Name: DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-27T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 DamID-seq를 이용한 단백질-DNA 상호작용의 게놈 전체 매핑 방법을 동물 세포에서. 고해상도 시퀀싱으로 핵 조직과 전사 조절 연구에 활용할 수 있습니다.

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DamID 포유류 발현 벡터를 제공해 주신 Bas van Steensel 박사님께 감사드립니다. NGS 라이브러리 준비 및 고처리량 DNA 염기서열분석 구현에 대한 조언을 해준 Yale Center for Genome Analysis와 Yale Stem Cell Center의 Genomics Core에 감사드립니다. 이 연구는 예일 의과대학의 스타트업 자금, 미국심장협회(American Heart Association)의 과학자 개발 보조금(12SDG11630031) 및 코네티컷 이노베이션스(Connecticut Innovations, Inc.)의 시드 보조금(13-SCA-YALE-15)의 시드 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>van Steensel, B., Delrow, J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling+using+targeted+DNA+adenine+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling using targeted DNA adenine methyltransferase.</a> Nat Genet. 27, 304-308 (2001).</li>
<li>van Steensel, B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+in+vivo+DNA+targets+of+chromatin+proteins+using+tethered+dam+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase.</a> Nat Biotechnol. 18, 424-428 (2000).</li>
<li>Fu, A. Q., Adryan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scoring+overlapping+and+adjacent+signals+from+genome-wide+ChIP+and+DamID+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Scoring overlapping and adjacent signals from genome-wide ChIP and DamID assays.</a> Mol Biosyst. 5, 1429-1438 (2009).</li>
<li>Guelen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+organization+of+human+chromosomes+revealed+by+mapping+of+nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Domain organization of human chromosomes revealed by mapping of nuclear lamina interactions.</a> Nature. 453, 948-951 (2008).</li>
<li>Kalverda, B., Pickersgill, H., Shloma, V. V., Fornerod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleoporins+directly+stimulate+expression+of+developmental+and+cell-cycle+genes+inside+the+nucleoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleoporins directly stimulate expression of developmental and cell-cycle genes inside the nucleoplasm.</a> Cell. 140, 360-371 (2010).</li>
<li>Kubben, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+lamin+A-+and+progerin-interacting+genome+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Mapping of lamin A- and progerin-interacting genome regions.</a> Chromosoma. 121, 447-464 (2012).</li>
<li>Steglich, B., Filion, G. J., van Steensel, B., Ekwall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inner+nuclear+membrane+proteins+Man1+and+Ima1+link+to+two+different+types+of+chromatin+at+the+nuclear+periphery+in+S.+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The inner nuclear membrane proteins Man1 and Ima1 link to two different types of chromatin at the nuclear periphery in S. pombe.</a> Nucleus. 3, 77-87 (2012).</li>
<li>Harr, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+targeting+of+chromatin+to+the+nuclear+lamina+is+mediated+by+chromatin+state+and+A-type+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed targeting of chromatin to the nuclear lamina is mediated by chromatin state and A-type lamins.</a> J Cell Biol. 208, 33-52 (2015).</li>
<li>Gonzalez-Aguilera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+links+emerin+to+neuromuscular+junction+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis links emerin to neuromuscular junction activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Biol. 15, R21(2014).</li>
<li>Wu, F., Yao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+compartmentalization+at+the+nuclear+periphery+characterized+by+genome-wide+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Spatial compartmentalization at the nuclear periphery characterized by genome-wide mapping.</a> BMC Genomics. 14, 591(2013).</li>
<li>Filion, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+protein+location+mapping+reveals+five+principal+chromatin+types+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells.</a> Cell. 143, 212-224 (2010).</li>
<li>Vogel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+heterochromatin+proteins+form+large+domains+containing+KRAB-ZNF+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Human heterochromatin proteins form large domains containing KRAB-ZNF genes.</a> Genome Res. 16, 1493-1504 (2006).</li>
<li>Venkatasubrahmanyam, S., Hwang, W. W., Meneghini, M. D., Tong, A. H., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide%2C+as+opposed+to+local%2C+antisilencing+is+mediated+redundantly+by+the+euchromatic+factors+Set1+and+H2A.Z%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide, as opposed to local, antisilencing is mediated redundantly by the euchromatic factors Set1 and H2A.Z.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 16609-16614 (2007).</li>
<li>Shimbo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MBD3+localizes+at+promoters%2C+gene+bodies+and+enhancers+of+active+genes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">MBD3 localizes at promoters, gene bodies and enhancers of active genes.</a> PLoS Genet. 9, e1004028(2013).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+binding+by+the+Drosophila+Myc%2C+Max%2C+Mad%2FMnt+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network.</a> Genes Dev. 17, 1101-1114 (2003).</li>
<li>Artegiani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tox%3A+a+multifunctional+transcription+factor+and+novel+regulator+of+mammalian+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.</a> EMBO J. , (2014).</li>
<li>Schuster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DamID+in+C.+elegans+reveals+longevity-associated+targets+of+DAF-16%2FFoxO%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">DamID in C. elegans reveals longevity-associated targets of DAF-16/FoxO.</a> Mol Syst Biol. 6, 399(2010).</li>
<li>Bianchi-Frias, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+transcriptional+repression+targets+and+cofactor+recruitment+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Hairy transcriptional repression targets and cofactor recruitment in Drosophila.</a> PLoS Biol. 2, e178(2004).</li>
<li>Woolcock, K. J., Gaidatzis, D., Punga, T., Buhler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+associates+with+chromatin+to+repress+genome+activity+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dicer associates with chromatin to repress genome activity in Schizosaccharomyces pombe.</a> Nat Struct Mol Biol. 18, 94-99 (2011).</li>
<li>Luo, S. D., Shi, G. W., Baker, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+targets+of+the+D.+melanogaster+DSXF+protein+and+the+evolution+of+sexual+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Direct targets of the D. melanogaster DSXF protein and the evolution of sexual development.</a> Development. 138, 2761-2771 (2011).</li>
<li>Germann, S., Gaudin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+in+vivo+protein-DNA+interactions+in+plants+by+DamID%2C+a+DNA+adenine+methylation-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping in vivo protein-DNA interactions in plants by DamID, a DNA adenine methylation-based method.</a> Methods Mol Biol. 754, 307-321 (2011).</li>
<li>Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+LHP1+protein+colocalizes+with+histone+H3+Lys27+trimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis LHP1 protein colocalizes with histone H3 Lys27 trimethylation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 869-871 (2007).</li>
<li>Orian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+profiling%2C+DamID+and+the+emerging+landscape+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Chromatin profiling, DamID and the emerging landscape of gene expression.</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 157-164 (2006).</li>
<li>Vogel, M. J., Peric-Hupkes, D., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+in+vivo+protein-DNA+interactions+using+DamID+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of in vivo protein-DNA interactions using DamID in mammalian cells.</a> Nat Protoc. 2, 1467-1478 (2007).</li>
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<li>Asp, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+remodeling+of+the+epigenetic+landscape+during+myogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide remodeling of the epigenetic landscape during myogenic differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E149-E158 (2011).</li>
<li>Hoppe, P. S., Coutu, D. L., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+sharpen+up+mammalian+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies sharpen up mammalian stem cell research.</a> Nat Cell Biol. 16, 919-927 (2014).</li>
<li>Avital, G., Hashimshony, T., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+is+believing%3A+new+methods+for+in+situ+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Seeing is believing: new methods for in situ single-cell transcriptomics.</a> Genome Biol. 15, 110(2014).</li>
<li>Navin, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genomics%3A+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cancer genomics: one cell at a time.</a> Genome Biol. 15, 452(2014).</li>
<li>Saliba, A. E., Westermann, A. J., Gorski, S. A., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq%3A+advances+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq: advances and future challenges.</a> Nucleic Acids Res. 42, 8845-8860 (2014).</li>
<li>Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Hi-C+reveals+cell-to-cell+variability+in+chromosome+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure.</a> Nature. 502, 59-64 (2013).</li>
<li>Kind, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+dynamics+of+genome-nuclear+lamina+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell dynamics of genome-nuclear lamina interactions.</a> Cell. 153, 178-192 (2013).</li>
<li>Southall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+binding+without+cell+isolation%3A+assaying+RNA+Pol+II+occupancy+in+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific profiling of gene expression and chromatin binding without cell isolation: assaying RNA Pol II occupancy in neural stem cells.</a> Dev Cell. 26, 101-112 (2013).</li>
</ol>

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Dam 태그 단백질이 내인성 단백질의 기능을 유지하는지 여부는 DamID-seq 실험 전에 검사해야 합니다. Dam 태그 핵막 단백질의 세포내 국소화는 항상 결정되어야 하며 내인성 단백질의 국소화와 비교되어야 합니다. 전사 인자를 연구하기 위해 Dam-fusion 단백질이 유전자 발현을 조절하는 내인성 단백질의 기능을 구출할 수 있는지 여부를 조사하는 것이 좋습니다. 이 기능 테스트는 내인성 DNA 결합 단백질의 녹아웃 돌연변이체를 사용할 수 있는 유기체에서 수행할 수 있습니다. 게놈 공학의 발전으로 잠재적으로 관심 있는 내인성 유전자를 녹아웃할 수 있게 되었기 때문에 배양된 포유류 세포에서 Dam 태그 DNA 결합 단백질의 기능을 조사할 수 있습니다. 
이 프로토콜의 중요한 단계는 DpnII 분해된 DamID PCR 산물을 약 200bp로 성공적으로 단편화하는 것입니다. 이 단계는 증폭된 아데닌-메틸화 단편을 시퀀싱을 위해 좁은 크기 범위로 렌더링하고 시퀀싱 라이브러리에서 DN...

아데닌 DNA 메틸화 식별 (DamID) -1,2-는 생체 내에서 DNA 단백질 상호 작용을 검출하는 방법이며 염색질 면역 (칩) 3로 대체 방법이다. 그것은 세포의 상대적으로 적은 양을 사용하고, DNA 또는 고도로 특이 항체와 단백질의 화학적 가교 결합을 필요로하지 않는다. 표적 단백질은 DNA 느슨하게 또는 간접적으로 연결된 경우 후자는 특히 유용하다. DamID 성공적 핵막 단백질 4-10, 11-13 염색질 관련 단백질, 염색질 변형 효소 14, 전사 인자 및 15-18 공동 인자와의 RNAi 기계 (19)를 포함하는 단백질의 다양한 결합 부위를 매핑하는데 사용되어왔다. 이 방법은 S. 등 다양한 유기체에서 적용 할 수있다 cerevisiae의 13, S. pombe 7, C. 엘레 9,17, D. melanogaster의 5,11,18,20, A. (21, 22)뿐만 아니라 마우스와 인간의 세포 라인 6,8,10,23,24 장대. DamID 분석법의 개발은 내인성 아데닌 2 메틸화 결여 진핵 세포에서 아데닌 메틸화 DNA 단편의 특정 검출에 기초 하였다. 관심 E.의 DNA 결합 단백질로 이루어진 융합 단백질을 발현, 콜라이 DNA 메틸화 된 아데닌 (DAM)은 공간적 인접 (가장 크게 1킬로바이트 내의 최대 약 5킬로바이트까지)이다 게놈 2 단백질의 결합 부위에 GATC 서열의 아데닌 염기를 메틸화 할 수있다. 개질 된 DNA 단편은 특별히 관심 1,25,26의 단백질의 유전자 결합 부위를 검출하는 마이크로 어레이 혼성화 및 증폭 될 수있다. 이것은 원래 DamID 방법은 마이크로 어레이의 프로브 가용성 및 소정의 밀도에 의해 제한되었다. 따라서 우리는 높은 처리량 시퀀싱을 통합 한DamID 10이고 DamID-SEQ와 같은 방법을 지정. 짧은의 많은 수의 DamID-SEQ에서 생성 된 읽기 게놈 전체 단백질 DNA 상호 작용의 정확한 위치 파악을 할 수 있습니다. 우리는 DamID-서열이 게놈 핵 라미 (NL) 협회 (10) 유학을위한 마이크로 어레이에 의해 DamID보다 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 한 것으로 나타났습니다. 이 개선 된 방법은 유전자 구조 (10) 내에 연관 NL 프로빙 수 있으며 이러한 칩 서열 및 RNA-SEQ 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와의 비교를 용이하게한다. 여기에 설명 된 DamID-SEQ 프로토콜은 초기에 매핑 게놈 NL 협회 (10)을 위해 개발되었다. 우리는 E.에 마우스 또는 인간 라민의 B1을 테 더링하여 융합 단백질을 생성 대장균의 DNA 메틸화 된 아데닌과 C2C12 마우스 (데이터가 공개되지 않음) (10)과 IMR90 인간의 태아 폐 섬유 아 세포를 근육 모세포, 3T3 마우스 배아 섬유 아세포에서 프로토콜을 테스트했다. 이 프로토콜에서는, 우리는 C로 시작벡터 및 포유류 세포 onstructing 24 렌티 바이러스 감염에 의한 댐 연결형 융합 단백질을 발현. 다음으로, 우리는 아데닌 메틸화 DNA 단편을 증폭하고 다른 생물에 적용되어야 서열 라이브러리의 제조 상세한 프로토콜을 설명한다.

<table><tbody><tr><td>ViraPower 렌티바이러스 발현 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20 및 K371-20</td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II 효소 혼합</td><td>Life Technologies</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II 효소 혼합</td><td>Life Technologies</td><td>11791-020</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 티슈 키트 (250)</td><td>QIAGEN</td><td>69506 또는 69504&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gateway pDONR 201</td><td>Life Technologies</td><td>11798-014</td><td></td></tr><tr><td>293T 세포</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25300054">트립신-EDTA (0.05%), 페놀 레드</a></td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>시그마</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>트리스 브랜드는</td><td></td><td></td><td>중요하지 않음</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>200 Proof EtOH</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>아세트산</td><td></td><td></td> 나트륨 <td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176</td><td>은 ref</td></tr><tr>. 24에서 사용할 수 있는 완충액<td>DamID 어댑터 "AdRt" 및 "AdRb"</td> <td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>염기서열과 함께 제공됩니다. 자가 결찰을 방지하기 위해 5' 또는 3' 말단의 인산화가 없습니다.</td></tr><tr><td>T4 DNA</td><td>Ligase Roche Life Science</td><td>10481220001</td><td>완충액</td></tr><tr><td>DpnII</td>와 함께 제공됨 <td>New England Biolabs</td><td>R0543</td><td>완충액</td></tr><tr><td>DamID PCR 프라이머 "AdR_PCR"</td><td>통합 DNA 기술</td><td></td><td>염기서열 ref. 24</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) 솔루션 세트</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446</td><td>dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 각각 100 mM</td></tr><tr><td>장점 2&nbsp; 중합효소 혼합물</td><td>클론텍</td><td>639201</td><td>완충액</td></tr><tr><td>1Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787018</td><td>1.0 &micro와 함께 제공됩니다. g/&마이크로; l</td></tr><tr><td>QIAquick PCR 정제 키트 QIAGEN</td><td></td><td>28104 또는 28106</td><td></td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28004 또는 28006</td><td>용리 부피 30 &micro; l</td></tr><tr><td>SPRI 구슬 / Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td>은 <td>40 &micro 미만인 경우 추가 혼합 및 더 많은 용출 시간을 적용합니다. l 용출 완충액이 사용됩니다</td></tr><tr><td>완충액 EB</td><td>QIAGEN</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext dsDNA Fragmentase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0348</td><td>완충액과 함께 제공</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 반응 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>DNA 중합효소 I, 대형 (Klenow) 단편</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynuleotide Kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3' &#8594; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212</td> 버퍼 <td></td></tr><tr><td>염기서열분석 어댑터</td>와 함께 제공 <td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>염기서열 ref. 28</td></tr><tr><td>Quick Ligation Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td>3.4.3에서 사용됨; Quick Ligation Reaction Buffer 및 Quick T4 DNA Ligase</td></tr><tr><td>sequencing primer 1 및 2</td>와 함께 제공됨 <td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>sequences available in ref. 28</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kit</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2101 또는 KK2102</td><td>KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer 및 10 mM dNTP mix</td></tr><tr><td>agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4679</td><td></td></tr><tr><td>ethidium bromide</td><td>와 함께 제공Sigma Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704 또는 28706</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1725121 또는 1725122</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>0.45 &#956; m PVDF 필터</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>25ml Seringe</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>10cm 조직 배양 플레이트</td><td></td><td></td><td>브랜드는 중요하지 않음</td></tr><tr><td>6-well 조직 배양 플레이트 브랜드는</td><td></td><td></td><td>중요하지 않음</td></tr><tr><td>S1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td></td><td></td><td>브랜드가 중요하지 않음</td></tr><tr><td>Dry Block Heater 또는 Thermomixer</td><td></td><td></td><td>브랜드가 중요하지 않음</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td>브랜드가 중요하지 않음</td></tr><tr><td>전원 공급 장치가</td><td></td><td></td> 있는 Gel 전기영동 <td>시스템 브랜드가 중요하지 않음</td></tr><tr><td>자석 스탠드</td><td></td><td></td><td>SPRI 비드를 사용한 DNA 정제용; 1.5-2 ml 튜브를 담을 수 있어야 합니다. 브랜드 중요하지 않음</td></tr><tr><td>UV transilluminator</td><td></td><td></td><td>브랜드 중요하지 않음</td></tr><tr><td>E-gel 전기영동 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>G6400, G6500, G6512ST</td><td></td></tr></tbody></table>

damid-seq : 아데닌 - 메틸화 된 dna 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 dna 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

DNA 아데닌 메틸전이효소 식별(DamID) 분석은 국소 및 게놈 전체에서 단백질-DNA 상호 작용을 검출하는 강력한 방법입니다. 이는 염색질 면역침전(ChIP)에 대한 대안적인 접근법입니다. 관심 단백질과 E. coli DNA 아데닌 메틸전이효소로 구성된 발현된 융합 단백질은 단백질-DNA 상호 작용 부위 근처의 GATC 모티프에서 아데닌 염기를 메틸화할 수 있습니다. 그런 다음 아데닌 메틸화된 DNA 단편을 특이적으로 증폭하고 검출할 수 있습니다. 원래 DamID 분석은 DNA 마이크로어레이에 대한 혼성화를 통해 메틸화된 DNA 단편의 게놈 위치를 검출하며, 이는 마이크로어레이의 가용성과 미리 결정된 프로브의 밀도에 의해 제한됩니다. 본 논문에서는 고처리량 DNA 염기서열분석을 DamID(DamID-seq)에 통합하는 상세한 프로토콜에 대해 보고합니다. DamID-seq에서 생성된 많은 수의 짧은 판독을 통해 높은 정밀도와 민감도로 게놈 전체에서 단백질-DNA 상호 작용을 검출하고 국소화할 수 있습니다. 우리는 DamID-seq 분석을 사용하여 포유류 세포의 게놈-핵 층(NL) 상호 작용을 연구했으며, DamID-seq가 게놈-NL 상호 작용을 검출하는 데 있어 고해상도와 넓은 동적 범위를 제공한다는 것을 알게 되었습니다. DamID-seq 접근법을 사용하면 유전자 구조 내에서 NL 연관성을 프로빙할 수 있으며 게놈-NL 상호 작용 맵을 ChIP-seq 및 RNA-seq와 같은 다른 기능적 게놈 데이터와 비교할 수 있습니다.

댐-V5-LmnB1 융합 단백질은 면역 형광 염색법에 의한 내인성 라민 B 형 단백질 (그림 1)과 협력 지역화 것으로 확인되었다. 아데닌 메틸화 DNA 단편의 성공적인 PCR 증폭 DamID-SEQ위한 중요한 단계이다. 노 또는 명확하게 덜 증폭 (그림 2)가 발생한다 (리가없이 또는 PCR 템플릿없이, DpnI없이) 음성 대조군 동안 2킬로바이트 - 실험 샘플은 0.2의 얼룩을 증폭한다. NGS 라이브러리 소망 인서트의 크기가 200 내지 300 염기쌍에있는 동안 메틸화 된 DNA 단편을, 0.2 내지 2 KB의 범위에있다. 따라서, 적절한 크기 범위로 메틸 PCR 제품을 단편화하는 것이...

우리는 높은 처리량 시퀀싱 (DamID-SEQ)에 DNA 아데닌의 메틸화 식별 (DamID)을 결합하여 여기에 분석을 설명합니다. 이 개선 된 방법은 높은 해상도와 넓은 동적 범위를 제공하며, 허용 등과 칩 서열, RNA-SEQ 같은 다른 높은 처리량 시퀀싱 데이터와 함께 DamID-서열 데이터 분석

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고처리량 염기서열분석을 통해 동물 세포에서 관심 단백질과 관련된 게놈 DNA 염기서열을 검출하는 것입니다. 이 기술은 핵 조직 및 포유류 세포의 전사 또는 조절 연구에서 핵 아밀로이드 또는 특정 전사 인자와 관련된 게놈 영역을 식별하는 것과 같은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고처리량 염기서열분석이 DNA 마이크로어레이를 사용하여 원래 DamID 자산보다 더 높은 분해능을 제공한다는 점과 이 기술을 통해 고처리량 염기서열분석 데이터를 사용한 교차 분석이 가능하다는 것입니다.이 절차를 시연하는 사람은 우리 실험실의 기술자인 Brennan Olson입니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 따라 관심 유전자를 DamID 벡터에 복제합니다. 다음으로, 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 DamV5 POY 및 V5-Dam을 발현하는 렌티바이러스 스톡을 생성합니다.제조업체의 프로토콜에 따라 forward transfection 절차에 따라 DamID 벡터를 lentiviral packaging plasmid와 동시 transfection합니다. 영점 45미크론 PVDF 필터를 사용하는 여과 단계를 포함해야 합니다. 이제 세포를 렌티바이러스로 감염시킬 준비를 한다.하루 전에 부착 세포를 6웰 플레이트에 전달합니다. 항생제를 계속 사용하십시오. 목표는 다음 날 감염에 대해 50%의 합류도를 갖는 것입니다.다음 날, 냉동실에서 얼어붙은 DamV5 POY 및 V5-Dam 렌티바이러스 상등액을 꺼내 섭씨 37도의 수조에 넣어 해동합니다. 배양 플레이트에서 성장 배지를 제거하고 항생제가 없는 반 밀리리터의 신선한 성장 배지로 교체합니다. 그런 다음 웰에 해동된 렌티바이러스 1밀리리터를 로드합니다.V5-Dam으로 2개의 웰, DamV5 POY로 2개의 웰, 렌티바이러스가 없는 2개의 웰을 음성 대조군으로 로드합니다. 용액을 세포에 소용돌이치고 플레이트를 인큐베이터로 다시 넣습니다. 24시간 후, 세포의 바이러스 현탁액을 항생제가 없는 2ml의 성장 배지로 교체합니다.그런 다음 48시간 동안 더 배양을 계속합니다. 이틀 후, 텍스트 프로토콜에 따라 게놈 DNA를 분리하여 이 프로세스를 완료하며, 이 작업은 약 한 시간이 소요됩니다. 그런 다음 게놈 DNA에서 아데닌 메틸화 DNA 단편을 증폭합니다.이 프로세스는 약 2-3일이 소요되며 자세한 내용은 텍스트 프로토콜에서 다룹니다. 이 절차를 위해 먼저 증폭된 아데닌 메틸화 DNA를 단편화합니다. DNA Fragmentase를 사용하기 전에 먼저 강도를 측정하여 적절한 분해 시간을 결정하는 것이 중요합니다.이 진단 검사에는 사용 가능한 정제 메틸 PCR 제품을 사용하십시오. 먼저 6마이크로그램의 DNA, 12마이크로리터의 10X 프편분해효소 완충액으로 구성된 마스터 믹스를 설정하고 114마이크로리터의 물로 채웁니다. 그런 다음 Fragmentase 스톡을 3초 동안 볼텍스하고 마스터 믹스에 6마이크로리터를 추가하여 총 120마이크로리터를 만듭니다.그런 다음 3초 동안 마스터 믹스를 소용돌이칩니다. 이제 5개의 반응 튜브에 20마이크로리터의 마스터 믹스 분취액을 채우고 6개의 튜브를 모두 섭씨 37도에서 배양합니다. 5분 후에 튜브 1개를 제거하고 5마이크로리터의 EDTA를 첨가하여 반응을 멈춥니다.모든 반응 튜브가 수집될 때까지 10분마다 이 작업을 수행합니다. 이제 각 튜브에서 약 반 마이크로그램의 DNA에 해당하는 12포인트 5마이크로리터와 아고로즈 겔에 있는 동일한 양의 소화되지 않은 DNA를 분석합니다. 겔에서 대부분의 도말을 약 영점 2킬로베이스로 소화하는 데 필요한 최소 시간을 결정합니다.이것을 최대 소화 시간으로 사용하십시오. 이제 사전 테스트와 같은 실제 조각화를 설정하고 5분을 포함하여 균일하게 배치된 6개의 시간 지점에서 소화를 중지하고 최대 시간을 계산합니다. 분해 후 6개의 분해액을 당겨 PCR 정제 키트 또는 고체상 가역성 고정 비드를 사용하여 정제합니다.정제된 DNA를 약 15마이크로리터의 EB 완충액에 희석합니다. 다음 단계는 단편화된 DNA의 말단을 복구하고, 아데닌 돌출부를 추가하고, 염기서열분석 어댑터에 ligade를 추가하고, Y자형 어댑터를 이중 가닥 DNA로 변환하는 것입니다. 이러한 단계는 모두 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 완료하는 데 2일 이상 걸리지 않습니다.염기서열분석 어댑터를 단편화된 DNA에 연결하고 Y자형 어댑터를 이중 가닥 DNA로 변환한 후 원하는 크기의 단편을 선택합니다. TAE에서 2% 아고로즈 겔을 준비하는 것으로 시작하고, 예방 조치를 취하면서 에티듐 브로마이드를 밀리리터당 500나노그램의 최종 농도로 추가합니다. 모든 샘플과 두 개의 사다리가 빈 차선으로 경계를 이룰 수 있도록 충분한 차선을 만듭니다.이제 각 DNA 용리액 10마이크로리터에 8마이크로리터의 로딩 염료를 추가하고 1:1:4의 비율로 6X 로딩 염료와 물로 1Kb Plus 래더를 준비합니다. 그런 다음 DNA ladder, DNA eluates, 다른 DNA ladder의 순서로 겔 레인을 로드합니다. 로드되면 120분당 60볼트로 젤을 실행합니다.나중에 보안경과 안면 보호대를 착용하고 자외선으로 젤을 잠시 볼 수 있습니다. DNA ladder를 검사하여 겔이 300-400 염기쌍 사이에서 3개의 겔 슬라이스를 절제할 수 있을 만큼 충분히 소진되었는지 확인합니다. 다음으로, 각 레인에서 300에서 400 기본 쌍 사이의 밴드를 잘라내고 항상 각 레인에 대해 새 블레이드를 사용합니다.각 젤 슬라이스가 이상적으로는 100마이크로리터 미만이 되도록 겔을 가능한 한 적게 제거하고 각각을 자체 마이크로분리 튜브로 옮깁니다. 다음으로, 텍스트 프로토콜에 따라 겔 슬라이스에서 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA에서 염기서열분석 어댑터 수정된 단편을 농축하는 방법에 대한 텍스트 프로토콜을 계속 따릅니다.그런 다음 Bioanalyzer로 정제된 DNA를 고품질 분석하고, 기대에 부합하는 경우 염기서열분석을 위해 제출합니다. 렌티바이러스는 Dam-V5-lamin B1 융합 단백질을 발현하도록 조작되었으며, 이 단백질은 아미노 형광 염색에 의해 내인성 lamin B1 단백질과 공동 국소화되는 것으로 확인되었습니다. 이 렌티바이러스와 Dam-V5 융합 단백질을 발현하는 대조군 렌티바이러스는 모두 마우스 C2C12 근아세포를 감염시키는 데 사용되었습니다.DNA를 수집하고 아데닌 메틸화 단편에 대해 설명한 대로 증폭한 다음 염기서열을 분석했습니다. 그런 다음 염색체 1에 대한 게놈 NL 상호 작용 지도를 구성했습니다. 한 트랙은 log2 RPKM 비율을 보여줍니다.다른 트랙은 lamina 관련 도메인을 검은색으로 표시합니다. 이들은 제어 댐보다 댐 lamin B1과 훨씬 더 관련이 있는 영역입니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 2주 이내에 완료할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 DamID와 결합된 고처리량 염기서열분석을 통해 관심 단백질과 관련된 DNA 염기서열을 검출하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 브롬화 에티듐 및 자외선으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며, 브롬화 에티듐을 추가하기 전에 젤이 식을 때까지 기다리고, 이 절차를 수행하는 동안 항상 보안경과 안면 보호대를 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

DNA 및 단백질 서열 특히 친 화성 또는 DNA 또는 단백질 methyltransferases 및 합성 보조 인자 (cofactor) 유사체를 사용하여 형광 기자 그룹으로 표시됩니다. 효소, 아지리 딘 또는 이중 활성 보조 인자 유사체의 특이성 팩터에 따라서는 1 또는 2 단계의 표시에 이용된다.

Methyltransferases과 공동 인자 유사체와 핵산과 단백질의 순서 특정 레이블

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

게놈 대상 분자의 직접적인 목표를 확인하는 것은 중요한 과제로 남아. DNA 결합 분자 게놈 참여 방법을 이해하기 위해, 우리는 염색질을 분리하는 작은 분자의 가교에 의존하는 방법 (COSMIC)을 개발.

COSMIC와 세포의 약물-DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑 (작은 분자의 가교는 염색질을 분리)

여기서 우리는 프로토콜이 메틸 바인딩 DNA 캡처 시퀀싱 (MBDCap-서열 또는 MBD-SEQ) 기술과 이후의 생물 정보학 분석 파이프 라인을 사용하여 대규모 임상 환자 스크리닝 연구에서 게놈 전체 DNA 메틸화를 조사하기 위해 제시한다.

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

우리는 micrococcal nuclease (MNase) 융합 단백질로 게놈 전체 단백질 바인딩 사이트를 매핑하기위한 염색질 immunoprecipitation (ChIP) - 직교 방식 높은 처리량 시퀀싱 (ChEC - seq)와 결합 염색질 내생 절단을 설명합니다.

ChEC-seq와의 단백질 - DNA 상호 작용의 게놈 전체 매핑<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

효 모 인구 잠재적으로 긍정적인 효 모 2 잡종 상호 작용에 대 한 선택의 깊은 시퀀싱 풍부한 파트너 단백질 상호 작용에 대 한 정보를 생성 합니다. 여기, 우리가 특정 생물 정보학 도구와 같은 화면에서 시퀀스 데이터 분석 사용자 지정 된 업데이트 소프트웨어의 동작을 설명 합니다.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

게놈 전반에 걸친 단백질 결합 위치의 정확한 결정은 유전자 조절을 이해하는 데 중요합니다. 여기서는 외핵증 소화(ChIP-exo)를 사용한 크로마틴-면역침전DNA를 치료하는 게놈 매핑 방법을 설명하고 있으며, 이어서 고처리량 시퀀싱을 한다. 이 방법은 포유류 뉴런에서 근거리 쌍 매핑 해상도 및 높은 신호 대 잡음 비와 단백질 DNA 상호 작용을 검출합니다.

크롬 마틴 면역 침전 -엑소뉴클레아제 (ChIP-Exo)를 사용하여 마우스 줄기 세포 유래 뉴런에서 단백질 DNA 상호 작용의 고해상도 매핑

DNA 리간드를 이용한 ATP 의존형 크로마틴 리모델링기의 상호 작용은 CD 분광법을 사용하여 설명된다. 생성된 봉우리에 의해 분석된 유전자 프로모터에 대한 유도된 변형 변화는 전사 조절의 메커니즘을 이해하는 데 사용될 수 있다.

DNA 단백질 상호 작용을 연구하는 CD 분광법

게놈 전체 염색체 형태 캡처 방법인 Micro-C-XL을 사용하여 뉴클레오솜 분해능으로 3차원 게놈 조직을 매핑하기 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Micro-C-XL을 사용한 포유류 3D 게놈 상호 작용 매핑

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

여기서는 도트 블롯을 이용해 전반 m⁶A 수치를 반정량적으로 평가하는 프로토콜을 제시합니다. 총 RNA를 추출, 변성, 나일론 막에 점상화하고, 항-m⁶A 항체로 탐침하며, 화학발광으로 시각화합니다. ImageJ 그레이스케일 분석으로 정량화된 신호 강도는 상대적인 메틸화 풍부도를 반영하여 연구에 재현 가능한 워크플로우를 제공합니다.

글로벌 N6-메틸라데노신 RNA 변형 수준을 검출하기 위한 도트 블롯 분석

배우세요 DamID-seq를 이용한 단백질-DNA 상호작용의 게놈 전체 매핑 방법을 동물 세포에서. 고해상도 시퀀싱으로 핵 조직과 전사 조절 연구에 활용할 수 있습니다.

DamID-SEQ : 아데닌 - 메틸화 된 DNA 단편의 높은 처리량 시퀀싱에 의해 단백질 DNA 상호 작용의 게놈 넓은 매핑

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