Name: 포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 배우세요 BrdU-ChIP-Slot-Western 기법을 사용하여 포유 동물 세포에서 신생 DNA에 결합한 단백질과 히스톤 변형을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 DNA 복제 및 손상 복구 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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이 원고의 작업은 방사선 종양학 교실과 사냥꾼 암 연구소 (SB)에 보건 부여의 국립 연구소 (R01-CA188520)에서 기금에 의해 지원되었다. 나는 프로토콜을 입증하고 그 혜택을 설명하기위한 나의 실험실에서 다니엘 존슨과 스티븐 베넷 감사합니다. 나는 원고에 중요한 의견 박사 마헤 Chandrasekharan (헌 츠맨 암 연구소)에 감사드립니다.

BrdU의 레이블 다음 1. 염색질 면역 (칩) <ol><li> DMSO 또는 HDAC1,2 선택적 억제제 중 하나의 존재 하에서 배양 NIH3T3 세포는 이전에 기술 된 바와 같이 6. </li><li> DMSO 또는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료에 따라, 멸균 조직 문화 후드에있는 세포에 BrdU의를 추가합니다. 멸균 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 60 분 동안 브로 모데 옥시 우리 딘의 20 μm의 최종 농도 (BrdU의) 10 ml의 NIH3T3 미디어에 도금 2 × 10 6 NIH3T3 세포를 품어. </li><li> 1 %의 최종 농도로 배양 배지에 직접 포름 알데히드를 첨가하여 DNA에 가교 결합은 세포 내 단백질. 진탕 기에서 10 분간 실온에서 포름 알데히드와 2 × 106 NIH3T3 세포를 배양한다. </li><li> 125 mM의 최종 농도로, 글리신의 첨가에 의해 가교 급랭. 쉐이커에 5 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 용지를 제거하고 15 ml의 원심 분리기 튜브에 PBS에 세포를 수집합니다. 스핀 CEL4 ℃에서 5 분 동안 956 XG에 LS. 얼음처럼 차가운 PBS로 두 번 세포 펠렛을 씻으십시오. 튜브에서 PBS를 제거합니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 PBS (뜨는)없이 가교 세포 펠렛을 저장합니다. </li><li> 500 μL의 FA140 버퍼를 첨가하여 가교 결합 된 세포 펠렛으로부터 분해물을 제조 (50 HEPES KOH mM의 pH가 7.5의 NaCl 140 mM의, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100, 0.1 %의 나트륨 데 옥시 콜레이트) 프로테아제 억제제 칵테일로 보충. </li><li> 샘플 35 %의 전력에서와 15 초 펄스로 5 회에 0.9 초, 0.1 초 Off 설정을 초음파 처리하여 염색질 전단. 샘플의 가열을 방지하기 위해 초음파의 매 라운드 후 얼음에 튜브를 유지합니다. <ol><li> 다른 sonicators 사이에 달라집니다 전단 효율성 DNA 젤에 전단을 확인합니다. 초음파를 확인하려면, 0.16 M의 농도로 염화나트륨을 첨가하여 가교 역 및 단계 1.17.1를 수행합니다. - 1.22. 실행 전단인지 확인하는 1.5 % 아가 로즈 겔상에서 DNA를 10 ㎕의 용출500 BP의 평균 강도 BP 300-700 사이. </li></ol></li><li> 4 ° C에서 17,949 XG에 10 분 동안 초음파, 원심 분리기 샘플에 따라 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. <ol><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 단백질 분석 키트를 사용하여 단백질의 추정을 수행. 제어 및 실험 샘플 칩 해물의 동일한 양을 사용합니다. 일반적으로, 칩 반응 당 총 해물의 1 밀리그램을 사용합니다. </li></ol></li><li> 프로테아제 저해제 칵테일을 포함 FA140 버퍼를 사용하여 단백질 A 아가 로스의 50 % 슬러리를 제조. 프로테아제 억제제 칵테일의 1/10 볼륨을 추가합니다. 총 샘플들의 수에 기초하여 필요한 비드의 체적을 계산한다. <ol><li> FA140 버퍼 씻을 단백질 - 아가로 오스 비즈 두 번 저장 버퍼를 제거하고 50 %의 슬러리를 만들기 위해 구슬로 FA140 버퍼에 동일한 볼륨을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 비 특이 비드에 결합 된 단백질을 제거 단백질 - 아가 및 50 %의 슬러리를 50 μL를 추가하려면30 분 동안 로티 세리 혼합기에서 일정한 엔드 오버 엔드로 회전을 4 ° C에서 샘플들을 cubate. </li></ol></li><li> 분 동안 4 ° C에서 956 XG에서 샘플을 스핀. 상층 액을 수집하고 8 μL H4K16ac 항체 또는 상층 액을 1 ㎎ / ㎖ SMARCA5 항체의 5 μL (5 μg의)를 추가하여 면역을 수행합니다. 불고기 믹서에 일정 엔드 오버 엔드 회전 4 ° CO / N에 품어. </li><li> &#39;입력&#39;컨트롤에 대한 추출물의 1 / 10을 저장하고 옆으로 -20 ° C에서 설정합니다. 입력은 IP 샘플과 함께 가교 역방향 할 필요가있다. </li><li> 음성 대조군 면역 샘플로 토끼의 IgG의 동일한 양 (1 ㎎ / ㎖의 5 μL)를 사용합니다. </li><li> 다음날, 추출물 50 % 단백질 - 아가 로스 슬러리의 50 μL를 추가 한 4 회전 ° C에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 4 ℃에서 2 분 동안 956 XG에서 원심 분리하여 아가 로스 비드 펠렛, 조심스럽게 상층 액과 워싱턴을 제거순차적으로 다음 버퍼로 구슬을 쉬. 버퍼 준비에서 바로 사용하기 전에 프로테아제 억제제를 추가합니다. <ol><li> 낮은 소금 면역 복합체 세척 버퍼로 세척 (FA140, pH가 7.5 HEPES KOH의 50 mm의 최종 농도의 NaCl 140 밀리미터, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의)에 대한 엔드 오버 엔드 회전 4 ℃에서 5 분. </li><li> 높은 소금 면역 복합체 세척 버퍼로 세척 (FA500, pH가 7.5 HEPES KOH의 50 mm의 최종 농도의 NaCl 500 밀리미터, 1 mM의 EDTA (PH 8.0), 1 % 트리톤 X-100 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의)에 대한 엔드 오버 엔드 회전 4 ℃에서 5 분. </li><li> LiCl을 면역 복합체 세척 버퍼 엔드 오버 엔드 회전 4 ° C에서 5 분 (트리스 (CL)의 pH 8.0, LiCl이 250 밀리미터, 0.5 % NP40 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트의 10 mm의 최종 농도)로 세척. </li></ol></li><li> 전술 한 바와 같이 세척을 따르면, 200 ㎕의 용출 용액 incubat (1 % SDS, 100 mM의 중탄산 나트륨을 최종 농도)을 추가RT에서 엔드 오버 엔드 회전에 실온에서 15 분 동안 전자. </li><li> 실온에서 956 XG에서 샘플을 스핀과 새로운 1.5 ML 튜브에 용출액을 전송합니다. 추가 200 μL 용출 용액과 단계를 반복 1.15. </li><li> 용출액을 400 μL, 0.16 M의 염화나트륨 농도를 넣고 잘 섞는다. <ol><li> 또한, 별도로 설정 입력 된 10 μL (단계 1.11)에 400 μL의 용출 용액을 추가 할뿐만 아니라 가교 입력 샘플들을 역의 0.16 M 농도의 NaCl을 추가한다. 5 시간 동안 65 ° C의 수조에서 배양함으로써 샘플을 가교 역방향. </li></ol></li><li> 역 가교 용출액에 100 %의 EtOH 1 ML을 추가합니다. 잘 믹스 2 -80 ° C에서 부화 - 3 시간 또는 -20 ° CO / N에서. 15 분 동안 17,949 XG에서 샘플을 스핀과 에탄올을 버린다. </li><li> 펠렛을 씻어 800 μL 70 % 에탄올을 추가합니다. 4 ° C에서 15 분 동안 17,949 XG에 스핀과 에탄올을 버린다. 잔여 에탄올을 제거하기 위해 간단히 스핀. 1, 37 ° C에서 샘플을 공기 - 건조0 분 잔류 에탄올을 제거합니다. </li><li> 90 μL RNA 분해 효소의 DNA와 DNase를 무료로 물을 용해 및 0.2 ㎎ / ㎖ 최종 농도 2 μL 10 ㎎ / ㎖의 RNase를 추가합니다. 30 분 동안 물을 욕조에 37 ° C에서 품어. </li><li> 10 ㎕의 10 배 테 K 버퍼 (100 mM 트리스 - CL 산도 8.0, 50 mM의 EDTA의 pH 8.0, 5 % SDS)를 추가합니다. 잘 혼합하고 1 시간 동안 42 ℃에서 1 μL 테 K. 품어을 추가합니다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따라 상업적 PCR 정제 키트를 사용하여 입력 칩 DNA를 정제하여, 50 μL의 물을 용출 DNA. 더 사용할 때까지 -20 ℃에서 저장 DNA. </li></ol> 2. 슬롯 칩 DNA의 얼룩 분석 <ol><li> 280 nm의 분광 광도계를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단계 1.22에 기재된 바와 같이 50 μL의 물에 용출 입력 DNA 칩의 수율을 측정한다. </li><li> 검출의 선형 범위 내에있는 입력의 동일한 볼륨 (50 μL) 또는 면역 DNA를 가져 가라. <ol><li> 예를 들어, 입력DNA의 수율은 1.5 NG / μL가, 다음 (총 DNA 겨 45) 30 μl를 타고 물 50 μL에 볼륨을 만들 수 있습니다. 인자 칩, 2.1 단계에서 전체 50 μL의 용출액을 2.3 단계로 진행합니다. </li></ol></li><li> 0.4 N NaOH를 짧게 소용돌이 10 초 동안 956 XG에 대한 원심의 2.5 볼륨을 추가하여 50 μL 입력 또는 면역 DNA를 변성하고, 실온에서 30 분 동안 품어. </li><li> 10 초 동안 956 XG 1 M 트리스 - 염산 175 μL, 산도 6.8, 소용돌이, 원심 분리기를 추가하여 변성 된 DNA를 중화하고 얼음에 샘플을 배치합니다. </li><li> 후술하는 바와 같이 슬롯 블롯 분석을 위해 입력 용액을 희석하고 면역 DNA를 준비한다. <ol><li> 단계 2.3에 따라 - 350 μL의 총 샘플 볼륨을 얻기 위해 2.4 (즉, 50 μL 입력 / 칩 DNA, 125 μL를 0.4 N NaOH를 175 ㎕의 1 M 트리스 - 염산, pH를 6.8). 참고 : 인스턴스가 위에서 언급 한 내용은, 입력 DNA의 45 NG가 0.129 NG / μL 끝나게됩니다. </li><li> 입력 DNA를 들어, 세 개의 튜브에 라벨을S 100, 50, 25, 100 μL, 50 μL 및 변성 및 중화 DNA 샘플의 25 μl를 추가로. 뉴 클레아없는 물 100 μL에 최종 볼륨을 확인합니다. 칩 DNA, 라벨 200, 100, 50, 200 μl를 추가로 세 개의 튜브, 100 μL 및 변성 및 중화 DNA 샘플의 50 μL. 뉴 클레아 무료 물 200 μL에 최종 볼륨을 확인합니다. </li></ol></li><li> 슬롯 얼룩 장치의 크기로 막 잘라. 전에 20 배 SSC의 막과 블로 팅 서류를 사전 적시고 DNA를 추가하기 전에. 제조 업체의 프로토콜에 따라 슬롯 얼룩 장치로 조립. </li><li> 해당 슬롯에 단계 2.5.2에서 피펫의 DNA. 제타 프로브 막 상에 DNA를 당겨 천천히 진공을 적용합니다. 모든 샘플이 장치를 통과 한 후 진공을 중지합니다. <ol><li> 장치를 분해하고 즉시 UV 가교제를 사용하여 막 위에 DNA를 고정시킨다. 자외선 가교제의 DNA의 측면을 가지고 노소를 사용가교제에 설정 tocrosslink. 제조 업체의 프로토콜을 따르십시오. </li></ol></li><li> 웨스턴 블 롯팅을 수행하여 슬롯 블롯에 BrdU의 검출. <ol><li> PBS에서 무 지방 분유 5 % 막에 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 1 시간 동안 실온에서 0.1 % 트윈 20 (PBST)을 포함하는 막과 차단. </li><li> 기본 방지 BrdU의 항체 (1 : 500 희석) 추가 PBST 1 % 무 지방 건조 우유에 희석 및 통에 실온에서 3 시간 동안 차 항체와 얼룩을 품어. 일차 항체 배양 후에 PBST로 3 회 씻어 막. </li><li> 얼룩에 HRP - 복합 항 - 마우스 이차 항체를 추가 (1 : 5,000 희석) 1 시간 동안 실온에서 품어. 이차 항체 배양 후 PBST로 3 회 막 씻으십시오. 참고 : 완전히 일차 및 이차 항체 배양 중에 막 다루 항체의 충분한 양을 사용합니다. </li></ol></li><li> ECL 믹스를 준비하고 오 교류에 추가제조업체의 프로토콜에 cording. 실온에서 5 분간 ECL 믹스와 멤브레인을 품어. <ol><li> , X 선 카세트 막 배치 X 선 필름에 노출시켜 막 제조자의 프로토콜을 이용하여 블롯을 개발한다. </li><li> 제조사의 프로토콜에 따른 화상 J 소프트웨어를 이용하여 블롯을 스캔 한 후 입력 및 ChIPed의 DNA에 대해 얻어진 신호를 정량화. 정량 측정의 정확도를 보장하기 위하여 검출의 선형 범위 내에있는 신호를 사용한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

나는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

이 논문에 기술 된 프로토콜은 새로 복제 또는 초기 DNA에 단백질 또는 번역 후 변형 된 형태의 존재를 입증하는 상대적으로 빠른 방법입니다. 또한,이 기술은 초기의 단백질 또는 DNA와의 수정 된 형태의 어소시에이션 해리 동력학을 측정하는 하나를 허용한다. 이 기술은 우아한 iPOND 기술 (13)에 상보 적이다. iPOND 기술에서, 새로 합성 된 DNA는 에틸 옥시 우리 딘 (EDU)으로 표시됩니다. 비오틴 복합체는 클릭 화학을 사용하여 EDU에 추가됩니다. 비오틴 - 태그 초기 DNA는 다음 서부 블로 팅에 의해 감지 된 스트렙 타비 딘 비즈와 공동 정화 단백질을 사용하여 면역된다. 반면에, 우리의 BrdU의 칩 슬롯 서방 기법에서, 초기 DNA와 관련된 단백질 또는 이의 변형 된 형태의 단백질 고유 또는 개질 된 형태 - 특이 적 항체 및 결합의 BrdU 표지 된 초기 DNA의 양을 사용하여 면역 침강되고 단백질은 일입니다EN은 안티 BrdU의 항체를 사용하여 슬롯 웨스턴 블로 팅에 의해 정량적으로...

결함 DNA 수리 및 / 또는 DNA 복제는 세포 사멸을 유발할 수 게놈 불안정성의 주요 원인이다. 단일 수리되지 않은 이중 가닥 나누기 세포 사멸 원인 1에 충분하다. 염색질 조직은 일시적으로 모두 복제시 변경 및 2,3를 복구하고, 이러한 프로세스 무결성 게놈에 위협을 초래할 것 중에 후생 유전 학적 정보를 유지하기 위해 실패한다. HDAC3 또는 HDAC1,2 기능의 손실 유전자 독성 스트레스 (DNA 손상) 및 세포 사멸 4-9로 이어지는 S 상 진행, DNA 복제 및 수리를 방해한다. 따라서, 암 세포에서 복제, 보수 및 염색질을 방해 차례로 성장을 중지하고 급속 성장하는 암세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 DNA 손상을 유발하도록 선택 HDAC 억제제를 사용하는 실제적인 전략이다. DNA 복제 동안 염색질 빠르게 분해 한 다음 DNA 복제 다음 조립. 새로 SYnthesized 히스톤 H4는 염색질에 K5와 K12 잔류 물 (H4K5K12ac) 및 다음 증착에서 아세틸, 그들은 빠르게 히스톤 아세틸 라제 (HDACs) 10, 11에 의해 탈 아세틸된다. 히스톤 탈 아세틸 화하여 초기 염색질의 무결성을 유지하기 위해 세포의 실패는 결과적으로 DNA 손상 및 세포 사망을 초래할 수 포크 붕괴로 이어질 수 있습니다. 우리는 최근, HDAC1,2의 선택적 억제가 증가 히스톤 아세틸 화 (H4K5ac, H4K12ac 및 H4K16ac) 감소 된 복제 포크의 진행과 관련이 초기 염색질에 SMARCA5 염색질 인부 활성을 억제하는 것으로 나타났다 포크 붕괴를 증가 및 복제 스트레스에 의한 DNA 손상 (6)을 증가 . 그러므로, HDAC 억제제 치료 빠르게 이러한 세포주기로서, 암세포에서 매우 빠르게 DNA 손상 및 사망을 유발과 S 상을 통해 여러 번 통과하는 초기 염색질 구조를 변경할 수있다. 그것은 HDACs는 히스톤 아세틸 화 단백질 BINDI을 조절하는 기능을하는 방법을 이해하는 것이 중요하다NG는 포유 동물 세포에서 DNA 복제를 유지한다. 정량적으로 히스톤 아세틸 화와 DNA 복제시 초기 DNA와 관련된 SMARCA5 염색질 인부의 양을 측정하기 위해, 우리는 수정 된 칩 분석이 BrdU의 칩 슬롯 지방 기술이라고 고안했다. 슬롯을 이용하여 막에 원하는 단백질 또는 히스톤 변형 염색질 면역 침전 (칩) 다음, 초기 DNA의 양의 BrdU 표지 된 칩 DNA의 웨스턴 분석을 이용하여 검출 할 수있다 칩 샘플 (티미 딘 유사체의 BrdU를 사용하여 표지)를 전송 오 장치. 이 기술을 사용하여, 우리는 H4K16ac (염색질 포장에 관련된 표시) 및 ISWI의 가족 SMARCA5 (염색질의 SWI / SNF 관련 매트릭스 관련 굴지 의존 레귤레이터) 염색질 인부가 S 상 세포에서 초기 DNA와 연관되어 있음을 보여 주었다 6. 우리는 또한 초기 H4K16ac 표시가 DNA 복제 6시 HDAC1,2에 의해 탈 아세틸 것으로 나타났습니다. H4K16ac의 억제ISWI의 가족 SMARCA5 (12)의 크로 마틴 인부 활동. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여, 우리는 DNA 복제시 염색질 리모델링을 조절하는 HDAC1,2의 기능을 연결할 수 있습니다. 따라서, BrdU의 칩 슬롯 - 서쪽 오점 기술은 정량적으로 초기 DNA에 결합되어 단백질 또는 번역 후 변형의 연결 및 분리 역학을 측정 할 수있는 강력한 방법입니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-BrdU (서부)</td><td>BD Biosciences</td><td>B555627</td><td></td></tr><tr><td>Anti-SMARCA5</td><td>Abcam</td><td>ab3749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-H4K16ac</td><td>Active Motif</td><td>39167</td><td></td></tr><tr><td>Zeta-Probe GT Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0197</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Fisher</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>단백질 A 아가로스</td><td>Millipore</td><td>16-156</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P4850</td><td></td></tr><tr><td>PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Sigma</td><td>B9285</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG& 주의;</td><td>Millipore</td><td>12-370</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S-3014</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>시그마</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>USB Corporation</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 데옥시콜레이트</td><td>시그마</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>시그마</td><td>S-4019</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Laboratories</td><td>04-355-222</td><td></td></tr><tr><td>DEPC 처리된 물</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP-152-5</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>Mallinckrodt GenAR&nbsp;</td><td>MAL7772-06</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Life Technologies</td><td>15557-036</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>Lab Scientific Inc</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Thermo Fisher</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>X선 필름</td><td>Genesee Sci</td><td>30-101</td><td></td></tr><tr><td>개발자</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>XLE-1000</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>Branson Sonifier&nbsp; 디지털 초음파 세포 파괴기</td><td>모델: 450</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>모델: 5810R</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific Isotemp</td><td>모델: 2322</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 분광광도계</td><td>ThermoScientific</td><td>모델: 1000</td><td></td></tr><tr><td>슬롯 블롯 장치&nbsp;</td><td>Schleicher and Schuell Minifold II</td><td>44-27570</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>Series II 3110 워터 재킷 CO2 인큐베이터</td><td></td></tr></tbody></table>

포유 동물 세포에서 초기 dna에 바인딩 단백질의 시험 brdu의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

히스톤 데 아세틸 라제 1 및 2 (HDAC1,2)는 DNA 복제의 사이트 지역화. 이전 연구에서, 선택적 억제제 및 유전자 녹다운 시스템을 이용하여, 우리는 복제 포크 진행 및 포유 동물 세포의 초기 염색질 HDAC1,2 유지에 대한 새로운 기능을 보였다. 또한, 우리는 슬롯 오 점 브로 모 옥시 우리 딘 (BrdU의) 표지 된 DNA의 염색질 면역 침전 (칩)을 결합과 서양의 정량적 초기 DNA와 관련된 단백질 또는 히스톤 변형을 측정하는 분석 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용했다. 적극적으로 분열하는 세포는 HDAC1,2 선택적 억제제로 치료 또는 HDAC1과 Hdac2에 대한 siRNA를 형질 도입 한 후 새로 합성 된 DNA는 티미 딘 아날로그 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)으로 표시 하였다되었다. 유의 한 세포주기 정지 또는 세포 자멸사가 없을 때의 BrdU 라벨링 인해 HDAC1,2 기능 상실 시점에서 이루어졌다. 다음 LBrdU의 히스톤 아세틸 마크, 크로 마틴 면역 (칩) 또는 염색질 인부와 세포의 abeling 특정 항체로 하였다. BrdU의 표지 된 DNA 입력 및 면역 침전 (또는 ChIPed) DNA는 슬롯 블랏 기술을 이용하여 막에 발견하고 UV를 이용하여 고정화시켰다. 각각의 슬롯에있는 초기 DNA의 양을 정량적으로는 항 BrdU의 항체로 웨스턴 분석을 사용하여 평가 하였다. 새로 합성 된 DNA 관련 히스톤의 아세틸 마크 및 염색질 인부의 레벨에 HDAC1,2 기능의 손실 효과는 대조 시료에 처리 된 시료로부터 얻어진 BrdU의 칩 신호를 정규화하여 측정 하였다.

HDAC1,2 선택적 억제제의 특이성을 결정하기 위해, Hdac1,2 FL / FL 및 Hdac3 FL / FL 섬유 육종 세포를 사용 하였다. 아데노 바이러스 함유 Cre 호텔 재조합 효소 (AD-Cre 호텔)이 세포에서 Hdac1,2과 Hdac3을 삭제하는 데 사용되었다. Hdac1,2 FL / 플로리다의 다음 광고-Cre 호텔 감염 세포 H4K5ac에서 강력한 증가가 관찰되었다. 233 또는 898으로 Hdac1,2 녹아웃 세포의 치료는 233과 898이 세포에서 Hdac1,2하지 Hdac3을 억제하는 것을 확인 H4K5ac에서 더 이상의 증가를 초래하지 않았다. 대조적으로, Hdac3 녹아웃 세포에 233 또는 898의 첨가는, 그러므로 인해 Hdac1,...

이 프로토콜에서는 새로 합성되거나 초기 DNA와 관련된 단백질 및 히스톤 변형을 검사하는 새로운 BrdU-ChIP-Slot-Western 기술을 설명합니다.

포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

이 절차의 전반적인 목표는 BrdU 라벨링 및 염색질 침전을 사용하여 초기 DNA에 결합된 단백질을 정확하게 검사하는 것입니다. 이 방법은 DNA 복제 중에 어떤 단백질이 초기 DNA에 결합되고 복제 스트레스 동안 어떤 복구 단백질이 초기 DNA에 결합되는지와 같은 염색질 분야의 복제, 복구에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초기 DNA에 결합된 단백질을 매우 정량적인 방식으로 검출하는 비교적 빠른 방법이라는 것입니다.먼저 DMSO 또는 억제제를 사용하여 10ml의 배지에 200만 개의 NIH 3T3 세포 배양을 설정합니다. 또한 BrdU를 최종 농도인 20마이크로몰에 추가합니다. 플레이트가 생성되면 60분 동안 세포를 배양합니다.한 시간 후, 포름알데히드를 배양 배지에 1% 부피의 농도로 직접 첨가하여 세포 내 단백질을 DNA에 가교 결합시킵니다. 그런 다음 교반과 함께 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 10분 후, 125밀리몰로 배지에 글리신을 첨가하여 반응을 소멸시키고 5분 더 배양을 계속합니다.다음으로, PBS에 세포를 모으고 원심분리를 사용하여 PBS로 두 번 세척합니다. 펠릿은 원하는 경우 저장당 섭씨 80도에서 동결할 수 있습니다. 이제 가교 결합 된 세포에서 용해물을 준비하고, 프로테아제 억제제 칵테일이 보충 된 FA140 완충액 500 마이크로 리터를 펠렛에 첨가하고, 5 개의 15 초 초음파 처리를 사용하여 염색질을 전단합니다.펄스 사이에서 세포를 차갑게 유지하십시오. 그런 다음 1.5% 젤에 10마이크로리터의 샘플을 실행하여 전단 효율을 진단합니다. 일단 전단되면, 10 분 동안 표본을 분리기하고, 새로운 관으로 supertadent를 옮깁니다.그런 다음 키트를 사용하여 상층액의 단백질 농도를 추정합니다. 다음으로, 프로테아제 억제제를 함유한 FA140 완충액이 있는 단백질 A 아가로스 비드의 50% 슬러리를 준비합니다. 각 샘플에 50마이크로리터의 슬러리를 추가하고 30분 동안 일정한 종단 간 회전으로 섭씨 4도에서 샘플을 배양합니다.30분 후, 냉장 원심분리기에서 약 1000G을 1분 동안 샘플을 회전시킵니다. 그런 다음 표지된 염색질을 포함하는 상등액을 수집합니다. 계속하기 전에 추출물의 1/10을 섭씨 20도에서 저장하여 나중에 입력 컨트롤로 사용합니다.염색질을 면역침강시키려면 상층액에 8마이크로리터의 H4K16ac 항체 또는 5마이크로그램의 SMARCA5 항체를 첨가합니다. 또한 음성 대조군 샘플 역할을 하는 추출물에 5마이크로그램의 빠른 IgG를 첨가합니다. 크로마틴을 섭씨 4도에서 로티세리 믹서에서 밤새 배양합니다.다음날, 준비된 50% 단백질 A 아가로스 슬러리 50마이크로리터를 면역침전물에 첨가하고 혼합물을 섭씨 4도에서 회전과 함께 한 시간 동안 배양합니다. 한 시간 후, 아가로스 구슬을 펠릿으로 만들고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 이제 3개의 순차적 버퍼에서 섭씨 4도의 종단 간 회전을 사용하여 비드를 세척합니다.먼저 갓 준비한 저염 면역 복합 세척 완충액을 5분 동안 사용합니다. 둘째, 갓 준비한 고염 면역 복합 세척 완충액을 5분 동안 사용합니다. 셋째, 갓 준비한 염화리튬 면역 복합체 세척 완충액을 5분 동안 사용합니다.세척 후, 텍스트에 설명된 대로 샘플에 용출 용액을 추가합니다. 샘플을 돌리고 용리액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 이제 샘플을 섭씨 65도에서 5시간 동안 배양하여 가교를 역전시킵니다.나중에 DNA를 침전시킵니다. 샘플에 100% 에탄올 1ml를 넣고 잘 섞습니다. 그런 다음 섭씨 80도에서 2-3시간 동안 또는 섭씨 20도에서 하룻밤 동안 배양합니다.침전 후, 18000G에서 15분 ceintrifugation으로 에탄올을 제거합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 따라 펠릿을 세척하고 샘플을 RNase, Proteinase K로 처리한 다음 텍스트에 설명된 대로 DNA를 정제하고 마지막으로 섭씨 20도에서 보관합니다. 먼저 분광 광도계에서 입력 및 ChIP DNA의 수율을 측정합니다.그런 다음 샘플을 변성시킵니다. 0.4 normal sodium hydroxide를 2.5 부피로 넣고 간단히 와류 및 원심 분리기를 넣고 실온에서 30 분 동안 샘플을 배양합니다. 다음으로, 175 마이크로 리터의 1 몰 Tris hydochloride pH 6.8을 첨가하여 변성 된 DNA를 중화한다.소용돌이, 원심분리기를 만들고 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 이제 입력 및 면역침전된 DNA의 연속 희석을 준비하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 slot-blot assay를 진행합니다. 블롯의 DNA를 UV 고정한 후 웨스턴 블로팅을 사용하여 슬롯 블롯에서 BrdU를 검출합니다.먼저 PBST에 5% 무지방 분유로 멤브레인을 실온에서 한 시간 동안 차단하여 비특이적 결합을 방지합니다. 다음으로, 1:500 희석된 항-BrdU 항체를 첨가하여 PBST에서 1% 무지방 분유 목욕을 준비합니다. 이 수조의 블롯을 셰이커의 실온에서 3시간 동안 배양합니다.그 후, PBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다. 그런 다음 PBST에 HRP 접합 항마우스 2차 항체를 1:5000 희석하여 블롯을 담그십시오. 실온에서 한 시간 동안 흔들면서 배양합니다.PBST로 3회 세척하여 2차 세척을 제거하고 결과를 분석합니다. BrdU H4K16ac ChIP 슬롯 웨스턴 기법을 사용하여 초기 DNA와 관련된 H4K16ac의 양을 측정했습니다. 빠른 IgG 대조군과 비교했을 때 초기 DNA와 관련된 H4K16ac의 강력한 농축이 관찰되었습니다.화합물 233으로 HDAC1/2를 억제한 후, nascent-DNA-associated H4K16ac의 증가가 관찰되었습니다. 화합물 898을 사용하여 동일한 결과를 얻었다. 마지막으로, 초기 DNA에 대한 SMARCA5 염색질 리모델링기의 수준은 BrdU SMARCA5 ChIP 슬롯 웨스턴 기술을 사용하여 결정되었습니다.실제로, 초기 DNA와 화합물 898과 관련된 SMARCA5은 SMARCA5 수치를 변화시키지 않았다. 이 비디오를 시청한 후에는 포유류 세포에서 DNA 복제 중에 염색질 및 염색질 변형 효소에서 발생하는 변화를 잘 이해하게 될 것입니다. 개발 후 이 기술은 복제 분야의 연구자들이 초기 DNA의 염색질 변화와 초기 DNA의 DNA 복구 단백질의 역학을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.미래에는 이 기술을 사용하여 포크에서 히스톤 변형 및 염색질 변형 효소를 연구하는 것 외에도 스톨된 포크에서 DNA 손상 반응 및 DNA 복구 단백질의 역학을 연구할 수 있습니다.

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세포의 인구의 세포주기의 위치를​​ 결정, 또는 신호가 증식에 미치는 영향에 대해 이해하고, 쉽게이 프로토콜을 사용하여 유동세포계측법에 의해 측정할 수 있습니다. 우리는 세포를 얼룩 및 세포주기 자신의 지위를 quantifying하는 간단한 실험 방법을보고합니다.

포유 동물 세포의 세포주기의 위치 분석

염색체 복제 타이밍 분석을위한 정량 방법 설명되어 있습니다. 방법은 형광와 함께 BrdU의 설립을...

형광등과 결합 염색체 복제 타이밍<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

이 동영상은 BrdU 면역형광 염색 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술을 사용하면 세포주기의 여러 단계에서 세포를 식별 할 수 있습니다. DNA 염료 및 항체 표지를 추가하면 나중에 S기 세포의 운명을 자세히 분석할 수 있습니다.

BrdU 면역형광 염색: 세포 주기의 여러 단계에서 세포를 식별하는 기술

이 비디오 문서는 두 개의 구성 요소 시스템 응답 레귤레이터 유전자 표적 및 결합 부위를 결정하기 위해 시험 관내 마이크로 어레이 기반의 방법을 설명한다.

세균에 대한 두 개의 구성 요소 규제 시스템을 유전자 표적을 확인하는 DNA 친화력 - 정제 칩 (DAP-칩) 방법

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단백질 DNA 장애 405 Nm 레이저 마이크로 방사선 조사를 사용 하 여 채용의 조사

Ribonucleotides는 가장 풍부한 비정규 뉴클레오티드 핵 핵 DNA 복제 중 게놈으로 통합 중 이다. 제대로 제거, DNA 손상과 mutagenesis ribonucleotides 발생할 수 있습니다. 여기, 우리가 DNA와 그 변이 원 성 영향으로 ribonucleotide 설립의 풍부를 평가 하는 데 사용 되는 두 가지 실험 방법을 제시.

Ribonucleotides 효 모 게놈에 Ribonucleotide 유도 된 Mutagenesis 측정의 공부 Ribonucleotide 법인: 물가 관련 검색

본 프로토콜에서, 우리는 면역 형광 기지를 둔 방법을 사용하여 세포 주기의 S/G2 단계 도중 DNA 이중 가닥 말 절제술을 구상하는 방법을 보여줍니다.

세포 주기 차별 화상 진찰과 결합된 BrdU DNA 라벨링을 사용하여 글로벌 DNA 이중 가닥 끝 절제술의 평가

본 프로토콜은 토포이소머라제 억제제 및 포름알데히드에 의해 유도된 유비퀴틸화, SUMOylation 및 ADP-리보실화를 포함하여 DNA-단백질 가교결합(DPC) 및 번역 후 변형(PTM)을 검출하고 정량화하는 변형된 방법을 강조하여 DPC 및 그 PTM의 형성 및 복구에 대한 연구를 허용합니다.

DNA-단백질 가교 및 번역 후 변형의 정량적 검출

다음 프로토콜은 세포주기 동기화 후 RPA2 면역형광 염색을 사용하여 세포주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소를 검출하는 방법을 제시합니다.

세포 주기의 G1 단계에서 단일 가닥 DNA 병소 시각화

단백질 관련 신생 DNA의 풍부화 및 시퀀싱(eSPAN)은 두 개의 복제 DNA 가닥에서 염색질 관련 단백질의 상대적 풍부도를 검출하기 위해 개발되었으며, 이를 통해 염색질 복제와 그 결합 과정에 대한 분자적 통찰을 밝혀냈습니다. 이 프로토콜은 효모 및 마우스 배아 줄기(ES) 세포에서의 eSPAN 절차를 설명합니다.

단백질 관련 신생 DNA 농축 및 시퀀싱을 통한 DNA 복제 가닥 단백질의 가닥 특이적 분석

층병증 장애는 종종 핵막의 변화를 일으켜 핵 누출 및 누출을 유발할 수 있습니다. 이 연구는 이중 가닥 DNA(dsDNA)와 함께 핵 층을 시각화하는 면역형광 방법을 제시하여 포유류 세포의 핵 구조와 무결성을 평가할 수 있는 수단을 제공합니다.

면역형광에 의한 포유류 세포의 핵 블리빙 및 DNA 누출 검출

배우세요 BrdU-ChIP-Slot-Western 기법을 사용하여 포유 동물 세포에서 신생 DNA에 결합한 단백질과 히스톤 변형을 정량적으로 분석하는 방법을. 이 기술은 DNA 복제 및 손상 복구 메커니즘 연구에 활용됩니다.

포유 동물 세포에서 초기 DNA에 바인딩 단백질의 시험 BrdU의 칩 슬롯 서양 기술을 사용하여

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