Name: 형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 학습하세요 형광 현미경을 사용하여 Kinesin-1 화물을 식별하는 방법을. HeLa 세포에서 motorless KIF5B 돌연변이체를 이용해 c-MYC와 p53 같은 화물을 시각화하고 세포 내 분자 모터 기능을 연구하세요.

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Roche의 출판 보조금은 이 기사의 무료 액세스 출판 및 제작을 다루었습니다. 저자는 또한 원고에 대한 지원과 비판적 읽기에 대해 E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip 및 Sol D. Gloria에게 감사를 표합니다.

tdTomato-태그 야생 형 및 모터리스 KIF5B 단백질 1. 복제 <ol><li> 표 1의 프라이머를 사용하여 인간 야생형 및 모터리스 KIF5B의 단백질의 cDNA를 증폭의 Taq DNA 중합 효소 (100 ㎕를 5 대)의 dNTP 혼합물 (각 옥시 뉴클레오티드 2 mM)을 30 사이클의 10X 버퍼. 각 사이클은 변성 단계 (30 초 동안 95 ° C), 어닐링 단계 (30 초 동안 45 ° C) 및 확장 단계 (3 분 동안 72 ° C)로 구성된다. </li><li> 페놀 / 클로로포름을 동량 증폭 된 DNA 생성물을 추출물 (1 : 1). 주 : 페놀은 가연성이며 화상을 입을 수 있습니다. 클로로포름은 위험합니다. 그들과의 직접적인 접촉을 피하고 화학 흄 후드를 사용합니다. 대안으로, PCR 생성물은 다양한 장비에 의해 정제 할 수있다. <ol><li> 1 분 동안 실온에서 마이크로 원심 18,000 XG 스핀. 새로운 튜브에 수용액을 옮기고 클로로포름 동일 부피로 추출한다. </li><li> 회전0.5 분 동안 실온에서 마이크로 원심 18,000 XG에. 새로운 튜브를 수용액을 전송합니다. </li><li> 3 M 나트륨 아세테이트의 10 볼륨과 무수 에탄올의 두 볼륨이있는 수용액을 섞는다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 마이크로 원심 18,000 XG 스핀. 수용액을 폐기하십시오. </li><li> 75 % 에탄올의 두 볼륨 DNA 펠렛을 씻으십시오. 수용액을 버리고 공기를 실온에서 5 분간 DNA 펠렛을 건조. 34 μl의 물에서 DNA 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 제한 40 μL의 최종 부피에서 증폭 된 제품을 소화하는 것은 SalI로 (10 대)과의 BamHI (10 대)와 두 시간 동안 37 ° C에서 자신의 10X 버퍼의 4 μl를 효소. 에티 디움 브로마이드 (0.2 μg의 / ㎖)을 함유하는 아가로 오스 겔에서 분해 제품 (100 V에서 1.0 %)을 해결. 주 : 에티 디움 브로마이드 강력한 돌연변이이며 피부를 통해 흡수 될 수있다. 따라서 w 직접 또는 간접 접촉을 방지하는 것이 중요i 번째 에티 디움 브로마이드. </li><li> 열에 의해 정화에 대한 올바른 밴드를 잘라. DNA 절편을 함유하는 아가로 오스 겔을 단다. 이어서 약 20 분 동안 37 ℃에서 용해 완충액 (0.1 g, 300 μL)에 용해. </li><li> 5 초 동안 실온에서의 microcentrifuge의 열 스핀에 생성 된 솔루션을 추가합니다. 흐름을 통해 폐기하십시오. </li><li> 단계 1.5를 반복하여 0.5 ㎖의 가용화 버퍼와 컬럼을 씻으십시오. 단계 1.5를 반복하여 0.75 ml의 세척 버퍼 다시 열을 씻으십시오. 2 분 나머지 세척 버퍼를 제거하기위한 열을 스핀. </li><li> 150 단계를 반복하여 50 ㎕의 물과 DNA 단편을 용리시킨다. 에티 디움 브로마이드 (0.2 μg의 / ㎖)을 함유하는 아가로 오스 겔 (100 V에서 1.0 %)의 DNA 사이즈 래더 대조의 분취 량을 실행하여 DNA 단편의 농도를 추정한다. </li><li> 이전 번째로 분해 ptdTomato-C1 벡터 (17) (100 NG)로 정제 된 제품 (약 100 NG)를 결찰즉 동일한 제한이 16 시간 동안 실온에서 T4 DNA 리가 제 (000 단위) 및 1 ㎕의 10X 결찰 완충액을 사용하여 10 ㎕의 효소. 참고 : 야생 형 및 모터리스 돌연변이가 각각 2에서 963에 963과 584에 아미노산이 포함되어 있습니다. 이전에, 더 큰 모터리스 KIF5B 변이체는 그 기능 (9)를 식별하는 데 사용 하였다. 작은 모터리스 KIF5B 돌연변이는 발현 수준을 증가시키기 위해, 본 연구에 사용 하였다. </li></ol> 2. 면역 형광 현미경 <ol><li> 살아있는 세포 또는 또는 40 배 이하의 배율 간접 형광 이미징, 1 ml의 완전 배지에서 0.2-0300000 HeLa 세포를 시드의 각 웰에 [둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS)] 여섯 잘 플레이트. 5 % CO 2와 37 ° C에서 성장. </li><li> 40X 이상 배율 간접 면역 형광 연구, 커버 유리를 세척를 들어, 무수 에탄올 짧게과의 (18mm X 18mm 1.5 두께)에서 그들을 공기 건조바이오 안전성 캐비닛 내부 여섯 웰 플레이트의 우물은 오염을 방지 할 수 있습니다. <ol><li> 1 종 0.2-0300000 셀은 6 웰 플레이트의 각 웰에 DMEM 배지를 완료 ㎖로. </li></ol></li><li> 형질 단지의 제조 <ol><li> 다음날, 바이오 캐비닛 내부화물 후보 단백질 발현 플라스미드의 존재 또는 부재 tdTomato 태깅 야생형 또는 모터리스 KIF5B위한 발현 플라스미드 0.6 μg의 (총) 희석 (pTagCFP-C-MYC 5 ) 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 0.1 ㎖의 트랜 스펙 션 배지. 참고 : 벡터 pTagCFP-C-MYC는 TagCFP - 태그 C-MYC을 표현한다. </li><li> 또 다른 1.6 ml의 microcentrifuge 관에 0.1 ml의 형질 매체에 형질 전환 시약 1.8 μl를 추가합니다. 일반적으로 12 샘플 충분히 희석 형질 전환 시약의 마스터 믹스를 준비합니다. </li><li> 실온에서 5 분 동안 인큐베이션. </li><li> 희석 된 0.1 ml의 DNA를로 희석하여 0.1 ml의 형질 전환 시약을 추가합니다. 미튜브 반전 내용 X. 마이크로 원심 5 초 동안 튜브를 스핀. </li><li> 실온에서 45 분 동안 인큐베이션. </li></ol></li><li> 세포의 세척 <ol><li> 형질 감염 복합체의 형성을위한 배양 기간 동안 세포를 시딩 인산염 완충 식염수 (PBS)로 3 번 씻는다. </li><li> 각 시드의 세포 배지를 교체 아니라 0.8 ml의 예열 형질 매체. 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 돌려줍니다. </li></ol></li><li> 세포의 형질 <ol><li> 45 분의 인큐베이션 후, 플레이트의 각 웰에 DNA / 형질 전환 시약 (단계 2.3에서 제조) 착체 0.2 mL를 적하 추가. </li><li> 그들은 37 ° C에서 인큐베이터에 반환되기 전에 5 초 동안 부드럽게 6 잘 판 바위. </li><li> 6-8 시간 후, 전체 DMEM 배지로 배지를 교체한다. </li></ol></li><li> 라이브 셀 형광 이미징 (18) <ol><li> 배양의 부가 16 시간 후t는 37 ° C, 1 μM의 최종 농도로 배지에 DNA에 인터 훽스트 33342 염색을 추가한다. 참고 훽스트 33342이 세포 핵 얼룩 세포 투과성 DNA의 삽입 성 염료이다. </li><li> 40X 대물 렌즈를 이용하여 형광 현미경으로 형광 단백질의 발현을 조사하기 전에 37 ° C의 배양기에서 10 분 동안 형질 감염된 세포를 인큐베이션. DAPI, CFP, FITC와 Cy3에 대한 필터 설정은 각각 (Ex350에 ㎚ / Em460에 ㎚) (Ex436에 ㎚ / Em480에 ㎚) (Ex470에 ㎚ / Em525 수 (NM)) 및 (Ex545에 ㎚ / Em605에 ㎚)이다. 주 : 배경 인해 완전 DMEM 배지 자동 형광으로 높으면 페놀 레드없는 배지가 사용된다. </li></ol></li></ol> 간접 면역 형광 연구 3. <ol><li> 파라 포름 알데히드 용액의 조제 <ol><li> 파라 포름 알데히드 분말 (100 ml의 PBS 당 4 g)을 달아 PBS에 추가합니다. 참고 : 파라 포름 알데히드는 가연성 고체 및 잠재적 인 암 해저드입니다디. 그것은 눈, 호흡계 및 피부를 자극. 따라서, 파라 포름 알데히드와의 접촉 또는 흡입을 방지하는 것이 중요하다. </li><li> 용액 (150 ㎕를 10 N의 NaOH / 100 ㎖)에 NaOH를 추가합니다. </li><li> 가끔 흔들어 2-3 시간 동안 42 ° C에 37에서 솔루션을 유지합니다. </li><li> 용해 후, 파라 포름 알데히드 분말 용액 (75 μL / 100 ㎖)에 빙초산을 첨가하여 pH를 7.0으로 조정합니다. </li></ol></li><li> 대상 단백질 염색 <ol><li> 37 ° C에서 16 시간 동안 더 배양 한 후, 5 초 동안 6 웰 플레이트 소용돌이하여 PBS로 한번 실온에서 형질 감염된 세포를 씻는다. </li><li> 웰당 갓 제조 한 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 1 ㎖로 세포를 고정한다. 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. </li><li> 한 번에 5 초 6 웰 플레이트에 대해 소용돌이에 의해 PBS로 세포를 씻으십시오. 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 30 분 동안 실온에서 0.1 % (PBS)에서 트리톤 X-100 1 ㎖로 세포를 인큐베이션. DET이들 세포 표적에 대한 항체의 접근을 허용하는 세포막 Permeabilize 하시려면 것이다 트리톤 X-100 ergent. </li><li> 5 초 때마다 6 웰 플레이트 소용돌이하여 PBS로 4 회 세포를 씻으십시오. 각 세척 후 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 4 시간 동안 흔들어 실온에서 PBS 용액에 10 %의 FBS (0.1 μg의 / ㎖ C-MYC 토끼 항체 또는 p53의 마우스 항체) 일차 항체 1 ㎖로 세포를 인큐베이션. </li><li> 5 초 때마다 6 웰 플레이트 소용돌이하여 PBS로 4 회를 씻으십시오. 각 세척 후 솔루션을 폐기하십시오. </li><li> 2 시간 동안 흔들어 어둠 속에서 실온에서 PBS에 10 % FBS에서, (0.5 μg의 / ㎖ 알렉사 형석 488 - 공액 안티 - 토끼 또는 항 - 마우스 IgG 항체) 형광 염료 접합 이차 항체에 1 ㎖의 인큐베이션. </li><li> 5 초 때마다 6 웰 플레이트 소용돌이하여 PBS로 4 회를 씻으십시오. 각 세척 후 솔루션을 폐기하십시오. </li></ol></li><li> 핵 염색 및 장착 <ol><l10 분간 어둠 속에서 실온에서의 PBS (0.5 μg의 / ㎖ DAPI) 내가&gt; DNA에 인터 염료 4 &#39;, 6-diamidino -2- 페닐 인돌의 1ml를 가진 세포를 인큐베이션. 더 커버 유리가 사용되지 않은 경우 3.4 단계로 진행합니다. 주의 : DAPI는 세포핵 얼룩 DNA에 인터 염료이다. </li><li> 각 현미경 슬라이드에 장착 용액 10 μl를 적용합니다. 현미경 슬라이드에 장착 솔루션을 통해 각각의 커버 유리를 탑재합니다. </li><li> 어두운 밤새 실온에서 인큐베이션. </li><li> 매니큐어와 커버 유리의 가장자리를 밀봉합니다. 밤새 매니큐어 가스를 제거하기 위해 연기 후드 내부의 어둠 속에서 놓습니다. </li></ol></li><li> 형광 현미경 (19) <ol><li> 다음 날, 40X 목표를 사용하여 형광 현미경으로 세포를 검사합니다. DAPI, CFP, FITC와 Cy3에 대한 필터 설정은 각각 (Ex350에 ㎚ / Em460에 ㎚) (Ex436에 ㎚ / Em480에 ㎚) (Ex470에 ㎚ / Em525 수 (NM)) 및 (Ex545에 ㎚ / Em605에 ㎚)이다. </li></ol></li></ol>

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기재된 방법은 미세 소관을 따라 이동할 수있는 능력이 결여 모터리스 KIF5B 변이체의 특성을 이용하지만 동일한화물 단백질과 상호 작용하는 테트라 머 단백질을 야생형 KIF5B와 다이머를 형성하고, 이에 따라, 허용 할 수있는 능력을 보유 야생형 KIF5B있다. 모터리스 KIF5B 따라서, 그화물로 집계 mislocalized 지배적 인 부정적인 돌연변이 및 양식 역할을합니다. 이 방법은 (그림 1) 5에게 키네신-1화물 C-MYC를 식별하기 위해 입증된다. 이 기사에서는 동일한 모터리스 KIF5B 돌연변이는 키네신-1의 또 다른 잠재적 인화물 (그림 2)로 p53의를 식별하는 데 사용되었다. 이 방법론은 키네신 -1- 다른화물을 식별 가능한 것을 나타낸다. 또한, 돌연변이의 특성은 대조군 단백질에 Fos-C (도 3)에 대한 돌연변이의 효과의 부족에 의해 제공된다. 이 프로토콜에서는 야생 타이를 tdTomato-태그퍼가기 또는 모터리스 KIF5B 단백질은 다른 형광 단백질 태그 후보화물 단백질과 동시 발현된다. 이 경우에, 살아있는 세포의 형광 현미경 및 이미징이 수행된다. 응집체의 형성은 저속 촬상으로 추적 될 수있다. 이와 달리, 태깅 tdTomato 단백질 단독 발현 및 생리적 수준에서 후보화물 단백질 특이 적 항체를 이용하여 간접 면역 형광 현미경 검사에 의해 가시화된다. 형광 단백질 tdTomato는 밝기와 광 안정성 (17)에 대해 선택된다. 배경 완전한 DMEM 배지 자동 형광에 의한 높으면 페놀 레드없는 배지가 사용된다. 모터리스 KIF5B 돌연변이 화학량 야생형 KIF5B와 이합체를 형성한다. 따라서, 그 기능을 억제하고, 응집체를 형성하도록 야생형 카운터 파트와 이합체를 형성하도록 모터리스 KIF5B 변이체의 충분한 양을 표현하는 것이 중요하다. , EXPR의 최적화를이 문제를 해결하려면모터리스 돌연변이의 ession이 필수적이다. 이는 이량 체화 도메인을 포함하는 소형 모터리스 돌연변이를 사용하여 달성된다. 또한, 적절한 형질 전환 시약 및 프로토콜의 최적화도 필요하다. DNA / 형질 전환 시약과 HeLa 세포의 배양 기간은 외래 단백질 및 세포 생존의 발현 HeLa 세포에서 최적화되었다. 배양 시간은 기타 세포주에 대해 최적화 될 필요가있다. 40X에 4 배 사이의 배율의 경우, 커버 안경이 필요하지 않습니다. 세포를 직접 웰에서 검사 될 수있다. 따라서,이 경우, 프로토콜은 저렴하고 편리하다. 40X 이상 배율의 경우, 세포를 염색 한 후, 오일 침지 목표 아래 검사에 대한 현미경 슬라이드에 장착되어, 우물에 커버 유리에 성장하고있다. 모터리스 KIF5B 단백질 응집체의 관찰 세포질의 크기에 의해 제한된다. 을 감지하기 쉽습니다많은 포유 동물 세포의 집합체. 그러나, 세포질 부피의 핵 주위의 신경 돌기 작은 경우 신경 세포의 응집체를 관찰 비교적 어렵다. 프로토콜은 생체 효모 두 하이브리드 생화학 풀다운 분석 13-16 이외에 KIF5B화물과의 연관성을 표시하기 위해 사용된다. 이러한 모든 분석은 서로 다른 물리적 조건 관계를 결정하고 그 결과를 서로 보완 할 수있다. 또 다른 분석을 통해이 형광 분석의 장점은 KIF5B 의해화물의 세포 내 편재 규제를 표시 할 수 있다는 점이다 (도 1 및도 2). 프로토콜 KIF5B에 한정되지 않고, 다른 키네신 모터 (3) 및 (3)의 세포 내화물 운송에 사용 미오신 모터 (23, 24)의 일부로서 다른 모터 단백질의화물을 식별하는데 사용될 수있다. 이 모터 단백질은 또한 올리고머에 대한 키네신 모터와 마이 오신 모터 용 미세 섬유 및 코일 코일 세그먼트에 대한 미세 소관을 따라 이동을 위해 모터 도메인이 포함되어 있습니다. 그들 대부분은 동종이 량체 3,23를 형성한다. 따라서, 유사한 전략은화물을 식별하기 위해 자신의 모터리스 우성 네거티브 돌연변이를 생성하여 이들에인가 될 수있다.

키네신-1은 선행 성 1,2화물 수송을 매개 모터 단백질이다. 그것은 키네신 빛 체인 1 (KLC1) 및 키네신 무거운 체인의 두 서브 유닛 (KHCs)의 두 개의 서브 유닛의 heterotetramer이다. KIF5B 1, KHC는 자사의 N 말단, ATP를 가수 분해 및 미세 소관을 따라 이동을 위해 기계적 에너지를 화학 에너지로 변환에서 모터 도메인이 포함되어 있습니다. 그것의 C- 말단 지역은화물과 연관 KLC1와 상호 작용 이합체 도메인이 포함되어 있습니다. 키네신-1은 소포, 세포 기관과의 mRNA 3,4 등의화물을 수송한다. 최근 KIF5B는 세포질 5 proteosomal 저하에 대한 핵 전사 인자 C-MYC 수송을 보였다. 세 가지 방법 (화학적 억제제의 siRNA / shRNA를 지배적 네거티브 체)은 키네신 - 1 기능을 억제하기 위해 사용 하였다. 그들 모두는 세포질에서 C-MYC의 응집을 유도. 마지막 방법의 경우, C-MYC은 지배적 인 negat에 의해 영향을 받았다돌연변이는 일반적으로 (미세 소관 중단 등) 세포 내 구성 요소에 대한 영향이나 단백질 응집에를주지 않는 것을 건의, 다른 관련 KIF5A 모터 단백질의에 의해 KIF5B의 돌연변이를 필자는 아니지만. KIF5B 지배적 네거티브 체는 또한 전사 인자에 대한 일반적인 영향을주지 않는다는 것을 시사 다른 전사 인자에 영향을 미치지 않았다. 오히려 우성 네거티브 체는화물에 대한 특정 효과를 발휘하는 것을 시사한다. 우성 네거티브 변이체의 사용은 모터 단백질의 분야에서 일반적이다. 키네신과 myosins의 유사 모터리스 돌연변이는 이전에 사용되었다. 이들은 주로 자신의화물의 세포 내 지역화 또는 세포 기능에 6-12 돌연변이의 효과를 입증하기 위해 사용되었다. 덜 강조 돌연변이와 그들에 의해 영향을받는화물 사이의 공간 관계에 넣었다. 그러나, 어떤 빈도로, 돌연변이는 CA와 공동 지역화 관찰rgos 6,10. KIF5B 및 관련 단백질 간의 상호 작용은 이전에 생체 효모 두 하이브리드 분석법 및 면역 침전과 같은 공동 체외 풀다운 분석 생화학 13-16에서 풀다운 검정에 의해 확인 하였다. 이 기사에서는 추가로 시각적 방법을 사용하여 형광 현미경은 KIF5B화물 단백질을 식별하기 위해 설명되어 있습니다. 방법 우성 네거티브 체로서 작용하는 모터리스 KIF5B 변이체를 사용한다. 그것은 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 17 tdTomato 형광 단백질 야생 형 및 모터리스 KIF5B 돌연변이의 태그는 형광 현미경으로 자신의 시각화를 가능하게한다. 태그 KIF5B 단백질 적절 KIF5B 태그로부터 분리 된 스펙트럼 특성을 갖는 다른 형광 단백질을 융합 단백질 후보와 공동 발현 될 수있다. 태그 단백질 생균 직접 관찰형광 현미경 하에서. 모터리스 KIF5B 돌연변이에 의해 후보 단백질 응집 유도 후보 단백질 KIF5B의 생체화물인지 확인한다. 또한 tdTomato 태깅 KIF5B 단백질은 내인성화물 단백질에 미치는 영향을 연구하는 세포만을 표현할 수있다. 나중에, 면역 형광 현미경이 형광 염료와 접합 적절한 이차 항체이어서 형질 감염된 세포를 고정 후보 내인성 단백질에 대한 특이 항체로 염색 된 행한다. 이 경우, 생리 학적 수준에서 내인성 후보 단백질 연구된다. 다른 모터 단백질 유사 모터리스 돌연변이들은화물을 식별하기 위해 제조 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>절대 에탄올(200프루프)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>, Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr>, <tr><td>Hoechst 33342</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM-I(트랜스펙션 배지)</td><td>Life Technologies</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>ProLong 다이아몬드 안티페이드 마운트,</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드, 파라</td><td>Fisher Scientific</td><td>O4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA 형질주입 시약</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA 중합효소</td><td>Life Technologies</td><td>10342020</td><td></td></tr><tr><td>PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td><td>Roche</td><td>12111424</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td><td>Life Technologies</td><td>SM1333</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Quick Gel 추출 키트</td><td>Life Technologies</td><td>K210012</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England Biolab</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>New England Biolab</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp;</td><td>New England Biolab</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>c-MYC 토끼 항체</td><td>Cell Signaling</td><td>5606</td><td></td></tr><tr><td>p53 마우스 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A11059</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경&nbsp;</td>이미징을 위한 <td>Olympus IX71_Fluoview</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터 소프트웨어</td><td>&nbsp; 셀센스&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

형광 현미경은 Kinesin-1 화물을 식별하는 데 사용됩니다. 최근에는 Kinesin-1(KIF5B)의 중쇄가 세포질에서 프로테오솜 분해를 위해 핵 전사 인자 c-MYC를 운반하는 것으로 나타났습니다. 여기에 설명된 방법은 형광 현미경 검사를 위한 무동력 KIF5B 돌연변이 연구와 관련이 있습니다. 야생형 및 모터가 없는 KIF5B 단백질에는 형광 단백질 tdTomato가 표시되어 있습니다. 야생형 tdTomato-KIF5B는 세포질에서 균질하게 나타나는 반면, 모터가 없는 tdTomato-KIF5B 돌연변이는 세포질에서 응집체를 형성합니다. 모터리스 KIF5B 돌연변이의 응집은 세포질에서 화물 c-MYC의 응집을 유도합니다. 따라서 이 방법은 Kinesin-1의 화물을 식별할 수 있는 시각적 수단을 제공합니다. 다른 운동 단백질의 화물을 식별하기 위해 유사한 전략을 사용할 수 있습니다.

외인성는 C-MYC는 핵 (도 1A)를 중심으로 나타난 반면 야생형 KIF5B은 세포질에서 발현 균일 나타났다. 그러나, 모터리스 KIF5B 돌연변이 세포질 (도 1a)의 응집체를 형성했다. 모터리스 KIF5B의 집계는 C-MYC의 응집을 유도. 세포의 비율이 낮았다 야생형 KIF5B 발현 세포 TagCFP 태그가 C-MYC 집계를 발현. 그러나, 모터리스 KIF5B는 (도 1a)을 공동 발현 될 때 상당히 높았다. C-MYC와 돌연변이 KIF5B의 관찰 공동 현지화 (그림 1) KIF5B는 C-MYC의 세포 내 현지화를 조절하고 C-MYC는 키네신-1의화물 있음을 시사한다. 구조가 단독으로 표현 된에 음성 대조군은 그림 1A의 하부 패널에 포함되어 있습니다. 결과는 형광 emissio의 유의 블리드 - 스루가 없다고 표시엔. 모터리스 KIF5B 또한 내인성 C-MYC (도 1b) 및 전사 인자 p53의 (도 2)의 응집을 유도 나타내는 C-MYC 및 p53이 모두 키네신-1화물이며 KIF5B 두 내인성 단백질의 세포 내 위치 파악을 조절한다. 함께 키네신-1 억제제는 C-MYC 및 p53이 모두 5 벵골 락톤 (RBL) 고 분자량 종 (20)이 유도 형성 상승한 결과, p53의 가능성 키네신-1화물이다. C-MYC 같은 핵 전사 인자 p53의는, 또한 프로 테아 좀 저하 (21, 22)의 세포질에 핵에서 내 보낸 것을주의하는 것이 재미있다. 모터리스 KIF5B 변이체의 발현이 세포 내 지역화 C-에 Fos 영향을하거나 응집 (도 3)이 발생하지 않았기 때문에 KIF5B하여 전사 인자의 이동이 상세하게 보인다. 전술 한 데이터는 운전 방식이 있음을 입증이 책에서 사용 d를 키네신-1화물의 높은 특이성 식별 할 수 있습니다. 유사한 전략은 다른 모터 단백질에 적용될 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> 그림 1 : 모터리스 KIF5B 돌연변이 체의 발현은 세포질에서 C-MYC 응집을 유도 (A) 헬라 세포는 tdTomato-태그 야생형 (WT) KIF5B (적색)과 TagCFP - 태그 C-MYC (파란색)으로 형질 감염시켰다.. MYC는 C-핵에 주로 등장 TagCFP-태그 동안 tdTomato-태그 WT KIF5B는 세포질에 주로 나타났다. 그러나, tdTomato-태그 모터리스 KIF5B 돌연변이 (빨간색)은 세포질에서 사상 또는 반점 집계를 형성했다. 모터리스 KIF5B의 발현은 C-MYC의 응집을 유도. 돌연변이 KIF5B 및 C-MYC의 함께 (핑크) 공동는 지역화. CFP-C-MYC (%)의 집계를 나타내는 세포 (%)의 비율이 표시됩니다. 결과로서 도시SD (N = 3) ± 의미한다. tdTomato-태그 KIF5B 단백질 또는 빈 벡터 (V)와 함께 TagCFP - 태그 C-MYC의 발현과 음성 대조군은 하단 패널에 표시됩니다. (B) 유사한 결과 tdTomato 태깅 WT 또는 모터리스 KIF5B 단백질 (적색)을 나타냈다 내인성 C-MYC (녹색)로 수득 하였다. tdTomato-태그 모터리스 KIF5B 돌연변이는 세포질에 집계를 형성하고, 내생 C-MYC의 응집을 유도. 집계의 두 종류의 세포질 (오렌지)에서 함께 지역화 공동. 핵은 염료의 Hoechst 33342 또는 DAPI로 염색 하였다. 스케일 바; 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> 그림 2 : 모터리스 KIF5B 돌연변이 체의 발현은 t에서 내인성 p53의 응집을 유도내인성 p53의 (녹색)이 핵을 중심으로 등장하면서 그 HeLa 세포이다. 세포질 외인성 tdTomato 태깅 된 야생형 (WT) KIF5B (적색), 세포질 주로 나타났다. 반면, 태그가 tdTomato 모터리스 KIF5B 돌연변이 (적색) 세포질 응집체 형성. 모터리스 KIF5B의 발현은 세포질 (노란색)의 KIF5B의 공동 현지화 및 p53의 결과, p53의의 응집을 유도. 실험을 3 회 실시 하였다. 핵은 DAPI 염색으로 염색 하였다. 스케일 바; 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> 그림 3 :. 모터리스 KIF5B 돌연변이 체의 발현은 세포질에서 C-FOS를 응집을 유도하지 않습니다 야생형을 tdTomato가-태그 (WT) KIF5B (적색) 등장주로 EGFP-C-에 Fos (녹색)이 핵을 중심으로 등장 동안 HeLa 세포의 세포질에서. 반대로 tdTomato 태깅 KIF5B 모터리스 돌연변이 (적색) 세포질 응집체 형성. 모터리스 KIF5B의 발현은 C-FOS를 응집을 유도하지 않았다. 실험 4 번 수행 하였다. 세포의 핵은 DAPI 염색으로 염색 하였다. 스케일 바; 20 μm의. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> 공통의 역방향 프라이머 </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> 야생형 KIF5B 정방향 프라이머 </td><td> AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT 5&#39;-3 &#39; </td></tr><tr><td> 모터리스 KIF5B 정방향 프라이머 </td><td> AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC 5&#39;-3 &#39; </td></tr></tbody></table>표 1 : 야생 형 및 모터리스 KIF5B 단백질을 복제하기위한 프라이머 시퀀스.

여기에서, 프로토콜은 키네신 -1-화물을 식별하기 위해 제시된다. 키네신-1 중쇄 (KIF5B)의 모터리스 돌연변이는 세포질에 집계 및화물의 응집을 유도한다. 모두 집계는 형광 현미경에서 검출된다. 유사한 전략이 다른 모터 단백질화물을 식별하기 위해 사용될 수있다.

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

이 방법론의 전반적인 목표는 형광 현미경을 사용하여 Kinesin-1 화물을 식별하는 것입니다. 이 방법은 키네신(kinesin)과 미오신 (myosin)에 의해 운반되는 화물과 같은 분자 모터 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 우성 음성 KIF5B 돌연변이가 형광 현미경을 사용하여 이 화물을 시각적으로 식별하는 데 도움이 될 수 있다는 것입니다.먼저 40X 이하에서 살아있는 세포 또는 간접 형광 이미징을 위해 6개의 웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 완전한 배지에 0.2 - 0.3 백만 개의 HeLa 세포를 공급합니다. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 성장시킵니다. 배율이 40배 이상인 간접 면역형광 연구의 경우, 오염을 방지하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 절대 알코올을 사용하여 커버 유리를 세척하고 6웰 플레이트의 웰에 세워 자연 건조합니다.커버 슬립이 건조되면 웰에 놓고 플레이트의 각 웰에 1밀리리터의 완전한 DMEM에 0.2-0.3 백만 개의 세포를 파종합니다. 세포를 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날, 생물 안전 캐비닛 내부에서 0.1ml의 트랜스펙션 배지를 사용하여 후보 화물 단백질을 발현하는 플라스미드의 유무에 관계없이 0.6마이크로그램의 td토마토 태그가 부착된 야생형 또는 모터리스 KIF5B 발현 플라스미드를 희석합니다.또 다른 1.6ml 마이크로 원심분리기 튜브에서 1.8μl의 transfection 시약을 0.1ml의 transfection 배지에 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5분 동안 배양합니다. 다음으로, 0.1ml의 희석된 transfection 시약을 희석된 DNA 샘플에 추가합니다.튜브를 뒤집어 내용물을 섞고 5초 동안 회전시킵니다. 그런 다음 샘플을 실온에서 45분 동안 배양합니다. transfection 복합체의 형성을 위한 잠복기 동안 PBS를 사용하여 세포를 세 번 세척합니다.그런 다음 각 웰에 0.8 mililit의 예열된 transfection 배지를 추가하고 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 희석된 transfection 시약을 45분 동안 배양한 후 플레이트의 각 웰에 용액 0.2militer를 적가합니다. 6웰 플레이트를 5초 동안 부드럽게 흔든 다음 섭씨 37도의 인큐베이터에 6-8시간 동안 다시 넣습니다.그런 다음 완전한 DMEM을 사용하여 매체를 교체하십시오. 추가로 16시간의 배양 후 살아있는 세포 이미징을 수행하려면 DNA 삽입 염색 Hoechst 33342를 배지에 최종 농도 1마이크로몰까지 추가하고 세포를 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 40X 대물렌즈를 사용하여 세포의 형광 단백질 발현을 검사합니다.형질주입 시약으로 배양된 세포에 대해 간접 면역형광을 수행하려면: 텍스트 프로토콜에 따라 파라포름알데히드를 준비한 후 실온 PBS를 사용하여 6개의 웰 플레이트를 5초 동안 소용돌이쳐 세포를 세척합니다. 웰당 갓 준비한 4% 파라포름알데히드 1ml와 PBS를 넣고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 플레이트를 소용돌이쳐 세포를 한 번 씻고 용액을 버립니다.다음으로, PBS의 0.1%Triton-X 100 1밀리리터를 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양하여 세포를 투과시킵니다. 그런 다음 PBS를 사용하여 세포를 네 번 세척하고 세척할 때마다 용액을 버립니다. 1차 항체를 추가하고 실온에서 4시간 동안 흔들면서 세포를 배양합니다.배양 후 PBS를 사용하여 플레이트를 소용돌이쳐 세포를 4번 세척합니다. 그런 다음 형광 염료 접합 2차 항체 1ml를 추가하고 실온의 암흑 속에서 2시간 동안 흔들면서 배양합니다. PBS로 세포를 4회 세척한 후 DAPI 1ml를 넣고 실온의 암흑 속에서 10분 동안 배양합니다.샘플과 함께 커버 안경을 사용하는 경우, 현미경 슬라이드 중앙에 10마이크로리터의 장착 용액을 바르고 장착 용액 위에 커버 유리를 장착합니다. 그런 다음 밤새 실온에서 어두운 곳에서 배양합니다. 다음 날, 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉하고 밤새 흄 후드에서 어둠 속에서 배양합니다.형광 현미경 검사를 수행하려면 DAPI, CFP, FITC 및 Cy3용 필터 세트와 함께 40X 대물렌즈를 사용하십시오. 여기에서 입증된 바와 같이, 외인성으로 발현된 야생형 KIFB는 세포질에서 균일하게 나타난 반면, c-MYC는 주로 핵에서 나타났습니다. 그러나 모터가 없는 KIF5B 돌연변이는 세포질에서 응집체를 형성했고 이는 c-MYC의 응집으로 이어졌습니다.또한, 모터리스 KIF5B는 내인성 c-MYC와 전사 인자 p53의 응집을 유도했는데, 이는 c-MYC와 p53이 모두 Kinesin-1의 화물이고 KIF5B가 두 내인성 단백질의 세포 내 국소화를 조절한다는 것을 나타냅니다. 이 그림은 모터리스 KIF5B 돌연변이의 발현이 c-Fos의 세포 내 국소화에 영향을 미치거나 응집을 일으키지 않았기 때문에 KIF5B에 의한 전사 인자의 이동이 특이적인 것으로 보인다는 것을 보여줍니다. 이러한 데이터는 이 비디오에서 시연된 방법이 Kinesin-1 화물의 높은 특이성 식별을 가능하게 한다는 것을 보여줍니다.이 절차를 시도하는 동안, 세포질의 부피가 많은 세포에 가장 적합한 kinesin이 세포질에 응집되어 세포질에 응집되는 것을 쉽게 관찰할 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 개발 이후, 이 기술은 분자 모터 분야의 연구자들이 특정 화물을 식별하기 위해 다른 키네신과 미오신 의 유사한 우성 음성 돌연변이를 구성할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 형광 현미경을 사용하여 이 화물을 식별하기 위해 분자 모터의 우성 음성 돌연변이를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.페노, 브롬화 에티듐 및 파라포름알데히드로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하는 동안 직접적인 피부 접촉을 피하기 위해 항상 예방 조치를 취해야 한다는 것을 잊지 마십시오. 시청해 주셔서 감사합니다. 실험에 행운을 빕니다.

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

표면 준수 kinesin 모터 단백질이 nanoscale 교통 시스템으로 제공할 수에 글라이딩 기능화 microtubules로 구성된 분자 셔틀. 여기 전형적인 셔틀 시스템의 조립이 설명되어 있습니다.

Kinesin 전원 분자 셔틀로화물 로딩

단일 분자 현미경은 핵 수송에 새로운 통찰력을 제공 approch.

원자력 교통 단일 분자 이미징

이것은에서 활성 전체 길이 Kinesin를 분리하는...

Kinesin의 분리 및 정제에서 Drosophila 태아

소포 또는 세포 소기관과 같은 화물의 세포 내 수송은 편광된 미세소관을 추적하는 분자 운동 단백질에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 뉴런 내부로 이동하는 개별 화물 입자의 수송 방향성과 관련 운동 단백질의 상대적 양 및 유형의 상관관계를 설명합니다.

사용 축삭화물을 이동하는 분자 모터의 구성을 특성화 &quot;화물 매핑&quot;분석

키네신은 미세 소관과 염기에 의존하는 상호 작용에 의해 특징 : 미세 소관의 상호 작용의주기에 결합 ATP 매출의주기를. 여기서는 형광 표지 뉴클레오티드 및 정지 흐름 형광을 사용 키네신의 ATP 턴 오버주기 개별 뉴클레오티드 천이 동력학을 분석하는 프로토콜을 기술한다.

형광 흐름 중지 및 레이블 뉴클레오티드의 사용은 키네신의 ATP 턴 오버주기를 분석하는

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

양방향 유사분열 키네신-5 Cin8은 운동성 동안 분열되고 병합되는 클러스터에 축적됩니다. 클러스터에 축적되면 Cin8의 속도와 방향성도 변경됩니다. 여기에서, 정제된 Cin8-GFP를 사용한 운동성 분석 및 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 모타일 특성의 분석을 위한 프로토콜이 기재되어 있다.

S. cerevisiae 세포로부터 정제된 양방향 Kinesin-5 Cin8의 단일 분자 및 클러스터의 이동성

우리는 동적 미세 소관 및 형광 표지 된 미세 소관 관련 단백질의 동시 이미징을 위해 간섭 반사 현미경 검사 및 전체-내부-반사-형광 현미경을 구현하기위한 프로토콜을 제시합니다.

동시 간섭 반사 및 전체 내부 반사 형광 현미경 검사 이미징 동적 미세 소관 및 관련 단백질

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.

Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석

이 논문은 살아있는 선충에서 단일 뉴런 해상도로 내인성 표지된 화물의 축삭 수송을 시각화하기 위한 형광 현미경 획득 매개변수의 최적화에 대해 설명합니다.

Optimizing Visualization of Axonal Transport of Endogenous Cargo(내인성 화물의 축삭 수송 시각화 최적화)는 Living Caenorhabditis elegans에서 형광 현미경을 이용합니다.

학습하세요 형광 현미경을 사용하여 Kinesin-1 화물을 식별하는 방법을. HeLa 세포에서 motorless KIF5B 돌연변이체를 이용해 c-MYC와 p53 같은 화물을 시각화하고 세포 내 분자 모터 기능을 연구하세요.

형광 현미경을 사용 키네신 -1-화물 식별

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