표적 스르나의 파지 매개 배달에 유전자 발현을 허물고 구축 E. 대장균

이 절차의 전반적인 목표는 증가하는 대장균 개체군에서 관심 유전자를 제거하는 것입니다. 유전자 넉다운(gene knockdown)은 유전자 기능에 대한 기본적인 질문을 탐구하는 데 자주 사용됩니다. 이러한 방법은 합성 생물학에도 적용될 수 있습니다.

예를 들어, 독성 인자와 같은 원치 않는 유전자를 침묵시키는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 사전 유전자 변형 없이 E.coli의 배치 배양에서 수행할 수 있으며 몇 시간 후에 결과를 관찰할 수 있다는 것입니다. 먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 설계된 sRNA 발현 카세트를 포함하는 플라스미드를 사용하여 발현 카세트에서 24-염기쌍 가이드 서열을 먼저 식별하여 서열에 대한 부위 지시 돌연변이 유발을 수행합니다.

기존 sRNA 카세트와 상동성의 짧은 영역을 가진 정방향 및 역방향 프라이머를 설계하고 합성하여 새로운 24-염기쌍 가이드 염기서열과 나란히 합니다. LB에 5ml의 E.coli 배양액과 주형 sRNA 발현 파지미드를 함유한 항생제를 준비합니다. 섭씨 37도에서 밤새 흔들면서 세포를 성장시킵니다.

배양물에서 template sRNA phagemid 를 추출하고 정제한 후, sRNA phagemid 및 고충실도 중합효소에 권장되는 DNA 템플릿의 10-50배를 사용하여 두 가지 PCR 반응을 준비합니다. 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 하나의 반응을 준비합니다. 표준 PCR 조건을 사용하여 반응을 실행한 후 마이크로 원심분리 튜브에서 두 반응을 결합합니다.

그런 다음 끓는 수조에서 섭씨 98도까지 가열하여 제품을 어닐링합니다. 즉시 열원을 끄고 다음 1-2시간 동안 수조가 천천히 실온으로 돌아오도록 합니다. 돌연변이가 없는 템플릿 sRNA를 제거하려면 혼합물에 1마이크로리터의 DpnI 제한 효소를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 또는 완전한 분해를 위해 제조업체가 권장하는 시간 동안 배양합니다.

다음으로, 어닐링된 PCR 산물 1-5마이크로리터로 화학적으로 수용적인 E.coli 세포를 형질전환시킵니다. 그런 다음 항생제로 LB 플레이트에 선택적 도금을 하여 단일 콜로니를 분리합니다. 콜로니 PCR과 올바른 가이드 서열의 통합을 확인합니다.

200마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 단일 형질전환된 콜로니에서 소량의 세포를 수집합니다. 수집된 세포를 마이크로 원심분리기 튜브에 있는 50마이크로리터의 뉴클레아제가 없는 물에 넣고 피펫팅으로 혼합합니다. 그런 다음 탁상용 열순환기 또는 끓는 수조를 사용하여 섭씨 95도까지 2분 동안 가열하여 세포를 용해합니다.

용해된 세포 1마이크로리터를 DNA 템플릿으로 사용하여 여기에 표시된 조건에 따라 PCR을 수행합니다. 올바른 가이드 염기서열을 확인한 후 5ml 배양액에 올바른 sRNA 클론을 접종하고 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음 날, 스크류캡 크라이오튜브에서 750마이크로리터의 하룻밤 배양물과 250마이크로리터의 60% 글리세롤을 결합하여 글리세롤 스톡을 준비합니다.

M13 패키징된 phagemid stock을 준비하기 위해, sRNA 발현 파지미드를 운반하는 E.coli의 5ml 오버나이트 배양물을 준비합니다. 또한 M13KO7 헬퍼 플라스미드를 운반하여 5밀리리터의 대장균 하룻밤 배양을 준비합니다. 다음 날, DNA를 정제한 후 화학적으로 유능한 E.coli를 각각 1마이크로리터의 sRNA 발현 phagemid 및 helper plasmid와 동시 형질전환시킵니다.

LB-한천에 항생제를 투여하여 두 가지 구조에 대해 선택합니다. 파게미드 발현은 세포에 큰 적응 부담을 주며 형질전환 효율을 저하시킬 수 있습니다. 플라스미드를 두 가지 순차적인 형질전환 단계로 도입해야 할 수도 있습니다.

형질전환된 세포를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양한 후, 동시 형질전환된 균주의 단일 콜로니에서 10mL 배양을 준비합니다. 다음 날 아침, 3300 x g에서 10분 동안 배양물을 원심분리합니다. 상층액을 모으고 0.2 미크론 필터를 통해 필터링합니다.

포장된 phagemid 여과액을 섭씨 4도에서 보관하십시오. F+표적 세포를 준비한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 단일 콜로니에 5밀리리터 LB 배지 배양액에 항생제를 접종하고 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 흔들면서 성장합니다. 다음 날, 5ml의 선택적 LB 배지를 사용하여 F+ 표적 세포를 1-100 회 희석하고 배양을 계속합니다.

로그 상 성장을 나타내는 0.3의 OD600이 얻어질 때까지 약 2시간 동안 세포를 배양합니다. 침묵을 목표로 하는 세포는 효율적인 phagemid 감염을 위해 F pilus 침묵이 발현될 때 기하급수적 단계에 있어야 합니다. 1-100 비율의 M13 패키징 파지미드를 표적 세포에 첨가하면 표적 집단의 거의 99%가 감염될 수 있습니다.

감염이 섭씨 37도에서 30-60분 동안 흔들면서 진행되도록 합니다. 그런 다음 원하는 대로 sRNA 침묵 표현형을 분석합니다. 이 비디오에서 시연된 프로토콜에 따라 플라스미드 pAB의 sRNA 침묵 카세트.

001이 mKate2를 대상으로 변경되었습니다. 이 그림은 항-mKate2 파게미드에 감염된 대장균 균주가 배경에서 검출 가능한 mKate2 형광을 보이지 않았음을 보여줍니다. 그러나 이 균주는 GFP를 발현하여 파지미드의 성공적인 흡수를 나타냅니다.

이 실험에서는 염색체가 통합된 클로람페니콜 아세틸전이효소 또는 CAT 유전자를 가진 대장균 균주를 CAT를 표적으로 하는 파게미드에 감염시키고 클로람페니콜 내성의 sRNA 침묵을 테스트했습니다. phagemid targeted CAT가 검출된 세포는 낮은 클로람페니콜 농도에서 생존율이 감소하였고, 높은 농도에서는 거의 99%가 사멸하였다. 반면에, 감염되지 않은 세포 또는 mKate2를 침묵시킨 sRNA에 감염된 세포는 테스트된 모든 농도에서 클로람페니콜에 내성이 있었습니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 파지미드를 운반하는 박테리아만을 선별하는 데 사용되는 암피실린을 첨가하면 클로람페니콜의 생존율이 검출되지 않는 수준으로 감소했습니다. sRNA 표적 유전자를 변경하고 감염된 파게미드를 생성하는 것은 5일 안에 완료할 수 있습니다. 파지로 작업하는 것은 실험실의 다른 실험에 매우 위험할 수 있으며, 원치 않는 오염을 방지하기 위해 이 절차를 수행하는 동안 항상 전용 실험기구 사용과 같은 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

이 비디오를 시청한 후에는 활발하게 증가하는 대장균 개체군에서 관심 유전자를 제거하기 위해 sRNA를 지닌 감염된 파지미드를 설계, 복제 및 생산하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.