Name: 근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: 배우세요 근적외선 광면역요법을 사용하여 혼합 3D 세포 배양에서 특정 세포를 선택적으로 제거하는 방법을. 이 기술은 주변 세포 손상을 최소화하며 조직 공학 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 암 연구를위한 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 교내 연구 프로그램, 국립 암 연구소, 센터에 의해 지원되었다.

참고 : 다음 프로토콜은 NIR-PIT를 사용하여 특정 세포를 제거하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 컨트롤 및 NIR-PIT 및 세포 생존에 대한 기타 세부 사항은 다른 곳에서 18 찾을 수 있습니다. 단일 클론 항체에 IR700 1. 활용 (단클론 항체) <ol><li> 2-5 밀리그램 / 0.1 M 나 2 HPO 4 (PH 8.6) 용액 ㎖의이자의 단클론 항체를 준비합니다. </li><li> microcentrifuge 관에 0.1 M 나 2 HPO 4 용액 (PH 8.6)에 10 mM의 IR700의 30.8 nmol의와 단클론 항체의 6.8 nmol의 혼합과 알루미늄 호일로 덮여 1 시간, 실온에서 품어. </li><li> 두 번, 15 ml의 PBS와 PD-10 컬럼 (자재 / 장비의 표 참조) 씻으십시오. 단계 1.2에서 샘플을로드합니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라 PBS 용출하여 PD-10 컬럼을 통해 정제하여 혼합물. 참고 : 여기에, 용출 IR700의 밴드 색깔을 따라했다. 300 ㎕의 샘플의 경우, PBS 용출 분획을 4.4 ml를 전형적으로 2.5 ㎖의 사이이다. </li><li> 결정분광 광도계 (9) 595 nm에서 흡광도를 측정하여 쿠마시 염색으로 단백질 농도. 각각의 단클론 항체 분자에 접합 구 형광 분자의 수를 확인하는 689 nm에서의 흡수율 IR700의 농도를 결정한다. 주 : 분광 한 단클론 항체에 IR700 분자 최적 접합 수를 결정하는 것이 중요하다. 일반적으로, 1 단클론 항체 분자의 3 주위 IR700 분자는 모두 생체 외 및 생체 작업에 최적입니다. HPLC 및 SDS-PAGE 방법은 단클론 항체 및 IR700가 결합 여부를 여부를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 단백질 농도를 측정 한 후 4 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> 혼합 된 3 차원 세포 배양 2. 준비 (회전 타원체 혼합) <ol><li> 드롭 플레이트 매달려의 판 저수지 섹션에 멸균 수 (약 1 ml)에 적용합니다. </li><li> A431-루크-GFP 세포와 3T3-RFP 세포 - 다양한 관심의 세포 유형의 비율을 준비 -배지를 50 μL에 현탁 총 5000 세포를 포함하는 각 샘플. 참고 : 문화 미디어에 대한 관심의 세포 유형의 비율이 세포 유형에 따라 등 100, 100, 10 : 100, 25 : 100, 50 (1)을 준비합니다. </li><li> 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 96 웰 플레이트에 매달려 드롭 5-7 일간 인큐베이션 믹스. 매 2 일 문화 매체를 변경합니다. 참고 : 세포를 포함하는 상품으로, 3D 정밀하게 회전 타원체 수 있도록 부드럽게 판을 처리하기 위해 3 차원 형상을 형성하기 전에 쉽게 떨어져. </li><li> 40X 배율 - 10 배에서 반전 시야 현미경을 사용하여 회전 타원체의 형태와 크기를 관찰한다. 참고 : 세포 유형과 매달려 드롭의 크기에 따라 다르지만, 구형의 직경도 감소 플레이트 매달려 96 7 일간 배양 한 후, 약 400 내지 600 ㎛의 것을 보장한다. </li></ol> 혼합 된 3 차원 세포 배양을위한 체외 NIR-PIT 3. <ol><li> 헥타르의 미디어 변경10 μg의 / ㎖ 항체 photoabsorber 복합체 (APC)를 포함하는 미디어 드롭 플레이트 플 레이어, 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 6 시간 동안 배양한다. </li><li> 6 시간 배양 한 후, 신선한 문화 매체 (페놀 레드 무료)로 두 번 회전 타원체를 씻는다. 끝이 절단 부드럽게 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 100 ㎕의 신선한 페놀 레드 무료 문화 매체와 유리 바닥 50mm 접시에 회전 타원체를 전송합니다. 각각의 접시에 한 회전 타원체를 놓습니다. </li><li> 형태의 변화를 검출하는 반전 시야 현미경 타원체를 관찰한다. 다음 필터 설정을 형광 현미경을 사용하여 광 기자 (예 : GFP 및 RFP)를 관찰 : GFP - 469 nm의 여기 필터, 525 nm의 방출 필터; RFP - 559 nm의 여기 필터, 630 nm의 방출 필터. </li><li> 사출 용 유리 - 바닥 접시 위에 발광 다이오드 (LED)를 배치했다. 주 : 타원체는 NIR에 노출 될 수있다현미경 또는 층류 후드에 하나 켜집니다. <ol><li> 광 파워 미터 (9) 근적외선 광의 파워 밀도를 측정한다. 본 측정에 따르면, 2 J / cm 2에서의 670 내지 710의 파장에서 광을 방출하는 발광 다이오드 (LED)를 통해 근적외선 광을 조사한다. 참고 : LED 조명은 약 5 인치 최대 깊이 침투 할 수 있습니다. NIR-PIT의 세포 독성 효과에 관계없이 전력 밀도와 노출 23 시간 만 주어진 에너지에 의존한다. </li></ol></li><li> 조사 후, 신선한 배지를 50 μL로 새로운 매달아 놓기 플레이트에 회전 타원체를 전송하고 37 ° C, 5 % 이산화탄소에서 가습 된 배양기에서 하루 동안 배양한다. </li><li> 조심스럽게 잘라 끝 멸균 200 μL 피펫 팁을 사용하여 신선한 문화 매체 (페놀 레드 무료) 100 ㎕와 유리 바닥 접시에 회전 타원체를 전송합니다. NIR-PIT 사용 Fi를 한 후 형광 현미경 일일으로 회전 타원체를 관찰LTER 설정 단계 3.3에 기재된. <ol><li> 또는 형광 현미경 (도 2B)를 이용하여 세포질 14,18,22 GFP 형광의 감소에 의해 2 μg / ML의 최종 농도에서 미디어 프로피 듐 요오다 이드를 첨가함으로써 사균을 검출한다. </li></ol></li><li> 표적 세포가 완전히 제거되지 않은 경우 반복 3.1-3.6 단계를 반복합니다. </li></ol>

<ol><li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).</li>
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<li>Sato, K., Nagaya, T., Mitsunaga, M., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+for+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy for lung metastases.</a> Cancer Lett. 365 (1), 112-121 (2015).</li>
<li>Sato, K., Hanaoka, H., Watanabe, R., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Disseminated+Peritoneal+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Disseminated Peritoneal Ovarian Cancer.</a> Mol. Cancer Ther. 14 (8), 141-150 (2014).</li>
<li>Sato, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+of+Gastric+Cancer+Peritoneal+Carcinomatosis+in+a+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy of Gastric Cancer Peritoneal Carcinomatosis in a Mouse Model.</a> PloS one. 9 (11), 113276(2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+Infrared+Photoimmunotherapy+in+the+Treatment+of+Pleural+Disseminated+NSCLC+Preclinical+Experience%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Near Infrared Photoimmunotherapy in the Treatment of Pleural Disseminated NSCLC Preclinical Experience.</a> Theranostics. 5 (7), 698-709 (2015).</li>
<li>Sato, K., Nakajima, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+cell+elimination+in+vitro+and+in+vivo+from+tissues+and+tumors+using+antibodies+conjugated+with+a+near+infrared+phthalocyanine%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">Selective cell elimination in vitro and in vivo from tissues and tumors using antibodies conjugated with a near infrared phthalocyanine.</a> RSC Adv. 5, 25105-25114 (2015).</li>
<li>Watanabe, R., Hanaoka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoimmunotherapy+Targeting+Prostate-Specific+Membrane+Antigen%3A+Are+Antibody+Fragments+as+Effective+as+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">Photoimmunotherapy Targeting Prostate-Specific Membrane Antigen: Are Antibody Fragments as Effective as Antibodies.</a> J. Nucl. Med. 56 (1), 140-144 (2014).</li>
<li>Nakajima, T., Sano, K., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+efficacy+of+Photoimmunotherapy+%28PIT%29+using+a+cocktail+of+antibody+conjugates+in+a+multiple+antigen+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving the efficacy of Photoimmunotherapy (PIT) using a cocktail of antibody conjugates in a multiple antigen tumor model.</a> Theranostics. 3 (6), 357-365 (2013).</li>
<li>Shirasu, N., Yamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+antitumor+effect+of+CEA-targeted+photoimmunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Potent and specific antitumor effect of CEA-targeted photoimmunotherapy.</a> Int J Cancer. 135 (11), 1-14 (2014).</li>
<li>Sato, K., Nagaya, T., Nakamura, Y., Harada, T., Choyke, P. L., Kobayashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+infrared+photoimmunotherapy+prevents+lung+cancer+metastases+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Near infrared photoimmunotherapy prevents lung cancer metastases in a murine model.</a> Oncotarget. 6 (23), 19747-19758 (2015).</li>
<li>Nakajima, T., Sato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+conjugate+and+light+dose+on+photo-immunotherapy+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">The effects of conjugate and light dose on photo-immunotherapy induced cytotoxicity.</a> BMC cancer. 14 (1), 389(2014).</li>
<li>Klimanskaya, I., Rosenthal, N., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derive+and+conquer%3A+sourcing+and+differentiating+stem+cells+for+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Derive and conquer: sourcing and differentiating stem cells for therapeutic applications.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 7 (2), 131-142 (2008).</li>
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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

우리는 NIR-PIT를 사용하여 비 - 표적 세포의 손상없이 혼합 3D 세포 배양으로부터 특정 세포를 제거하는 방법을 보여준다. 지금까지 실제적인 세포 제거 방법 조직이 설립되면 또는 이식 후가 없습니다. 따라서, NIR-PIT이 작업을 수행 할 수있는 유망한 방법이다. 장갑차는 단클론 항체 자체와 유사한 약물 동태를 보여 때문에이 기술은도 18, 22 생체 내에서 이용 될 수있다. 표적 세포 형은 다양한 APC로 구성 될 수있다. 21 - 항 EGFR, 안티 PSMA, 안티 mesothelin, 안티 CEA 등 다양한 항체 또는 항체 단편은 이미 장갑차 (15)을 사용 하였다. 또한, NIR-조사의 영역을 변경하면 치료 영역을 최소화 할 수 있습니다. 여기서, 표적 세포에서 루시퍼 라제 활성의 정량 형광 특정 세포의 완전한 제거가 확인되었다. NIR-PIT 따라서 ...

다른 세포에 손상을주지 않고 특정 세포를 제거하는 것은 특히 설립 조직에서는 매우 곤란하며, 조직 공학 분야에서 세포 제거 방법이 절실히 요구되고있다. 3 - 현재 재생 의학 분야에서, 배아 줄기 세포 (ES), 다 능성 줄기 세포 (PSC를) 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPS)를 이용하여 조직 배양 유망한 재료 1이다. 이러한 조직 재생 유망하지만, 원치 않는 세포 오염의 주요 관심사이다. 또한, 이식 4,5 후 종양 유발의 안전 우려가있다. 많은 연구는 이러한 문제에 집중하고 있지만, 특히 재생 의료 6, 특정 세포를 제거 - (8) 실제적인 방법이 개발되지 않았다. 근적외선 photoimmunotherapy (NIR-PIT)는 항체 - photoabsorber의 conjugat에 따라 치료E (APC). APC는 세포 특이 단일 클론 항체 (단클론 항체)와 photoabsorber, IR700로 구성되어 있습니다. IR700은 친수성 실리카 - 프탈로시아닌 유도체이며, 자체 9 광독성을 유발하지 않습니다. IR700는 공유 라이신 분자의 측쇄상의 아미드 잔기를 통해 항체에 접합된다. APC는 세포막을 표적 분자에 결합하고 690 nm에서 NIR 광에 노출 후 거의 즉각적으로 세포 괴사를 유도한다. 14 - NIR 광, 세포 사멸 (9)에 이르는 세포 멤브레인 파열로 노광시. 21 - NIR-PIT는 항 EGFR, 항 HER2, PSMA 방지, 항 CD25, 항 mesothelin, 항 GPC3 및 안티 CEA (15)를 포함한 다수의 항체 또는 항체 단편으로 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, NIR-PIT는 표적 분자의 다양한 대해 사용될 수있다. 또한, NIR-PIT은 NIR-조명 관리를 제한하여 특정 지역의 선택적 치료를 할 수있는 잘 조절 치료입니다t 조사 18, 22. 여기서는 3D 혼합 배양에서 NIR-PIT를 사용하여 특정 세포를 제거하는 방법을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>IRDye 700DX 에스테르 적외선 염료</td><td>LI-COR Bioscience (Lincoln, NE, USA)</td><td>929-70011</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>SIGMA-ALDRICH (St. Louis, MO, USA)</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G25 column (PD-10)&nbsp;</td><td>GE Healthcare(미국 뉴저지주 피스카타웨이)</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie(브래드포드) 플러스 단백질 분석</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc(미국 매사추세츠주 월섬)</td><td>PI-23200</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta3D 96-Well hanging Drop Plates</td><td>3D Biomatrix Inc(미국 미시건주 앤아버)</td><td>HDP1096-8</td><td></td></tr><tr><td>광 파워</td><td>미터 Thorlabs(미국 뉴턴)</td><td>PM100</td><td></td></tr><tr><td>LED: L690-66-60</td><td>Marubeni America Co. (미국 캘리포니아주 산타클라라)</td><td>L690-66-60</td><td></td></tr><tr><td>벡티빅스(파니투무맙)</td><td>Amgen(미국 캘리포니아주 사우전드 오크스)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35&nbsp; mm 유리 바닥 접시, 접시 크기 35&nbsp; mm, 우물 크기 10&nbsp; mm</td><td>Cellvis (미국 캘리포니아주 마운틴뷰)</td><td>D35-10-0-N</td><td></td></tr></tbody></table>

근적외선 photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3d 문화에서 선택적 세포 제거

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

최근 조직 공학의 발전은 많은 질병에 대한 혁신적인 솔루션을 제공합니다. 예를 들어, 유도만능줄기세포(iPS)를 이용한 조직공학은 재생의학의 새로운 방법으로 떠올랐습니다. 이러한 조직 재생은 유망하지만 조직 배양 중 원치 않는 세포로 인한 오염이 주요 관심사입니다. 또한, 이식 후 종양원성에 대한 안전성 우려가 있습니다. 그러므로, 특히 확립된 조직에서 보호가 필요한 다른 세포를 손상시키지 않고 특정 세포를 제거하는 것이 시급합니다. 여기에서는 비표적 세포를 손상시키지 않고 근적외선 광면역요법(NIR-PIT)을 병행하여 혼합된 3D 세포 배양에서 특정 세포를 제거하는 방법을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 혼합 세포 배양 또는 조직에서 특정 세포를 제거할 수 있습니다.

광학 EGFR 과발현 NIR-PIT, A431 세포주의 효과를 모니터링하기 위해 유전자 또한 GFP와 루시 페라 제 (A431 뤽-GFP)을 표현하기 위해 수정되었습니다. NIR-PIT의 비 표적으로의 Balb / 3T3 세포주 광학적 RFP (3T3-RFP)를 표현하기 위해 변경되었다. APC, panitumumab-IR700 (팬-IR700)를 합성 하였다. 세포 (A431 뤽-GFP 및 3T3-RFP)의 다양한 비율로 구성 된 혼합 타원체는이 프로토콜 (그림 1)에 따라 제조 하였다. 반복 NIR-PIT는 팬 IR700 (도 2a에 처방 참조)와 인큐베이션 하였다. 이 혼합 3D 배양에서 표적 세포의 제거는 달성 형광 루시퍼 활동 (도 2B, C)로 모니터링 하였다. 반면에, 비 표적 세포는 성장을 계속했다. <p class="jove_content" fo:keep-...

다른 세포를 손상시키지 않고 특정 세포를 제거하는 것은 특히 기존 조직에서 매우 어렵지만 조직 공학 분야에서 세포 제거 방법이 시급히 필요합니다. 여기에서는 근적외선 광면역요법(NIR-PIT)을 이용한 혼합 3D 세포 배양에서 특이적 세포 제거 방법을 제시합니다.

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

본 실험 절차의 전체적인 목표는 근적외선 광면역치료를 이용하여 혼합 3D 세포 배양에서 관심 있는 특정 세포를 제거하는 것을 입증하는 것입니다. 이 방법은 재생 의학에 관한 조직 공학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 표적 분자에 대해 사용할 수 있으며, 치료 범위를 관심 있는 특정 병변으로 제한할 수 있다는 점입니다.이렇게 하면 부작용을 최소화할 수 있습니다. 단클론 항체에 IR700을 접합하려면, 마이크로 원심분리 튜브에 Disodium Phosphate에 녹인 IR700과 목적 항체를 넣고 알루미늄 호일로 감싼 뒤 실온에서 1시간 동안 배양하십시오. 배양이 끝나면 PD10 컬럼을 15 mL의 PBS로 두 번 세척하십시오.그 후, 항체 용액을 컬럼에 로딩하고 제조사의 지침에 따라 PBS 용출을 통해 혼합물을 정제합니다. 각 단클론 항체 분자에 접합된 fluoro-4 분자 수를 확인하기 위해, 분광광도계를 사용하여 단클론 항체 단백질 농도를 결정합니다. 그런 다음, 접합체를 4°C에서 보관합니다.혼합 3D 세포 배양을 준비하려면, 96-웰 행잉 드롭 플레이트의 플레이트 리저버 구역에 멸균수 1 milliliter를 넣습니다. 그다음, 37-degree Celsius 및 5%carbon dioxide의 습윤 인큐베이터에서 5~7일 동안 웰당 배지 50 microliters당 최소 5,000 cells의 농도로 적절한 세포 배양 배지에서 대상 세포 유형들을 다양한 비율로 플레이팅합니다. 이틀마다 배양 배지를 교체하고, 도립 명시야 현미경을 사용하여 10~40배 배율로 스페로이드의 형태와 크기를 매일 관찰합니다.스페로이드의 직경이 400에서 600 µm에 도달하면, 행잉 드롭 플레이트의 배지를 항체-광흡수체 접합체가 포함된 배지로 교체하고 플레이트를 인큐베이터에 넣어 6시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 신선한 phenol red-free 배양 배지로 스페로이드를 2회 세척합니다. 그 후, 끝부분을 잘라낸 200 µL 피펫 팁을 사용하여 스페로이드를 하나씩 신선한 phenol red-free 배양 배지 100 µL가 담긴 개별 글래스 바텀 50 mm 디쉬로 옮깁니다.도립 현미경을 사용하여 스페로이드 형태의 변화를 관찰하십시오. 스페로이드에 조사하기 위해, 유리 바닥 배양 접시로부터 5인치 이하의 높이에 발광 다이오드를 배치하십시오. 그리고 광출력계를 사용하여 670에서 710 nm 파장의 빛이 2 J/cm²로 방출되는지 확인하십시오.NIR 적외선 광면역치료 후, 구상체를 웰당 50 µL의 신선한 배지가 담긴 새로운 hanging drop 플레이트로 옮겨 세포 배양 인큐베이터에서 하루 동안 배양합니다. 그 다음, 끝부분을 절단한 또 다른 200 µL 피펫 팁을 사용하여 구상체를 100 µL의 phenol red free 배지가 담긴 새로운 유리 바닥 접시로 조심스럽게 옮기고, 형광 현미경 하에서 광학 리포터 발현을 평가합니다. 마지막으로, 배지에 propidium iodide를 첨가하여 사멸 세포를 검출합니다.또는 세포질의 GFP 형광 소실을 통해 확인할 수 있습니다. 이 대표 실험에서는, 앞서 시연한 바와 같이 A431-luc-GFP와 3T3-RFP 세포를 다양한 비율로 혼합하여 구형체를 준비했습니다. 그 후, 설명된 대로 panitumumab-IR700을 배양하여 NIR 적외선 광면역치료를 반복적으로 수행했습니다.그리고 표적 세포 제거는 현탁 배양(hanging drop cultures) 내의 형광 및 루시페라제 활성 평가를 통해 모니터링되었습니다. 숙련된 경우, 이 기술은 적절하게 수행된다면 1시간 이내에 완료될 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때, 빛 에너지는 역제곱 법칙에 따라 감소한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

이 비디오는 루시페라아제를 발현하는 종양 세포를 나타내는 공학적 마우스 모델에서 폐암을 치료하기 위한 근적외선 광면역요법 기술을 보여줍니다. 종양 세포의 특정 항원에 결합하는 항체-광감작 접합체(APC)를 주입하면 마우스는 근적외선에 노출되어 APC에 광화학적 변화를 유도하고 결합된 종양 세포의 괴사를 유발합니다. 치료의 효과는 루시페라제 기질인 루시페린을 주입하고 종양 성장과 상관관계가 있는 시간 경과에 따른 생물 발광을 측정하여 모니터링됩니다.

쥐 모델에서 폐암을 치료하기 위한 근적외선 광면역요법 기법

이 동영상은 근적외선 광면역요법을 통해 혼합 3D 세포 배양에서 특정 세포를 선택적으로 제거하는 기술을 보여줍니다. 이 방법에서는 NIR 광흡수제와 접합된 항체를 사용하여 표적 세포를 정확하게 식별합니다. 이후 적외선을 조사하면 세포 사멸을 유도하여 3D 배양에서 표적 세포를 효과적으로 제거할 수 있습니다.

혼합 3D 배양에서 표적 세포 제거를 위한 근적외선 광면역요법

이 프로토콜은 특정 관심 세포 유형을 분리하기 위해 desthiobiotin, streptavidin, APTES 시스템의 사용자 정의 가능한 표면 기능화를 설명합니다. 또한 이 원고는 이 프로세스의 적용, 최적화 및 검증을 다룹니다.

유리 표면 기능화를 통해 표적 세포 격리 방법

Photodynamic 치료 (PDT)는 것 적용된 photosensitizer (PS) 뒤에 보이는 빛 photoactivation apoptosis 유도 보육 관련 의료 절차입니다. 우리는 생체 외에서 PDT 프로토콜 PS 인큐베이션 및 가벼운 치료 매개 변수는 차이 연구 하는 데 사용할 수 있습니다 태평양 표준시를 시뮬레이션 하도록 설계 되었습니다 제시.

Photodynamic 치료 체 외에서 접근

근적외선 광면역요법(NIR-PIT)은 항체-광흡수제(IR700Dye) 컨쥬게이트와 NIR 라이트를 활용하여 암세포를 파괴하는 신흥 암 치료 전략이다. 여기서, 우리는 생물발광 이미징을 사용하여 흉막 전파폐암 및 악성 흉막 중피종의 마우스 모델에서 NIR-PIT의 항종양 효과를 평가하는 방법을 제시한다.

흉막 보급의 마우스 모형을 위한 근적외선 광면역요법

조류 배아의 융모막 막 (CAM)은 다양한 연구 분야에 매우 유용하고 적용 가능한 도구입니다. 일본 메추라기 CAM의 특수 ex ovo 모델은 광 역학 치료 조사에 적합합니다.

메추라기 융모막 막 - 광 역학 진단 및 치료를위한 도구

여기에서는 2차원 HeLa 세포 배양 및 베르테포르핀을 감광제로 사용하여 체외 광역학 치료(PDT) 분석을 성공적으로 수행할 수 있는 새롭고 간단하며 저렴한 장치에 대해 설명합니다.

2D 세포 배양 모델에서 Verteporfin 세포 독성을 향상시키기 위한 자체 제작 및 발광 다이오드 기반 광역학 치료 장치

이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

수동 IBEX 방법을 사용하여 저비용의 다목적 광조사 기술을 구현하면 상당한 네이티브 자가형광으로 인체 조직을 최적으로 이미징할 수 있습니다. 이 프로토콜은 도립 현미경, 널리 사용 가능한 시약 및 이미지 정렬 및 처리를 위한 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 보관된 임상 샘플에서 다중화된 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 자세히 설명합니다.

반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

이 프로토콜은 생세포 영상과 유세포분석을 사용하여 인간 자연 살해 세포의 자연 키메라 항원 매개 매개 항체 의존성 세포독성을 일관되게 측정하기 위한 표준화된 시험 관 내 워크플로우를 제공합니다.

키메라 항원 수용체와 치료용 항체에 의해 증강되는 NK 세포 독성을 생세포 영상 및 유동 세포분석을 이용해 정량화합니다

배우세요 근적외선 광면역요법을 사용하여 혼합 3D 세포 배양에서 특정 세포를 선택적으로 제거하는 방법을. 이 기술은 주변 세포 손상을 최소화하며 조직 공학 및 재생 의학 연구에 활용됩니다.

근적외선 Photoimmunotherapy 기술을 사용하여 혼합 된 3D 문화에서 선택적 세포 제거

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