개의 배아로 구성된 3개의 접시 그룹을 설정합니다. 배아를 70시간 동안 배양하고 매일 아질산나트륨 용액을 교체하십시오. 배양 후 플레이트에서 용액을 제거하고 E3 버퍼를 사용하여 플레이트를 세 번 세척합니다.

배아의 또 다른 3개의 페트리 접시의 경우, E3 완충액을 E3 완충액에서 질산나트륨 1밀리리터당 50밀리그램, 000밀리그램으로 교체하십시오. 배아를 70시간 동안 노출시킨 후 이전에 시연된 대로 E3를 사용하여 배아를 세척합니다. 매일 노출되는 동안, 실체 현미경으로 죽은 배아의 수를 세어 1분 동안 관찰한 후 심장 박동과 혈액 순환이 부족하거나 이동성이 떨어지는지 확인합니다.

죽은 배아를 제거하십시오. 실험이 끝나면 유충을 안락사시키기 위해 이동 피펫을 사용하여 E3 완충액을 제거한 다음 0.2%MS-222 50ml를 넣고 10분 동안 배양합니다. MS-222를 제거하기 위해 E3를 한 번 세척한 후 배아를 적절하게 피펫팅할 수 있도록 약간의 부피를 남기고 유충을 4%PFA에 추가하고 접시를 여러 번 휘젓고 전사 피펫을 사용하여 유충을 바이알을 채울 수 있을 만큼 충분한 PFA가 있는 유리 바이알에 넣습니다.

그런 다음 밤새 냉장고에 유충을 고정하십시오. 고정 후 입체경과 디지털 카메라를 30X 배율로 사용하여 유충의 사진을 촬영합니다. 앞쪽이 왼쪽에 있고 등쪽 표면이 필드의 맨 위에 있도록 유충의 방향을 지정합니다.

300밀리몰 에탄올에 22시간 동안 노출된 것은 생존에 영향을 미치지 않았으며, 이는 이전 결과와 일치했다. 여기에서 볼 수 있듯이 관찰된 표현형에는 심낭 부종과 수영 방광 비팽창이 포함되었습니다. 두개골 안면 결함 및 발달 지연도 관찰되었으며 여기에는 표시되지 않았습니다.

아질산나트륨으로 처리하면 농도에 따라 생존율에 경증에서 중증의 영향을 미쳤으며, 아질산나트륨의 농도가 높을수록 생존율이 낮아졌습니다. 이 수치는 밀리리터당 1, 000밀리그램과 같은 더 높은 농도에서 더 긴 배양 시간이 생존에 더 심각한 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 여기에서 볼 수 있듯이 질산염 처리된 물고기와 달리 아질산염 처리된 유충은 발달 결함이 있습니다.

이 기술을 숙달하면 3시간 안에 완료할 수 있으며 오염을 최소화하기 위해 매일 배아를 제거하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 유전자 발현을 평가하기 위해 현장 교잡과 같은 다른 방법을 수행할 수 있습니다. 이 기술은 연구자들이 제브라피쉬의 발달에 대한 화학 물질의 기형 유발 가능성을 탐구하기 위한 교감입니다.