일본 메추라기 배아의 노 른 골목 막에서 차 내배엽 상피 세포 배양

본 ex vivo 조직편(explant) 절차의 전반적인 목적은 조류 배아의 영양분 이용을 매개하는 효소 및 단백질의 기능을 연구하기 위해 조류 내배엽 상피세포의 수집을 개선하고 응용 범위를 확장하는 것입니다. 이 방법은 발달 후기 단계에서 난황 지질이 어떻게 패키징되어 난황에서 배아로 운반되는지와 같은 조류 배아 형성 과정 중의 지질 이용에 관한 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 일본메추라기 난황낭 막에서 기능적인 내배엽 상피세포를 성공적으로 분리해낼 수 있다는 것이며, 이는 조류 배아 발달 연구를 위한 모델로 활용될 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 10x PBS 용액을 만드는 것부터 시작하십시오. 이 스톡 용액을 10배로 희석하여 1x PBS를 준비하며, 이는 내배엽 박리 중 난황낭 막을 세척하는 데 사용됩니다. 내배엽 상피 세포(endodermal epithelial cells, EECs)용 성장 배지를 준비하려면, 먼저 DMEM/F-12에 10% newborn calf serum과 1% penicillin streptomycin amphotericin 용액을 첨가하십시오.

그 후, pH 미터의 프로브를 미리 준비한 DMEM에 넣습니다. 배지의 pH가 7.2로 조정될 때까지 3N HCl을 한 방울씩 첨가합니다. 수정된 메추라기 알을 약 24개 수집한 후, 기실이 위치한 넓고 뭉툭한 끝부분이 위를 향하도록 달걀 용기에 수직으로 세워 놓습니다.

그런 다음, 알을 37 °C로 설정된 통풍이 잘 되는 배양기로 옮깁니다. 5일간 배양한 후, 검란기를 사용하여 알을 검사합니다. 배아가 정상적으로 발달했다면, 기실 아래에 모세혈관으로 이루어진 원형 구조가 보일 것입니다.

정상적인 모세혈관 발달을 보이는 알을 선택하고, 껍질을 증류수와 75% ethanol로 세척합니다. 그다음 가위를 사용하여 기실(air cell) 부위에서 알껍질을 엽니다. 핀셋을 사용하여 알의 내용물을 빈 10 cm 배양 접시에 조심스럽게 쏟아냅니다.

그런 다음, 가위를 사용하여 배아, 난황 및 알부민을 난황낭막(YSM으로 약칭)에서 분리합니다. YSM을 분리한 후, 1x PBS로 3회 세척하고, PBS가 담긴 새로운 10 cm 디쉬로 옮깁니다. 그 후, 디쉬를 해부 현미경 아래에 놓습니다.

그 다음, 가위로 YSM의 외측 외배엽 층에 인접한 잔여 난백을 제거합니다. 이어서 핀셋을 사용하여 난황낭 막의 중배엽 가장자리로부터 반투명한 외배엽과 붉은 모세혈관 구조의 중배엽을 들어 올립니다. 그런 다음, 외배엽과 중배엽을 함께 부드럽게 벗겨내어 하단의 내배엽 세포 층을 분리합니다.

그런 다음, 한 쌍의 핀셋으로 막의 노란색 내배엽 세포층을 단단히 잡습니다. 다른 핀셋으로 모세혈관 중배엽을 잡고, 중배엽과 내배엽의 접합부 가장자리에서 중배엽을 떼어냅니다. 가위로 남은 노란색 내배엽 층을 잘라내어 성장 배지가 채워진 6 cm 배양 접시에 옮깁니다.

스포이드를 사용하여 YSM 수집 후 6 cm 배양 접시의 연노란색 내배엽을 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고, 미리 준비한 성장 배지 15 mL를 추가합니다. 모든 조직 수집이 완료될 때까지 원추형 튜브를 37 °C 항온수조에 둡니다. 먼저 10 mL의 DMEM에 6.5 units의 Type IV collagenase를 녹여 용해시킵니다.

다음으로, 내배엽이 포함된 튜브를 실온에서 130 ×g로 3분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후 배지를 흡입하여 제거하고, 스포이드를 사용하여 모든 내배엽 샘플을 6 cm 배양 접시로 옮깁니다. 그 후, 접시에 콜라겐 용액 1 mL를 추가합니다.

곡선 가위를 사용하여 4마리의 메추라기 배아에서 수집한 내배엽을 약 2~3mm 크기의 조각으로 자릅니다. 그 후, 조각들을 50 mL 원심분리 튜브에 모으고, 이미 튜브 안에 들어 있는 9 mL의 신선한 collagenase 용액과 섞습니다. 외식편(explant) 단계에서 세포 증식을 향상시키기 위해, 튜브를 37°C로 설정된 진탕 항온수조에 넣습니다.

그 다음, 원추형 튜브를 30분 동안 배양하여 collagenase로 조직을 부분적으로 소화시킵니다. 부분적인 단백질 분해 소화는 난황낭 막 내배엽으로부터 세포 난황 수집 효율을 높이는 가장 중요한 단계입니다. 본 연구 데이터에 따르면, collagenase 소화 과정을 통해 세포 배양 및 세포 증식의 성공률이 유의미하게 향상됨을 확인할 수 있습니다.

콜라게나아제(collagenase) 소화 후, 조직을 상온에서 130 ×g로 3분간 원심분리하고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 펠렛(pellet)을 20 mL의 DMEM에 다시 현탁하여 세척합니다. 앞서 설명한 방법으로 튜브를 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 펠렛을 12 mL의 성장 배지에 다시 현탁합니다.

그 다음, 현탁액 500 µL를 24-well plate의 각 웰에 조심스럽게 분주합니다. 내배엽 절편을 37 °C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양합니다. 이 기간 동안 세포가 조직 밖으로 증식하게 됩니다.

다음으로, 세포를 이틀 더 배양합니다. 그런 다음, 세포 생존능 분석을 수행하고 플레이트 리더를 사용하여 결과를 시각화합니다. 이후, RT-qPCR을 수행하여 EEC에서 관심 마커의 발현 수준을 평가하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 겔 전기영동을 통해 RT-qPCR의 산물 크기를 확인합니다.

이 그래프에서 나타나고 paired t-test로 확인된 바와 같이, 콜라게나제(collagenase)로 부분 소화시킨 외식편은 처리하지 않은 외식편에 비해 세포 증식이 유의미하게 증가하여 배양 시스템의 성공을 입증하였습니다. 다른 효소들의 효과를 평가하기 위해, 콜라게나제와 디스파제(dispase)를 함께 처리한 조직과 콜라게나제만 처리한 조직에 대해 세포 생존능 분석을 수행하였습니다. 배양 초기 5일 동안 두 조건 모두에서 세포 성장은 비슷하게 나타났습니다.

하지만 6일에서 9일 사이에는 collagenase로 처리한 EECs만이 꾸준히 증식했으며, 이는 이 효소를 이용한 부분 소화가 성장을 촉진하므로 우선적으로 사용되어야 함을 시사합니다. 배양된 EECs를 시각화했을 때, 여기에서 보는 바와 같이 크고 둥근 지질 방울이라는 지방세포 유사 특징이 나타났습니다. 이러한 세포들은 일반적으로 지방세포 식별에 사용되는 Oil Red O 염색에서도 양성 반응을 보였습니다.

이러한 형태학적 데이터를 뒷받침하기 위해, 실시간 정량 PCR을 통해 배양된 EEC가 콜레스테롤로부터 콜레스테롤 에스테르를 합성하는 단백질인 SOAT1을 높은 수준으로 발현함을 확인하였습니다. 이는 배양된 EEC가 지방세포의 정확한 생리학적 특성을 나타낸다는 것을 추가적으로 시사합니다. 중요한 점은, cyclic adenosine monophosphate 또는 cAMP 수치를 증가시키는 인자인 IBMX와 Forskolin에 EEC를 노출시켜 24시간 동안 배양했을 때, 두 처리 모두 SOAT1 발현을 자극했다는 것이며, 이는 YSM 내의 SOAT1 조절 및 지질 이용의 가능한 기전을 시사합니다.

이 기술을 숙달하면 약 4시간 이내에 수행할 수 있으며, 그동안 최소 3개의 샘플을 수집할 수 있습니다. 이 절차 이후에 SOAT1과 같은 방법이나 다른 효소 활성 분석 및 유사한 시각적 확인을 수행할 수 있습니다. 이러한 분석은 특정 단백질과 다량 영양소가 배아 발달의 후기 단계에 어떻게 관여하는지와 같은 추가적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 개발 이후, 배아 영양소 이용 분야의 연구자들은 조류 배아 모델에서 영양소가 이용되고 운송되는 가능한 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 조류 배아에서 내배엽 조직을 수집하는 방법을 배울 수 있으며, 조류 모델을 이용해 배아 영양소 운송 및 이용을 연구하기 위한 EEC 배양 방법을 익힐 수 있습니다.