개선 2D 및 3D 스킨 체외 모델

이 절차의 전반적인 목표는 고분자 밀집(macromolecular crowding)을 사용하여 세포 외 기질 침착을 향상시키고 현재 2D 및 3D 피부 모델을 개선하는 것입니다. Crowding은 세포 유래 매트릭스의 생성을 개선하고 압축된 시간 프레임에서 유기형 배양을 성숙시킵니다. 이 방법은 피부 및 기타 조직의 생체 공학을 위해 세포 유래 세포 외 매트릭스를 생성하는 향상된 방법을 제공하기 때문에 조직 공학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다.

이 기술의 주요 장점은 세포 유래 매트릭스 및 유기형 피부 구조체가 이러한 배양에 고분자 밀집을 적용할 때 상당히 압축된 시간 프레임에서 생성될 수 있다는 것입니다. 간섭 반사 현미경 기술을 사용하면 항체 염색 없이 전체 세포외 기질 증착을 시각화할 수 있습니다. 이러한 기술의 적용은 피부 세포에 의한 세포외 기질 침착 연구에서 개선된 상처 치료에 이르기까지 확장될 것이며, 특히 더 나은 피부 등가물 생성 및 이식을 위한 조직 배양에 이르기까지 확장될 것입니다.

시작하려면 50, 000개의 1차 섬유아세포, 1차 각질세포 또는 이 둘의 공동 배양을 1ml의 미디엄 프로 웰에 24웰 플레이트의 웰에 파종합니다. 세포가 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 밤새 부착되도록 합니다. 그런 다음 기존 배지를 버리고 고분자 크라우더와 100마이크로몰 아스코르브산을 포함하는 1ml의 새 배지로 교체하십시오.

6일 동안 배양물을 배양하고 2일마다 배지를 교체합니다. text protocol에 따라 immunofluorescence 및 western blotting을 수행합니다. 세포 유래 매트릭스를 만들고 사용하기 위해서는 방금 설명한 바와 같이 분자 크라우더와 아스코르브산으로 6일 동안 세포를 배양한 후 세포층을 탈세포화하여 먼저 1X PBS를 사용하여 세포층을 두 번 세척함으로써 세포 유래 매트릭스를 얻습니다.

PBS를 흡입한 다음 250마이크로리터의 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트를 넣고 얼음에서 10분 동안 배양합니다. 세포 용해물을 흡인한 다음 250마이크로리터의 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트를 추가하고 10분 배양 및 흡인을 두 번 더 반복합니다. 증류수를 사용하여 세포 유래 매트릭스를 두 번 세척합니다.

물을 흡입한 다음 1X PBS를 추가합니다. 매트릭스를 최대 1주일 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오. 2차 세포 현탁액을 준비하려면 매트릭스에서 PBS를 흡인하고 예를 들어 F 매트 위에 50, 000개의 각질 세포를 파종합니다.

세포가 밤새 부착되도록 합니다. 세포 유래 매트릭스에서 간섭 반사 현미경(RIM)을 수행하려면 텍스트 프로토콜에 따라 컨포칼 현미경을 사용하여 이미지 획득을 수행합니다. 세포 배양 삽입물에 캡슐화된 섬유아세포가 있는 콜라겐 겔을 주조하려면 10ml의 쥐꼬리 콜라겐 유형 1을 차가운 비커에 분취합니다.

1ml의 차가운 DMEM과 0.5ml의 수산화나트륨 1mol을 첨가하여 산성 콜라겐을 중화합니다. 그런 다음 0.5ml의 섬유아세포 현탁액을 추가합니다. 차가운 피펫을 사용하여 12ml의 용액을 6웰 배양 플레이트의 세포 배양 삽입물로 고르게 나눕니다.

겔을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 1시간 동안 배양합니다. 젤이 응고되면 섬유아세포 매체 또는 FM에 담그십시오. 그런 다음 24시간 동안 배양한 후 FM을 흡인합니다. 세포 배양 인서트 내부에 2밀리리터를 추가하고 세포 배양 인서트 외부에 2밀리리터를 추가하여 기존 FM을 대체하려면 고분자 크라우더가 포함된 4밀리리터의 새로운 배지를 사용합니다. 24시간 배양 후 0.125%트립신 부정 행위제를 사용하여 각질 세포를 트라이슨화합니다.

플라스크의 측면을 부드럽게 두드려 세포를 제거하고 혈청 함유 배지를 추가하여 트립신을 중화합니다. 세포를 계수한 후 각질세포 현탁액을 준비합니다. 다음으로, 세포 배양 삽입물에서 배지를 흡인하고 각질 세포를 겔 상단에 추가합니다.

젤을 1시간 동안 배양합니다. 각질세포가 겔 표면에 부착된 후 2밀리리터의 KSFM 또는 CTN-57 무혈청 배지를 사용하여 겔 배양 인서트 내부에 세포를 담그고 세포 배양 인서트 외부에 2밀리리터의 FM을 추가합니다. 24시간 배양 후 기존 배지를 버리고 고분자 크라우더를 포함하는 새 배지로 교체하십시오.

침수 배양에서 7일 후 배양을 공기-액체 계면으로 올리려면 배양 인서트를 깊은 웰 플레이트로 옮깁니다. 세포 배양 삽입물 외부에 10ml의 층화 배지를 추가하여 삽입물 내부를 건조하게 유지합니다. 마지막으로, 배양물을 배양하고 14일 동안 3일마다 배지를 교체합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 수확하고 처리합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 고분자 밀집은 섬유아세포가 대조군 배양에 비해 더 많은 세포외 기질 또는 ECM을 침착할 수 있도록 했습니다. 세속화가 진행되자, 섬유아세포(fibroblasts)가 콜라겐 1, 콜라겐 4, 피브로넥틴의 주요 기착자임이 분명해졌다.

이 수치는 콜라겐 7의 주요 증착자인 각질세포가 아닌 섬유아세포였음을 보여주며, 이는 성공적인 콜라겐 7 체외 증착에 대한 첫 번째 보고입니다. RIM을 사용하여 세포 유래 매트릭스의 전체 범위를 캡처했습니다. 항체 염색이 적용된 RIM 이미지의 오버레이는 ECM의 총량과 관련하여 해당 ECM 성분의 상대적인 양을 보여줍니다.

3D 체외 피부 모델에서 고분자 밀집 또는 MMC는 성숙한 유기형 피부 공동 배양을 얻기 위해 배양 시간을 5주에서 3주로 단축했습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, H 및 E 염색에 의해, 3주에 MMC를 사용한 배양은 흉막층화된 표피와 스트로몰 융기 진피로 구성되었습니다. 또한, 대조군 배양에서 약하고 얼룩진 콜라겐 7 면역염색과 비교하여 밀집된 세포 배양의 진피피더 접합부에서 강렬하고 지속적인 콜라겐 7 면역염색이 감지되었습니다.

투과 전자 현미경은 또한 MMC로 생성된 유기형 배양에서 고정 원섬유의 존재를 보여주며 기능적 콜라겐 7을 보여줍니다. 세포 유래 매트릭스는 세포외 기질의 복잡성이 유지되고 세포 자체에 의해 생성됨에 따라 대체 골격으로 2차 세포 파종 목적으로 사용될 수 있습니다. 거대분자 밀집 하에서 생성되는 유기형 피부 배양은 기질 융기 진피, 주요 피부 표피 연접부 및 흉막 층상 표피를 포함하기 때문에 개선된 3D 피부 모델로 사용할 수 있습니다.

고분자 크라우더로 생성된 유기성 또는 피부 등가 배양은 이식 성공률을 향상시킬 가능성이 있는 더 잘 발달된 피부피더말 접합부를 가지고 있기 때문에 피부 이식에 사용할 수도 있습니다. 향상된 세포외 기질 증착 외에도 고분자 밀집은 시약의 양을 늘리지 않고도 속도가 제한된 반응을 향상시키기 위해 다른 체외 시스템에 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응이 있습니다.