January 6th, 2016
이 프로토콜은 세포 신호 전달 연구와 바이오 마커 검출 잠재적 인 응용 프로그램과 대규모의 제조, 다중화 된 두 차원의 DNA 또는 항체 배열을 설명합니다.
이 방법론의 전반적인 목표는 단일 세포 분석에 적용할 수 있는 항체 어레이를 제작하는 것입니다. 이 방법은 동일한 단일 세포에서 비밀 단백질과 세포 내 단백질을 동시에 검출하는 방법과 같은 단일 세포 분석 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그리고 이러한 목표를 달성하기 위해 마이크로 어레이 플랫폼을 어떻게 제작할 수 있습니까?
이 기술의 주요 장점은 사용자 정의가 가능하다는 것입니다. 흐름 패터닝 전략을 다양화함으로써 다양한 차원의 배열을 생성할 수 있습니다. 사전에 바코드 흐름 패턴에 대한 SU-8 마스터를 생성합니다.
지침은 텍스트 프로토콜에 제공됩니다. 여기에는 크롬 포토 마스크를 디자인하고 만드는 작업이 포함됩니다. 포토레지스트 코트에 마스크를 놓고 UV를 적용하면 패턴이 제공됩니다.
PDMS 바코드 몰드 준비를 시작하려면 실리콘 엘라스토머 베이스 40g과 경화제 4g을 결합한 다음 10분 동안 격렬하게 저어줍니다. 그런 다음 진공 상태에서 20분 동안 프리폴리머 용액의 가스를 제거합니다. 다음으로, 바코드 패턴의 SU-8 마스터가 있는 실리콘 웨이퍼가 들어 있는 페트리 접시에 용액을 로드합니다.
용액을 7.45mm 깊이까지 붓습니다. 그런 다음 접시에 있는 혼합물의 가스를 제거하여 남아 있는 거품을 제거합니다. PDMS를 경화시키기 위해 섭씨 75도에서 한 시간 동안 혼합물을 굽는 방식으로 가스 제거를 수행합니다.
그런 다음 메스로 자르고 바코드 금형을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 웨이퍼에서 슬래브를 조심스럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 슬래브의 가장자리를 잘라 원하는 금형 모양을 만듭니다.
플런저가 있는 생검 펀치를 사용하여 입구와 출구를 나타내는 패턴의 원형 특징에 반 밀리미터 구멍을 뚫어 금형을 마무리합니다. 질소 블로우건으로 폴리-L-라이신 코팅 유리 슬라이드에서 먼지를 불어낸 후 PDMS 몰드를 슬라이드에 부착합니다. 금형의 가장자리를 슬라이드에 조심스럽게 정렬합니다.
이제 어셈블리를 섭씨 90도에서 75분 동안 베이킹하여 PDMS와 슬라이드 사이의 결합을 강화합니다. 한편, 입구와 출구를 위한 유연한 폴리에틸렌 튜브 20개를 준비합니다. 각 튜브 조각에 직경이 1mm인 스테인리스 스틸 중공 핀을 부착합니다.
그런 다음 핀을 통해 길이를 센티미터 이상의 폴리-L-라이신으로 채웁니다. 유리에 접착되면 핀을 금형의 입구에 조심스럽게 고정합니다. 이것은 준비 중 가장 어려운 단계입니다.
프로세스를 서두르지 마십시오. 튜브의 다른 쪽 끝을 20개의 3방향 밸브 네트워크로 구성되고 한 번에 두 개의 금형을 처리할 수 있는 압력 조절식 질소 탱크 설정에 연결합니다. 설정을 사용하여 최소 6시간 동안 0.5-1PSI로 금형을 통해 용액을 불어냅니다.
BS-3에서 갓 준비된 단일 가닥 DNA 용액을 스테인리스 스틸 핀을 통해 폴리에틸렌 튜브로 흡인하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 PDMS 금형을 질소 공급원에 연결하고 약 40분 동안 또는 모든 채널이 채워질 때까지 바코드 금형을 통해 용액을 흐릅니다. 그런 다음 흐름을 멈추고 곰팡이를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
몇 시간 후 바코드 몰드를 섭씨 75도에서 한 시간 동안 굽습니다. 구워지면 슬라이드에서 금형을 분리하고 01% SDS로 슬라이드를 부드럽게 세척합니다. 그런 다음 초순수로 슬라이드를 세 번 씻습니다.
슬라이드 스피너를 사용하여 바코드 슬라이드를 건조시켜 세척을 따르십시오. 건조되면 바코드 슬라이드를 깨끗한 50ml 튜브에 보관하십시오. 계속하려면 텍스트 프로토콜에 따라 1차원 패턴을 검증합니다.
검증 절차를 수행하려면 슬라이드를 차단하고 시아닌 3 상보적 DNA를 하이브리드화하고 결과를 측정합니다. 3 x 3 어레이에 대한 SU-8 마스터는 첫 번째 설계와 수직인 흐름 패턴을 가지고 있습니다. 앞에서 설명한 방법을 사용하여 이 패턴의 새 PDMS 금형을 만듭니다.
먼저, 9가지 올리고뉴클레오티드의 새로운 작업 농도를 만드십시오. 이제 3% BSA 차단 용액을 0.5에서 1PSI로 한 시간 동안 어레이 슬라이드의 20개 채널 모두에 흐릅니다. 그런 다음 DNA 용액을 해당 채널에 로드합니다.
약 40분 동안 흐린 후 DNA가 혼성화될 수 있도록 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 다음으로, 3% BSA 차단 용액을 20개 채널 모두에 한 시간 동안 흘려보냅니다. 이것은 교잡되지 않은 DNA를 제거합니다.
이제, PDMS에서 어레이 슬라이드를 벗겨내고 슬라이드를 3% BSA에 한 번 담그십시오. 그런 다음 슬라이드를 PBS에 두 번 담근 다음 2% PBS에 한 번 담그십시오. 그런 다음 이전과 마찬가지로 현미경 슬라이드 스피너를 사용하여 슬라이드를 건조시킵니다.
계속하려면 1차원 슬라이드의 유효성을 검사하는 것과 유사한 유효성 검사 단계를 수행합니다. 올리고뉴클레오티드를 1-prime에서 9-prime까지 모두 cyanine three에 접합하여 사용합니다. 나중에 사용할 수 있도록 3x3 어레이 슬라이드를 50ml 원심분리기 튜브에 보관하십시오.
텍스트 프로토콜은 DNA 어레이를 항체 어레이로 변환하는 방법을 추가로 설명합니다. 항체-올리고 접합체를 준비하고 정제한 후 마이크로 챔버가 있는 다른 PDMS 금형을 준비합니다. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오.
이 금형을 어레이 슬라이드와 짝지웁니다. 이제 1% BSA로 슬라이드를 막고 실온에서 한 시간 동안 배양합니다. 배양 중에 200 마이크로 리터의 항체 올리고뉴클레오티드 접합체를 준비합니다.
차단 후 항체-올리고 칵테일을 설정에 추가합니다. 항체를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 어레이에서 배양한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 슬라이드 딥을 진행하기 전에 슬라이드를 세척하고 건조합니다. 설명된 프로토콜을 따른 후 3x3 어레이를 사용하여 생성된 항체 패널은 주로 샌드위치 ELISA 플랫폼을 통해 다중 플렉스 검출에 사용되었습니다.
단백질은 유리 슬라이드의 한쪽 끝에서 다른 쪽 끝까지 10% 미만의 변화를 보였습니다. 3 x 3 어레이에서는 최대 7개의 단백질을 cyanine three로 표지된 reference 및 negative control과 함께 검출할 수 있습니다. 종양 연구를 위해 수행된 단일 세포 실험에서 6개의 단백질이 모두 동시에 검출되었습니다.
보정을 위해 재조합 단백질을 다양한 농도로 어레이에 적용했습니다. 검출 감도는 기존 샌드위치 ELISA와 매우 유사했습니다. 이 절차를 시도하는 동안 PDMS 금형에 미립자 물질이 없는 상태를 유지하는 것이 중요합니다.
채널의 먼지로 인해 균일성이 떨어지고 감도가 낮은 어레이가 생성될 수 있습니다. 개발 후 이 기술은 암 연구 분야의 연구자들이 종양 미세환경 모델을 사용하여 세포-세포 신호 전달을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
이 프로토콜은 단일 세포 분석에 적용되는 사용자 정의 가능한 항체 어레이의 제작을 설명합니다. 같은 단일 세포에서 분비 및 세포 내 단백질을 동시에 검출하는 것을 목표로 합니다.
High-density barcode antibody microarrays fabricated via flow-patterning enable multiplexed protein detection at single-cell resolution, addressing critical needs in early discovery and translational research. This platform supports simultaneous analysis of secreted and intracellular proteins, enhancing mechanistic de-risking and predictive confidence for target validation. The customizable, miniaturized format facilitates integration into diverse R&D workflows, supporting portfolio-wide biomarker and signaling studies.
This barcode microarray technology integrates from early discovery through lead identification and translational research, supporting multiplexed protein analysis in single-cell and tissue models.