Name: 효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-25T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 학습하세요 마우스 피부에서 효소 다이제스트와 그라데이션 분리를 이용한 침투 백혈구 분리 방법을. 아토피 피부염 등 피부 질환의 세포 및 분자 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

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국립 보건원 (DC에 NIH R15 NS067536-01A1), 국립 Vulvodynia 협회 (DC에 수상), 그리고 매 켈리 스터 대학교는이 작업을 지원했다. 인증 기관은 아놀드와 로벨 베크 재단 자금 매 켈리 스터 대학교 베크 학자 프로그램에서 교제를 받았다. BTF 및 TM은 JDRF 2-2011-662 지원합니다. 우리는 기술적 조언 박사 제이슨 Schenkel 박사 줄리아 루이스 감사, 그들의 도움과 지원에 대한 Chatterjea 랩의 모든 현재의 전 멤버.

주 : 통상적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수와 보관 8~12주 세 여자 ND4 스위스 웹스터 마우스는, 이러한 연구에 사용 하였다 (B13S1)에 사용되는 실험 프로토콜은 매 켈리 스터 대학교의 IACUC에 의해 승인되었다.. 옥사 졸론 1. 과민성 및 도전 <ol><li> 날 0 <ol><li> 4 L 뚜껑 유리 항아리의 하단에 메쉬 아래에 배치 흡수성 수건에 3 ㎖ 이소 플루 란을 추가하여 마취 챔버를 준비합니다. 피사체가 충분히 마취 때까지 여기에서 사용 ND4 암컷 마우스를 들어, 챔버 내의 시간은 30 ~ 60 초이고; 마우스 변형이 사용을위한 마취 관리를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 각 마취 마우스의 뒷면을 면도하고 동물 머리 트리머를 사용하여 측면에. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 무수 에탄올로 -4-에 톡시 -2- 페닐 -2- 옥사 졸린 -5- 온 (옥스)의 2 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다. </li><li> 간단히 마취1.1.1에서 설명하고 약 20 μL 각의 여러 직렬 응용 프로그램에서 다시 면도 2 % 황소의 100 μl를 적용 할 이소 플루 란 마취를 사용하여 마우스. 건조 할 수있는 솔루션을 직렬 응용 프로그램 사이에 5 ~ 10 초를 기다립니다. </li><li> 다시 이외의 지역에 2 % 황소 솔루션을 유출 방지 및 응용 프로그램 사이에 건조 할 수있는 솔루션을 기다려야주의하십시오. </li></ol></li><li> 일 5-7 <ol><li> 절대 에탄올 (황소)의 1 % 용액을 제조하고, 인큐베이터에서 회전판에 15 분 동안 50 ℃에서 배양한다. </li><li> 부드럽지만 확실히 위를 향하도록 복부와 목, 꼬리베이스의 목덜미에 마우스를 고정하고 목은 약간 (복강 내 주사에 대한 파악과 유사) 아래로 기울어 여러 직렬 응용 프로그램에서 면도 측면에 1 % 황소의 100 μl를 적용 상술 한 바와 같이 시간을 복용 후 피부를 건조. </li><li> 대조군 마우스를 들어, 면도 플랜에 무수 에탄올 차량의 100 μL를 적용케이. </li></ol></li></ol> 2. 옆구리 피부 수확 <ol><li> 이산화탄소 흡입을 사용하여 쥐를 안락사, 조심스럽게 10cm 수술 용 가위로 측면 피부 (~ 피부의 25mm X 25mm)의 원하는 영역을 절제. </li><li> 깨끗한, 날카로운 칼날을 사용하여 수술, 플랭크 피부에서 과다 지방 및 결합 조직을 얻어 긁어. </li><li> 칼슘 또는 마그네슘, 5mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA),없이, 페놀 레드 10 ㎖ RT HBSS를 [함유하는 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 3 마우스의 옆구리 피부의 3 개 배치 된 10 mM 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 및 10 % 소 태아 혈청 (FBS)]. </li></ol> 3. 사전 소화 조직 세탁기 <ol><li> 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브. </li><li> 인큐베이션 기간의 끝에서 10 초 동안 격렬하게 소용돌이. </li><li> 70 μm의 통하여 튜브의 내용을 변형여과기는 세척 버퍼를 무시하고 조직을 수집합니다. 단일 여과기는 생물 처리 그룹 내 전체 과정에 걸쳐 재사용 할 수있다. </li><li> 집게의 쌍을 사용하여, (전술 한 바와 같이 EDTA, HEPES, 및 FBS 함유) 신선 RT HBSS 매체 10 ㎖를 함유하는 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 여과기에서 플랭크 피부 옮긴다. </li><li> 조직 조각이 평균 면적의 약 2.2 mm X 2.2 mm가되도록 튜브 내로 침지 외과 해부 위 12.5 cm 쌍과, 플랭크 피부의 각 부분을 말하다. </li><li> 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 피부 절편을 함유하는 장소 튜브. </li><li> 배양의 마지막에 10 초 동안 격렬하게 소용돌이 </li></ol> 피부 4. 콜라게나 소화 <ol><li> , 70 ㎛의 여과기를 통하여 튜브의 내용물을 걸러 모아 새로운 50 ml를 함유하는 원뿔형 튜브에 10 ㎖ FRE 플랭크 피부 편을 전송할SH, RT HBSS 미디어가 0.7 mg을 보충 / 디를 콜라게나 ㎖로 </li><li> 37 ° C로 유지 건식 비 가스실 배양기에서 30 분 동안 회전 접시에 소화 매체 피부 절편을 함유하는 장소 튜브. </li><li> 배양의 말에 적극적으로 10 초 동안 튜브의 소용돌이 내용. </li><li> 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 여과기를 통해 튜브의 필터 내용; 소화 조직을 함유하는 관류를 유지하고 스트레이너 버리고 피부 파편의 측면. </li><li> 350g에서 5 분간 HBSS 매체 원심 50ml에 플로우 스루를 세척하고 상등액을 가만히 따르다. </li></ol> 5. 밀도 구배 원심 분리 <ol><li> 혈청 피펫을 사용하여, 각각의 샘플에 대한 새로운 15ml의 원뿔형 튜브로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)로 3 ㎖ RT 67 % 밀도 구배 원심 분리 배지를 추가한다. </li><li> 페놀 레드와 HBSS에 5 ml의 RT 44 % 밀도 기울기 원심 분리 미디어 세포 펠렛을 Resuspend. </li><li> 신사LY 층 혈청 피펫을 사용하여 67 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 샘플의 상부에 세포를 포함하는 44 %의 밀도 구배 원심 분리 배지 5 ㎖. 가장 느린 속도에 피펫을 설정하고, 원뿔 튜브의 벽을 따라 피펫을 배치해야합니다. , 동요하지 않도록주의 중단, 또는 기울기를 반전. </li><li> 가장 낮은 설정으로 설정 가속, 원심 분리기 균형있는 것을 확인하고, 실온에서 20 분 동안 931 XG에 그라데이션을 브레이크를 해제하고, 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 조심스럽게 원심 분리기에서 그라디언트를 제거하고 부드럽게 똑바로 튜브를 들고 실험실 벤치에 운반 할 것. 5 ㎖ 플라스틱 전달 피펫을 사용하여, 새로운 15ml의 원뿔형 튜브에 44 % 및 67 %의 밀도 구배 원심 분리 및 전송 매체의 계면에 전지 층을 제거한다. 인터페이스가 표시되지 않는 경우, 단순히 67 % -44 %의 경계에서 액체의 약 2 mL를 제거합니다. </li><li> INTE으로부터 세포를 함유하는 원뿔형 튜브를 채우기2 % 1X 빙냉 PBS에서 FBS, 350 XG에서 5 분 동안 원심 분리 세포 및 상등액을 가만히 따르다와 rface. 주 : 소화 단계가 37 ℃이며, 밀도 구배 원심 분리 배지를 RT 단계에 있기 때문에 이것은 세포가 냉각 될 수 있음은 처음 / 감기 있었다. 셀 (1)에 재현 탁 될 수있다 : 1 트리 판 블루 희석 수 및 생존력 정보이 시점에서 얻을 수있다. </li></ol> 6. 차단 및 염색 유세포 분석 <ol><li> 블록 FcγRII / 비특이적 항체 염색을 방지하기 위해 세포상의 수용체 III. 접합 결합하는 CD16 / 32 (2.4G2)에 대한 항체와 블록 FcγRII / III 수용체의 100 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, 1을 포함하는 2 % FBS와 PBS에 항체 마스터 믹스를 확인합니다. </li><li> CD3ɛ (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD8α (53-6.7), CD11b를 (M1 / 70)의 CD11c (N418), CD44 (IM7), CD45 (대한 항체의 적절한 마스터 믹스와 차단 된 세포를 품어 30-F11) CD45R(RA3-6B2), CD62L는 (MEL-14), 및 LY-6G / LY-6C (GR-1) (RB6-8C5)뿐만 아니라 화려한 바이올렛 (510) 라이브 / 죽은 얼룩은 죽은 세포를 식별합니다. 희석 제조업체에서 권장하거나 이전에 연구자들에 의해 최적화 된 모든 항체를 사용합니다. (100) 희석 : 여기에 설명 된 실험을 위해, (1) 모든 항체를 사용합니다. </li><li> 2 % FBS와 50 μL 1X PBS 염색 버퍼에 세포에 resuspend을 씻으십시오. 형광 데이터는 유세포에 취득 될 때까지 얼음 상에 유지한다. 주 : 보정 파라미터 형광 데이터의 취득 전에 림프 조직 및 (CD4 또는 CD8과 같은) 공통의 세포 표면 항원에 미리 최적화하는 것이 중요하다. </li><li> 분석 계측법 하류 흐름 세포의 수를 증가 염색 된 세포의 전체 샘플들로부터 데이터를 수집한다. </li></ol> 7. 다음과 같은 단계를 수행하는 표준 방법을 사용하여 유동 세포 계측법 데이터 분석 <ol><li> 앞으로 분산의 림프구 지역에 우선, 게이트측면 산란 (지역) 음모에 의해 (지역). </li><li> 그런 다음, 이중선을 분석 방지하기 위해 측면 분산 (폭)에 의해 전방 산란 (폭)를 사용하여 하나의 셀을 선택합니다. 이것은 또한 사이드 산란 플롯에 의해 가로 전방 산란 높이로 달성 될 수있다. </li><li> 이어서, 혈통 게이트 (는 CD11b, CD11c 양성 및 CD45R / B220) -negative 및 CD3 양성 이벤트 제외하는 대 식세포, 수지상 세포와 B 세포를 각각과 목표인지를 한정은 T 세포 구획 분석 이 여기로, T 세포에 침투 평가한다. </li><li> 다음, 라이브 / 죽은 얼룩을 제외 살아있는 세포에 문입니다. </li><li> 마지막으로, 관심의 세포 인구에 게이트 (대표 결과 섹션 참조). </li></ol>

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이러한 아토피 성 피부염이나 건선과 같은 피부 질환의 설치류 모델에서 피부에 상주하는 백혈구의 변화를 특성화하는 염증 세포의 유입과 질병 병리 사이의 기계적 연결을 이해하는데 중요하다. 여기에서 우리는 대부분의 생물 의학 연구 실험실에서 발견되는 기본 장비로 피부 조직에서 백혈구를 분리하는 경제적 인 방법을 설명합니다. 이 상대적으로 빠른 기술은 실험실 벤치에서 시간에 손을-최소화하면서 자원을 보존하는 데 도움 비싼 조직 해리 기계 및 사용자 정의 튜브 및 시약의 사용을 방지 할 수 있습니다. 부드러운 효소 소화 및 불연속 구배 분리는 상피 세포와 파편, 및 분리 된 세포의 대부분은 유세포 분석, 세포 분류, 전송, 세포 배양 물 및 생체 외 자극 분석법에 포함 하류 다양한 용도에 사용될 수 제거. 콜라게나 제 효소와 D 다이제스트 T 세포 표면 마커 무결성 및 preser에 영향을주지VES의 세포 생존. 이 프로토콜은 쉽게 측면 이외의 영역들로부터 피부를 처리하기 위해 수정 될 수있다. </p...

접촉 성 피부염, 습진, 건선, 봉와직염, 비 흑색 종 피부암에 곰팡이 감염 및 농양에 이르기까지 피부 상태는 전세계 50 가장 널리 퍼진 질병들로 발견되었고 2010 1 치명적 질병의 네 번째 선도적 인 글로벌 원인. 따라서, 다양한 피부 병변을 기본 분자 및 세포 메커니즘의 조사 연구에 필요한 활성 영역입니다. 설치류 모델은 아토피 성 피부염 (2), (3), 건선, 또는 포도상 구균 감염 4 같은 염증성 피부 질환의 이해에 도움이 현저하게되어왔다. 마우스 피부 조직의 효소 적 소화, 저렴하고 효율적이며 간단한 프로토콜 나은 피부 질환의 병태 생리를 이해 하류 다양한 용도에 사용할 수있는 세포의 제제를 제공 할 수있다. 여기서, 간단하고 경제적 인 방법은 마우스 피부 효소에 대해 기재되어 다이제스트조직 및 세포 배양, 생체 대체 전송에 사용할 수있는 피부 침투 백혈구의 분리, 유세포 분석 및 분류 또는 유전자 발현 연구를 흐른다. 이 절차의 목적은 통상적으로 전체적인 맞춤 시약 키트 및 기계적 dissociators와 연관된 비용을 최소화하면서 높은 세포 생존율과 피부 백혈구 침윤의 단일 세포 현탁액을 제조하는 공정이다. 기존의 피부 조직 해리 방법 5-7 낮은 세포 생존 및 표면 마커의 무결성 결과, 또는 사용자 정의 효소 키트와 고가의 조직 해리 기계 8-11 필요할 수 있습니다. 마우스 귀 피부 조직의 소화가 합리적으로, 12 ~ 13 유행 높은 각화 피부 조직을 소화하는 동안 (예를 들면 측면에서) 비 세포 파편 많은 양의 오염 된 세포 준비가 발생할 수 있습니다. 최근의 연구에서, 자이드와 동료가 2.5 mg을 90 분 동안 마우스 측면 피부를 소화 / ㎖ 디스 파제, FOLLO3 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제 (7)에 의해 45 분 결혼. 또 다른 연구에서, 이들 연구자들은 트립신 / EDTA, 콜라겐 III의 사용을 포함하는, 2.5 시간의 조합으로 여러 소화 배양을 사용하고, (5) 디스 파제. 다른 제조업체의 트립신으로 처리 잴 포유 동물 세포에서 14-15 세포 표면 단백질의 무결성에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 트립신의 사용은 피부 효소 소화에 권장되지 않는다. 또한, 디스 파제는 CD4 및 CD8α T 세포의 증식 능력에 심각한 영향을 미칠 수 및 CD62L (16)와 같은 일반적인 T 세포 활성화 마커를 포함, 최소 20 분자의 표면 풍요 로움에 영향을 미칩니다. 다른 프로토콜은 소화 매체 (6)에 RPMI 1640을 사용합니다. 그러나, RPMI에 Mg2 +, Ca2 + 등의 존재는 광범위한 세포 응집 (17)가 발생할 수있다. 조직 분리를위한 이상적인 프로토콜은 높은 세포 생존 능력, 낮은 목표로한다세포 응집, 최소한의 손상의 수준은 표면 단백질을 세포합니다. 고품질 림프절 간질 세포 제제는 짧은 효소 배양, 칼슘 및 마그네슘이없는 배지 2+ 프로토콜을 사용하여 수행하고, 트립신을 피하고 18 디스 파제되었다. 그러나, 이러한 유형의 프로토콜은 전체 마우스 피부의 해리에 대해 확립되지 않았다. 여기에서, 프로토콜은, 해리 분리 및 알레르겐 - 도전 마우스 옆구리 피부에서 피부 백혈구 침윤을 풍부하게 기재되어있다. 간략하게, 절제된 피부 소화 조직을 연화 초과 각질이나 지방 조직을 제거하기 위해 1 시간 동안 10 % 소 태아 혈청 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)로 미리 배양된다. 이것은 0.7 mg을 함께 30 분간 효소 분해 단계 뒤에 / ㎖의 콜라게나 D. 콜라게나 D 그것을 만드는 최소 세포 표면 마커의 농도에 대한 영향, 및 시험관 (16, 18)에서 T 세포 증식에는 영향을주지표면 단백질의 특성을 포함하는 애플리케이션에 매우 적합하다. 효소 분해 후, 불연속 밀도 구배 원심 분리는 단일 세포 현탁액으로부터 상피 세포 및 잔해를 제거하고, 조혈 세포 농축 하였다. 중요한 것은,이 절차는 비싼 열 기반 자기 세포 분리 시약 및 티슈 기계 8-11 해리를 방지하고 기본 생의학 연구소에 위치한 재료 및 장비로 수행 될 수있다. 여기에서이 프로토콜 (19 각색) 이전에 감응 ND4 스위스 쥐 합텐 옥사 졸론 (황소)와 측면 피부에서 도전 세번 백혈구를 분리하는데 사용 하였다. 세포는 파라 메트릭 멀티 - 유동 세포 계측법을 사용하여 분석 하였다. 이 기술은 최소한의 파편과 계측법 영향 SK에 T 림프구와 호중구의 침윤을 측정하기 위해 파라 메트릭 다중 흐름으로 분석 하였다 격리 림프구의&gt; 95 %의 생존율을 가진 세포 현탁액을 수득에서.

<table><tbody><tr><td>페놀이 적색, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 액체</td><td>Sigma Aldrich</td><td>55021C</td>가 함유된 HBSS <td>사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오.</td></tr><tr><td>헤페스, &ge; 99.5% (적정)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염 용액</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td>사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오.</td></tr><tr><td>소 태아 혈청, USDA, 열 비활성화, 프리미엄 셀렉트</td><td>MidSci</td><td>S01520HI</td><td>사용하는 날까지 멸균 상태를 유지하십시오.</td></tr><tr><td>Percoll, pH 8.5-9.5 (25°C; C)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>멸균 상태를 유지하십시오. Percoll은 사용하기 전에 멸균 10X PBS로 등장 음으로 만들어야합니다.</td></tr><tr><td>트리머 콤보 키트</td><td>Kent Scientific</td><td>CL9990-1201&nbsp;</td><td>더 큰 트리머를 사용하여 옆구리와 등을 면도하십시오.</td></tr><tr><td>4-Ethoxymethylene-2-phenyl-2-oxazolin-5-one</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E0753-10G</td>는 <td>50°C에서 100% EtOH에 용해됩니다. C를 회전판에서 15분 동안 누릅니다.</td></tr><tr><td>정제된 안티 마우스 CD16/CD32 (2.4G2)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td>유세포 분석을 위한 항체 염색 중 비특이적 항체 결합을 차단하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD3&epsilon;-BV650 (145-2C11)</td><td>Becton Dickinson</td><td>564378</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD4-APC-eFluor780 (RM4-5)</td><td>eBioscience</td><td>47-0042-80</td><td>유동 세포를 염색하는 데 사용되는 항체 cytometry</td></tr><tr><td>anti-CD8&alpha;-BV785 (53-6.7)</td><td>BioLegend</td><td>100749</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD11b-eFluor450 (M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD11c-eFluor450 (N418)</td><td>eBioscience</td><td>48-0114-80</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD44-BV711 (IM7)</td><td>Becton Dickinson</td><td>563971</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD45-FITC (30-F11)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0451-U025</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD45R-eFluor450 (RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>48-0452-80</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-CD62L-PerCP-Cy5.5 (MEL-14)</td><td>BioLegend</td><td>104431</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>anti-Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)-PE (RB6-8C5)</td><td>BioLegend</td><td>108407</td><td>유세포 분석을 위해 세포를 염색하는 데 사용되는 항체</td></tr><tr><td>Ghost Dye-BV510</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870-T100</td><td>유세포 분석을 위한 생존 염료</td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td>세포 분석기(18개 파라미터)</td></tr><tr><td>클로스트리듐의 콜라겐분해효소 D histolyticum</td><td>Roche Applied Science</td><td>11088858001</td><td>분취 액 건조 효소를 HBSS에서 페놀 레드, 칼슘 없음, 마그네슘 없이 1mL 분취액으로 만듭니다. -20°C에서 즉시 보관하십시오. C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>ND4 스위스 암컷 마우스</td><td>Harlan</td><td>0-32</td><td>8-12 주; 전통적으로 음식과 물을 무료로 이용할 수 있도록 수용되었으며 Macalester College의 IACUC 지침에 따라 사용됩니다.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

쥐 피부를 단일 세포 현탁액으로 해리하는 것은 피부 염증의 설치류 모델에서 침투하는 면역 세포의 특성화와 같은 다운스트림 세포 분석에 필수적입니다. 여기에서는 콜라겐분해효소 D를 사용하여 영양이 풍부한 용액에서 마우스 피부를 소화한 다음 불연속 밀도 구배를 사용하여 조혈 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이렇게 얻은 세포는 in vitro 연구, in vivo transfer 및 유세포 분석을 포함한 기타 다운스트림 세포 및 분자 분석에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 표현형 특성화 또는 세포 기능과 관련된 표면 단백질의 밀도 또는 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 고가의 기계적 해리기, 특수 분리 컬럼, 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 분해 방법에 대한 효과적이고 경제적인 대안입니다. 당사의 대표 데이터에서 볼 수 있듯이, 이 프로토콜은 생존 가능성이 높은 세포를 생성하고, 특정 면역 세포 subset을 포함하며, 유세포 분석에 사용되는 공통 표면 마커 단백질의 무결성에 영향을 미치지 않았습니다.

콜라게나 D 미디어 처리 대조군과 비교시 비장 세포는 T 세포상의 CD4 및 CD8 α 비슷한 수준의 치료를 보여 먼저, T 세포의 서브 세트에 리니지 및 활성화 마커의 주파수 및 풍부 표면에 콜라게나 D의 잠재적 효과는 대조군으로 차 림프 조직을 사용하여 평가 하였다. 비장 세포 현탁액 ND4 마우스로부터 얻어진 HBSS 미디어와 함께 1 시간 동안 세척 하였다. (위의 섹션 4에 기술 된 바와 같이) 다음에, 반 세포 / ㎖의 콜라게나 D 0.7 mg의 실시. 잔여 세포를 HBSS 제어 매질에 재현 탁 하였다. 이어서, 비장 세포 모두 분획 섹션 5에서 전술 한 바와 같이 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 처리 하였...

이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다. 이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

이 절차의 전반적인 목표는 효소 분해 및 밀도 구배 분리를 사용하여 피부 침윤 백혈구를 분리하는 것입니다. 이 방법은 아토피 피부염을 포함한 피부 병리학의 많은 마우스 모델에서 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 이 방법은 피부 침투 백혈구 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 상주 세포 집단의 조사에도 적용할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 과도한 지방 및 결합 조직을 완전히 제거하는 것을 포함하는 피부 채취에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 피부 수확 및 밀도 구배 처리는 배우기 어렵고 정밀도와 연습이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 치료 후 적절한 시점에 10cm 수술용 가위를 사용하여 8주에서 12주 된 암컷 ND4 Swiss-Webster 마우스의 25 x 25mm 면도한 옆구리 피부를 조심스럽게 절제합니다.깨끗하고 날카로운 수술용 칼날을 사용하여 피부에서 과도한 지방과 결합 조직을 긁어낸 다음 EDTA, HEPES 및 FBS가 보충된 10ml의 실온 HBSS가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브로 피부를 옮기고 건조하고 가스가 주입되지 않은 상태에서 30분 동안 회전판에서 조직을 사전 소화합니다. 섭씨 37도 인큐베이터. 배양이 끝나면 10초 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이치고 70미크론 스트레이너를 통해 조직 슬러리를 여과합니다. 다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 여과기의 옆구리 피부 조각을 EDTA, HEPES 및 FBS가 보충된 10ml의 신선한 실온 HBSS 배지가 들어 있는 새로운 50ml 튜브로 옮긴 다음 12.5cm 쌍의 외과용 절개 가위를 사용하여 각 옆구리 피부 조각을 다져 평균 조직 조각의 크기가 약 2.2 x 2.2mm가 되도록 합니다.모든 조각이 다지고 나면 튜브를 회전 플레이트에 다시 넣어 30분 동안 더 배양합니다. 배양이 끝날 때 10초 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이치고 70미크론 스트레이너를 통해 내용물을 여과합니다. 콜라겐분해효소 D 10밀리리터와 콜라겐분해효소 D 0.7밀리그램이 보충된 HBSS 10밀리리터가 들어 있는 새로운 50밀리리터 튜브에 남은 옆구리 피부 조각을 모으고, 튜브를 회전판에 다시 넣어 30분 동안 다시 배양합니다.또 다른 10 초 동안 와류를 일으킨 후 튜브의 내용물을 다시 여과하고 이번에는 스트레이너의 파편을 버린 다음 튜브에 최대 50 밀리리터의 HBSS, EDTA, HEPES, FBS를 채우고 세포를 스핀 다운하고 상층액을 디캔팅합니다. PBS의 실온 3ml, 67% 밀도 구배 원심분리 배지를 새로운 15ml 원뿔형 튜브에 추가하고, 페놀 레드가 포함된 HBSS의 실온 44% 밀도 구배 원심분리 배지 5ml에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 피펫을 가장 낮은 속도로 설정하고 피펫을 튜브 측면에 놓고 67% 밀도 구배 원심분리 매체 위에 세포를 부드럽게 겹쳐 놓습니다.밀도 그라디언트로 작업할 때는 거품이 생기지 않도록 주의하고 그래디언트 인터페이스의 중단을 최소화해야 합니다. 그런 다음 5ml 전달 피펫을 사용하여 세포를 분리하여 원심분리 종료 시 계면에서 세포를 수집합니다. gradient를 부드럽게 layering하고 gradient의 계면을 조심스럽게 추출하는 것이 중요한 단계이므로, 관심 있는 실험 세포로 절차를 시도하기 전에 murine splenocyte의 현탁액으로 밀도 구배 원심분리 배지 층화 및 계면 제거를 연습하는 것이 현명합니다.마지막으로, 수집된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 FBS가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 트리판 블루 배제로 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. CD4 및 CD8-alpha 표면 발현은 효소 분해 여부에 관계없이 동일한 수의 CD4 양성 및 CD8-alpha 양성 세포가 검출되기 때문에 Collagenase D 분해의 영향을 받지 않습니다. 또한, 콜라겐분해효소 D 분해는 CD4 양성 T 세포에 대한 T 세포 활성화 마커 CD44 및 CD62L의 표면 밀도에 영향을 미치지 않습니다.구배변화도 분리 후, 옆구리 조직의 제곱밀리미터당 약 250개의 생존 가능한 면역 세포가 옥사졸론(Oxazolone) 또는 옥스 챌린지(Ox-challenged) 마우스에서 분리되는 반면, 이전에 옥스(Ox)에 도전한 마우스에서는 조직 제곱밀리미터당 4개의 생존 가능한 면역 세포만 분리되었는데, 이는 이전에 Ox.95%의 낮은 전방 및 측면 산란 단일 세포로 감작되었고, 차량 챌린지 대조군에서 이러한 세포의 71%는 살아있는 CD45 양성 세포입니다. 이는 매일 세 번의 황소 챌린지 후 옆구리 피부에 침투하는 CD45 양성 면역 세포 집단이 약 67배 증가한 것과 같습니다. 실제로, 옥스 챌린지는 T 세포와 호중구가 옆구리 피부로 뚜렷하게 침투하는 결과를 낳는데, Ox 처리 동물에서 살아있는 CD45 양성 세포의 42%가 Gr-1 양성으로 보이며, 약 84%의 CD3 양성 T 세포가 CD8-알파 또는 CD4를 발현하는 경우, 대조군의 에탄올 처리 동물에 비해 CD8-알파 또는 CD4를 발현합니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 밀도 구배를 신중하게 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 수행할 때 항상 실온 밀도 구배 원심분리 매체를 사용하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 유세포 분석, 세포 분류, 세포 전달 또는 체외 세포 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 피부 침윤 백혈구의 표현형과 기능을 평가할 수 있습니다.이 동영상을 시청한 후에는 효소 분해 및 밀도 구배 원심분리를 사용하여 피부 침투 백혈구를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

murine 두뇌에서 침투 leukocytes을 얻는 빠른 방법을 설명합니다. 이 방법은 연속 Percoll 기울기와 백혈구 - 농축 레이어를 선택하고 정화 불연속 Ficoll 기울기를 사용합니다. 절연 leukocytes 그때 흐름 cytometric 측정에 의해 특징 수 있습니다.

브레인 - 침투 Leukocytes의 분리

마우스 성기 기관에서 림프구를 분리 할 수​​있는 효과적인 방법이 설명되어 있습니다. 이 방법은 효율적으로 분리 할 수​​ 있도록 효소 분해와 Percoll 기울기 분리에 활용합니다. 이 기술은 다른 종에 사용하기 위해도에 적용 할 수...

마우스 성기 요로 점막에서 림프구의 분리

이 비디오에서는 콜라겐 분해 효소 E 및 실리카 기반 밀도 분리 매체 구배 분리를 사용한 효소 분해를 통해 쥐 결장 조직에서 lamina propria 단핵 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 단핵 셀은 후속 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

Lamina Propria 단핵 세포 분리: 쥐 결장에서 단핵 세포를 얻기 위한 실리카 기반 밀도 구배 원심분리 기술

우리는 인간 피부 생검에서 피부 상주 T 세포를 효율적으로 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 및 생체 외 배양을 위한 충분한 수의 생존 가능한 인간 피부 상주 림프구를 생성합니다.

표현형 분석 및 대한 인간의 피부에서 림프구 분리<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 세포 배양

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

여기 창 자 연관 된 림프 조직 Peyer의 패치 및 배수 mesenteric 림프절을 포함 하 여 유도 사이트와 lamina propria 포함 이펙터 사이트에서 세포의 고립에 대 한 자세한 프로토콜 설명 및 작은 장 면역 시스템의 장 상피입니다.

마우스 작은 장의 면역 시스템에서 세포를 분리

이 프로토콜은 마우스 모델에서 피부 각질을 분리하고, 금속 태그가 달린 항체로 염색하고, 다른 세포 주기 단계에서 관심 있는 단백질의 발현 패턴을 프로파일화하기 위해 질량 세포 측정에 의해 염색된 세포를 분석하는 방법을 설명합니다.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

이 프로토콜의 목표는 콜라게나제를 사용하여 조직의 효소 소화에 의해 결장의 라미나 프로피리아에 있는 단핵 세포를 분리하는 것입니다. 이 프로토콜은 단일 핵 세포의 효율적인 분리를 허용하여 단일 세포 현탁액을 생성하여 강력한 면역 세포 증식에 사용할 수 있습니다.

콜라게나아제 E를 사용하여 뮤린 결장에서 라미나 프로프리아 단핵 세포의 분리

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

학습하세요 마우스 피부에서 효소 다이제스트와 그라데이션 분리를 이용한 침투 백혈구 분리 방법을. 아토피 피부염 등 피부 질환의 세포 및 분자 메커니즘 연구에 활용할 수 있습니다.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

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