DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고처리량 염기서열분석을 통해 동물 세포에서 관심 단백질과 관련된 게놈 DNA 염기서열을 검출하는 것입니다. 이 기술은 핵 조직 및 포유류 세포의 전사 또는 조절 연구에서 핵 아밀로이드 또는 특정 전사 인자와 관련된 게놈 영역을 식별하는 것과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량 염기서열분석이 DNA 마이크로어레이를 사용하여 원래 DamID 자산보다 더 높은 분해능을 제공한다는 점과 이 기술을 통해 고처리량 염기서열분석 데이터를 사용한 교차 분석이 가능하다는 것입니다.

이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Brennan Olson입니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 따라 관심 유전자를 DamID 벡터에 복제합니다. 다음으로, 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 DamV5 POY 및 V5-Dam을 발현하는 렌티바이러스 스톡을 생성합니다.

제조업체의 프로토콜에 따라 forward transfection 절차에 따라 DamID 벡터를 lentiviral packaging plasmid와 동시 transfection합니다. 영점 45미크론 PVDF 필터를 사용하는 여과 단계를 포함해야 합니다. 이제 세포를 렌티바이러스로 감염시킬 준비를 한다.

하루 전에 부착 세포를 6웰 플레이트에 전달합니다. 항생제를 계속 사용하십시오. 목표는 다음 날 감염에 대해 50%의 합류도를 갖는 것입니다.

다음 날, 냉동실에서 얼어붙은 DamV5 POY 및 V5-Dam 렌티바이러스 상등액을 꺼내 섭씨 37도의 수조에 넣어 해동합니다. 배양 플레이트에서 성장 배지를 제거하고 항생제가 없는 반 밀리리터의 신선한 성장 배지로 교체합니다. 그런 다음 웰에 해동된 렌티바이러스 1밀리리터를 로드합니다.

V5-Dam으로 2개의 웰, DamV5 POY로 2개의 웰, 렌티바이러스가 없는 2개의 웰을 음성 대조군으로 로드합니다. 용액을 세포에 소용돌이치고 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다. 24시간 후, 세포의 바이러스 현탁액을 항생제가 없는 2ml의 성장 배지로 교체합니다.

그런 다음 48시간 동안 더 배양을 계속합니다. 이틀 후, 텍스트 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 분리하여 이 프로세스를 완료하며, 이 작업은 약 한 시간이 소요됩니다. 그런 다음 게놈 DNA에서 아데닌 메틸화 DNA 단편을 증폭합니다.

이 프로세스는 약 2-3일이 소요되며 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 다룹니다. 이 절차를 위해 먼저 증폭된 아데닌 메틸화 DNA를 단편화합니다. DNA Fragmentase를 사용하기 전에 먼저 강도를 측정하여 적절한 분해 시간을 결정하는 것이 중요합니다.

이 진단 검사에는 사용 가능한 정제 메틸 PCR 제품을 사용하십시오. 먼저 6마이크로그램의 DNA, 12마이크로리터의 10X 프편분해효소 완충액으로 구성된 마스터 믹스를 설정하고 114마이크로리터의 물로 채웁니다. 그런 다음 Fragmentase 스톡을 3초 동안 볼텍스하고 마스터 믹스에 6마이크로리터를 추가하여 총 120마이크로리터를 만듭니다.

그런 다음 3초 동안 마스터 믹스를 소용돌이칩니다. 이제 5개의 반응 튜브에 20마이크로리터의 마스터 믹스 분취액을 채우고 6개의 튜브를 모두 섭씨 37도에서 배양합니다. 5분 후에 튜브 1개를 제거하고 5마이크로리터의 EDTA를 첨가하여 반응을 멈춥니다.

모든 반응 튜브가 수집될 때까지 10분마다 이 작업을 수행합니다. 이제 각 튜브에서 약 반 마이크로그램의 DNA에 해당하는 12포인트 5마이크로리터와 아고로즈 겔에 있는 동일한 양의 소화되지 않은 DNA를 분석합니다. 겔에서 대부분의 도말을 약 영점 2킬로베이스로 소화하는 데 필요한 최소 시간을 결정합니다.

이것을 최대 소화 시간으로 사용하십시오. 이제 사전 테스트와 같은 실제 조각화를 설정하고 5분을 포함하여 균일하게 배치된 6개의 시간 지점에서 소화를 중지하고 최대 시간을 계산합니다. 분해 후 6개의 분해액을 당겨 PCR 정제 키트 또는 고체상 가역성 고정 비드를 사용하여 정제합니다.

정제된 DNA를 약 15마이크로리터의 EB 완충액에 희석합니다. 다음 단계는 단편화된 DNA의 말단을 복구하고, 아데닌 돌출부를 추가하고, 염기서열분석 어댑터에 ligade를 추가하고, Y자형 어댑터를 이중 가닥 DNA로 변환하는 것입니다. 이러한 단계는 모두 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 완료하는 데 2일 이상 걸리지 않습니다.

염기서열분석 어댑터를 단편화된 DNA에 연결하고 Y자형 어댑터를 이중 가닥 DNA로 변환한 후 원하는 크기의 단편을 선택합니다. TAE에서 2% 아고로즈 겔을 준비하는 것으로 시작하고, 예방 조치를 취하면서 에티듐 브로마이드를 밀리리터당 500나노그램의 최종 농도로 추가합니다. 모든 샘플과 두 개의 사다리가 빈 차선으로 경계를 이룰 수 있도록 충분한 차선을 만듭니다.

이제 각 DNA 용리액 10마이크로리터에 8마이크로리터의 로딩 염료를 추가하고 1:1:4의 비율로 6X 로딩 염료와 물로 1Kb Plus 래더를 준비합니다. 그런 다음 DNA ladder, DNA eluates, 다른 DNA ladder의 순서로 겔 레인을 로드합니다. 로드되면 120분당 60볼트로 젤을 실행합니다.

나중에 보안경과 안면 보호대를 착용하고 자외선으로 젤을 잠시 볼 수 있습니다. DNA ladder를 검사하여 겔이 300-400 염기쌍 사이에서 3개의 겔 슬라이스를 절제할 수 있을 만큼 충분히 소진되었는지 확인합니다. 다음으로, 각 레인에서 300에서 400 기본 쌍 사이의 밴드를 잘라내고 항상 각 레인에 대해 새 블레이드를 사용합니다.

각 젤 슬라이스가 이상적으로는 100마이크로리터 미만이 되도록 겔을 가능한 한 적게 제거하고 각각을 자체 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 겔 슬라이스에서 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA에서 염기서열분석 어댑터 수정된 단편을 농축하는 방법에 대한 텍스트 프로토콜을 계속 따릅니다.

그런 다음 Bioanalyzer로 정제된 DNA를 고품질 분석하고, 기대에 부합하는 경우 염기서열분석을 위해 제출합니다. 렌티바이러스는 Dam-V5-lamin B1 융합 단백질을 발현하도록 조작되었으며, 이 단백질은 아미노 형광 염색에 의해 내인성 lamin B1 단백질과 공동 국소화되는 것으로 확인되었습니다. 이 렌티바이러스와 Dam-V5 융합 단백질을 발현하는 대조군 렌티바이러스는 모두 마우스 C2C12 근아세포를 감염시키는 데 사용되었습니다.

DNA를 수집하고 아데닌 메틸화 단편에 대해 설명한 대로 증폭한 다음 염기서열을 분석했습니다. 그런 다음 염색체 1에 대한 게놈 NL 상호 작용 지도를 구성했습니다. 한 트랙은 log2 RPKM 비율을 보여줍니다.

다른 트랙은 lamina 관련 도메인을 검은색으로 표시합니다. 이들은 제어 댐보다 댐 lamin B1과 훨씬 더 관련이 있는 영역입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2주 이내에 완료할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 DamID와 결합된 고처리량 염기서열분석을 통해 관심 단백질과 관련된 DNA 염기서열을 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 브롬화 에티듐 및 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 브롬화 에티듐을 추가하기 전에 젤이 식을 때까지 기다리고, 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경과 안면 보호대를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.