효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 효소 분해 및 밀도 구배 분리를 사용하여 피부 침윤 백혈구를 분리하는 것입니다. 이 방법은 아토피 피부염을 포함한 피부 병리학의 많은 마우스 모델에서 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 이 방법은 피부 침투 백혈구 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 다른 상주 세포 집단의 조사에도 적용할 수 있습니다.

일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 과도한 지방 및 결합 조직을 완전히 제거하는 것을 포함하는 피부 채취에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 피부 수확 및 밀도 구배 처리는 배우기 어렵고 정밀도와 연습이 필요하기 때문에 매우 중요합니다. 치료 후 적절한 시점에 10cm 수술용 가위를 사용하여 8주에서 12주 된 암컷 ND4 Swiss-Webster 마우스의 25 x 25mm 면도한 옆구리 피부를 조심스럽게 절제합니다.

깨끗하고 날카로운 수술용 칼날을 사용하여 피부에서 과도한 지방과 결합 조직을 긁어낸 다음 EDTA, HEPES 및 FBS가 보충된 10ml의 실온 HBSS가 들어 있는 50ml 원뿔형 튜브로 피부를 옮기고 건조하고 가스가 주입되지 않은 상태에서 30분 동안 회전판에서 조직을 사전 소화합니다. 섭씨 37도 인큐베이터. 배양이 끝나면 10초 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이치고 70미크론 스트레이너를 통해 조직 슬러리를 여과합니다. 다음으로, 한 쌍의 집게를 사용하여 여과기의 옆구리 피부 조각을 EDTA, HEPES 및 FBS가 보충된 10ml의 신선한 실온 HBSS 배지가 들어 있는 새로운 50ml 튜브로 옮긴 다음 12.5cm 쌍의 외과용 절개 가위를 사용하여 각 옆구리 피부 조각을 다져 평균 조직 조각의 크기가 약 2.2 x 2.2mm가 되도록 합니다.

모든 조각이 다지고 나면 튜브를 회전 플레이트에 다시 넣어 30분 동안 더 배양합니다. 배양이 끝날 때 10초 동안 튜브를 격렬하게 소용돌이치고 70미크론 스트레이너를 통해 내용물을 여과합니다. 콜라겐분해효소 D 10밀리리터와 콜라겐분해효소 D 0.7밀리그램이 보충된 HBSS 10밀리리터가 들어 있는 새로운 50밀리리터 튜브에 남은 옆구리 피부 조각을 모으고, 튜브를 회전판에 다시 넣어 30분 동안 다시 배양합니다.

또 다른 10 초 동안 와류를 일으킨 후 튜브의 내용물을 다시 여과하고 이번에는 스트레이너의 파편을 버린 다음 튜브에 최대 50 밀리리터의 HBSS, EDTA, HEPES, FBS를 채우고 세포를 스핀 다운하고 상층액을 디캔팅합니다. PBS의 실온 3ml, 67% 밀도 구배 원심분리 배지를 새로운 15ml 원뿔형 튜브에 추가하고, 페놀 레드가 포함된 HBSS의 실온 44% 밀도 구배 원심분리 배지 5ml에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 피펫을 가장 낮은 속도로 설정하고 피펫을 튜브 측면에 놓고 67% 밀도 구배 원심분리 매체 위에 세포를 부드럽게 겹쳐 놓습니다.

밀도 그라디언트로 작업할 때는 거품이 생기지 않도록 주의하고 그래디언트 인터페이스의 중단을 최소화해야 합니다. 그런 다음 5ml 전달 피펫을 사용하여 세포를 분리하여 원심분리 종료 시 계면에서 세포를 수집합니다. gradient를 부드럽게 layering하고 gradient의 계면을 조심스럽게 추출하는 것이 중요한 단계이므로, 관심 있는 실험 세포로 절차를 시도하기 전에 murine splenocyte의 현탁액으로 밀도 구배 원심분리 배지 층화 및 계면 제거를 연습하는 것이 현명합니다.

마지막으로, 수집된 세포를 15ml 원뿔형 튜브에 FBS가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS로 세척하고 트리판 블루 배제로 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다. CD4 및 CD8-alpha 표면 발현은 효소 분해 여부에 관계없이 동일한 수의 CD4 양성 및 CD8-alpha 양성 세포가 검출되기 때문에 Collagenase D 분해의 영향을 받지 않습니다. 또한, 콜라겐분해효소 D 분해는 CD4 양성 T 세포에 대한 T 세포 활성화 마커 CD44 및 CD62L의 표면 밀도에 영향을 미치지 않습니다.

구배변화도 분리 후, 옆구리 조직의 제곱밀리미터당 약 250개의 생존 가능한 면역 세포가 옥사졸론(Oxazolone) 또는 옥스 챌린지(Ox-challenged) 마우스에서 분리되는 반면, 이전에 옥스(Ox)에 도전한 마우스에서는 조직 제곱밀리미터당 4개의 생존 가능한 면역 세포만 분리되었는데, 이는 이전에 Ox.95%의 낮은 전방 및 측면 산란 단일 세포로 감작되었고, 차량 챌린지 대조군에서 이러한 세포의 71%는 살아있는 CD45 양성 세포입니다. 이는 매일 세 번의 황소 챌린지 후 옆구리 피부에 침투하는 CD45 양성 면역 세포 집단이 약 67배 증가한 것과 같습니다. 실제로, 옥스 챌린지는 T 세포와 호중구가 옆구리 피부로 뚜렷하게 침투하는 결과를 낳는데, Ox 처리 동물에서 살아있는 CD45 양성 세포의 42%가 Gr-1 양성으로 보이며, 약 84%의 CD3 양성 T 세포가 CD8-알파 또는 CD4를 발현하는 경우, 대조군의 에탄올 처리 동물에 비해 CD8-알파 또는 CD4를 발현합니다. 이 기술을 마스터하면 제대로 수행하면 약 3시간 안에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 시도하는 동안 밀도 구배를 신중하게 처리해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차를 수행할 때 항상 실온 밀도 구배 원심분리 매체를 사용하는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 따라 유세포 분석, 세포 분류, 세포 전달 또는 체외 세포 배양과 같은 다른 방법을 수행하여 피부 침윤 백혈구의 표현형과 기능을 평가할 수 있습니다.

이 동영상을 시청한 후에는 효소 분해 및 밀도 구배 원심분리를 사용하여 피부 침투 백혈구를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.