형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

이 방법론의 전반적인 목표는 형광 현미경을 사용하여 Kinesin-1 화물을 식별하는 것입니다. 이 방법은 키네신(kinesin)과 미오신 (myosin)에 의해 운반되는 화물과 같은 분자 모터 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 우성 음성 KIF5B 돌연변이가 형광 현미경을 사용하여 이 화물을 시각적으로 식별하는 데 도움이 될 수 있다는 것입니다.

먼저 40X 이하에서 살아있는 세포 또는 간접 형광 이미징을 위해 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 완전한 배지에 0.2 - 0.3 백만 개의 HeLa 세포를 공급합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 성장시킵니다. 배율이 40배 이상인 간접 면역형광 연구의 경우, 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 절대 알코올을 사용하여 커버 유리를 세척하고 6웰 플레이트의 웰에 세워 자연 건조합니다.

커버 슬립이 건조되면 웰에 놓고 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 완전한 DMEM에 0.2-0.3 백만 개의 세포를 파종합니다. 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 생물 안전 캐비닛 내부에서 0.1ml의 트랜스펙션 배지를 사용하여 후보 화물 단백질을 발현하는 플라스미드의 유무에 관계없이 0.6마이크로그램의 td토마토 태그가 부착된 야생형 또는 모터리스 KIF5B 발현 플라스미드를 희석합니다.

또 다른 1.6ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 1.8μl의 transfection 시약을 0.1ml의 transfection 배지에 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 0.1ml의 희석된 transfection 시약을 희석된 DNA 샘플에 추가합니다.

튜브를 뒤집어 내용물을 섞고 5초 동안 회전시킵니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 45분 동안 배양합니다. transfection 복합체의 형성을 위한 잠복기 동안 PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다.

그런 다음 각 웰에 0.8 mililit의 예열된 transfection 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 희석된 transfection 시약을 45분 동안 배양한 후 플레이트의 각 웰에 용액 0.2militer를 적가합니다. 6웰 플레이트를 5초 동안 부드럽게 흔든 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에 6-8시간 동안 다시 넣습니다.

그런 다음 완전한 DMEM을 사용하여 매체를 교체하십시오. 추가로 16시간의 배양 후 살아있는 세포 이미징을 수행하려면 DNA 삽입 염색 Hoechst 33342를 배지에 최종 농도 1마이크로몰까지 추가하고 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 40X 대물렌즈를 사용하여 세포의 형광 단백질 발현을 검사합니다.

형질주입 시약으로 배양된 세포에 대해 간접 면역형광을 수행하려면: 텍스트 프로토콜에 따라 파라포름알데히드를 준비한 후 실온 PBS를 사용하여 6개의 웰 플레이트를 5초 동안 소용돌이쳐 세포를 세척합니다. 웰당 갓 준비한 4% 파라포름알데히드 1ml와 PBS를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 플레이트를 소용돌이쳐 세포를 한 번 씻고 용액을 버립니다.

다음으로, PBS의 0.1%Triton-X 100 1밀리리터를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 세포를 투과시킵니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 네 번 세척하고 세척할 때마다 용액을 버립니다. 1차 항체를 추가하고 실온에서 4시간 동안 흔들면서 세포를 배양합니다.

배양 후 PBS를 사용하여 플레이트를 소용돌이쳐 세포를 4번 세척합니다. 그런 다음 형광 염료 접합 2차 항체 1ml를 추가하고 실온의 암흑 속에서 2시간 동안 흔들면서 배양합니다. PBS로 세포를 4회 세척한 후 DAPI 1ml를 넣고 실온의 암흑 속에서 10분 동안 배양합니다.

샘플과 함께 커버 안경을 사용하는 경우, 현미경 슬라이드 중앙에 10마이크로리터의 장착 용액을 바르고 장착 용액 위에 커버 유리를 장착합니다. 그런 다음 밤새 실온에서 어두운 곳에서 배양합니다. 다음 날, 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고 밤새 흄 후드에서 어둠 속에서 배양합니다.

형광 현미경 검사를 수행하려면 DAPI, CFP, FITC 및 Cy3용 필터 세트와 함께 40X 대물렌즈를 사용하십시오. 여기에서 입증된 바와 같이, 외인성으로 발현된 야생형 KIFB는 세포질에서 균일하게 나타난 반면, c-MYC는 주로 핵에서 나타났습니다. 그러나 모터가 없는 KIF5B 돌연변이는 세포질에서 응집체를 형성했고 이는 c-MYC의 응집으로 이어졌습니다.

또한, 모터리스 KIF5B는 내인성 c-MYC와 전사 인자 p53의 응집을 유도했는데, 이는 c-MYC와 p53이 모두 Kinesin-1의 화물이고 KIF5B가 두 내인성 단백질의 세포 내 국소화를 조절한다는 것을 나타냅니다. 이 그림은 모터리스 KIF5B 돌연변이의 발현이 c-Fos의 세포 내 국소화에 영향을 미치거나 응집을 일으키지 않았기 때문에 KIF5B에 의한 전사 인자의 이동이 특이적인 것으로 보인다는 것을 보여줍니다. 이러한 데이터는 이 비디오에서 시연된 방법이 Kinesin-1 화물의 높은 특이성 식별을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.

이 절차를 시도하는 동안, 세포질의 부피가 많은 세포에 가장 적합한 kinesin이 세포질에 응집되어 세포질에 응집되는 것을 쉽게 관찰할 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 개발 이후, 이 기술은 분자 모터 분야의 연구자들이 특정 화물을 식별하기 위해 다른 키네신과 미오신 의 유사한 우성 음성 돌연변이를 구성할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광 현미경을 사용하여 이 화물을 식별하기 위해 분자 모터의 우성 음성 돌연변이를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

페노, 브롬화 에티듐 및 파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 직접적인 피부 접촉을 피하기 위해 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.