휴대 Mitophagy을위한 마커 EYFP - 파킨 집계의 평가를위한 시간 경과 비디오 현미경

이 타임랩스 비디오 현미경 관찰의 전반적인 목표는 마이토파지 과정 동안 Parkin 매개로 손상된 미토콘드리아가 선택적으로 제거되는 것을 추적하는 것입니다. 이 방법은 마이토파지가 지속적인 병리학적 상태에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 분자 대사 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 분자 과정 중에 표지된 단백질의 역동성을 추적할 수 있는 매우 강력한 도구를 제공한다는 점입니다.

이 방법은 미토콘드리아의 생애 주기에 대한 통찰을 제공할 수 있습니다. 또한 일차 세포 배양, 배아학 연구 및 우선순위 예측과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 불멸화 마우스 배아 섬유아세포는 5% 이산화탄소가 포함된 습윤한 분위기의 37 °C 조건에서 10 cm 조직 배양 플레이트의 완전 DMEM 배지에서 배양되었습니다.

세포의 합류도가 80%에 도달하면, 멸균 흡입기로 배지를 제거하고 10 mL의 멸균 PBS를 첨가합니다. PBS를 제거한 후, 0.25% Trypsin EDTA 1 mL를 첨가합니다. 세포가 떨어져 나올 때까지 플레이트를 37 °C에서 2~3분 동안 배양합니다.

완전 DMEM 배지 4 mL를 첨가하고 세포를 재현탁합니다. 헤모사이토미터를 이용한 세포 수 측정을 위해 세포 현탁액 10 µL를 취합니다. 10 cm 조직 배양 접시에 1 × 10⁶ 개의 세포를 분주하고 24시간 동안 배양합니다.

다음 날, 이전에 설명한 대로 PBS로 세포를 한 번 세척하고 트립신 처리하여 세포를 떼어냅니다. 완전 DMEM 배지 4 mL를 추가하여 세포를 재현탁한 후, 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮깁니다. 250 g, 4 °C에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.

상청액을 버리고 펠렛을 1 mL의 멸균 PBS에 다시 현탁합니다. 세포를 다시 원심 분리합니다. 두 번째 원심 분리 후 상청액을 버립니다.

세포 펠릿에 전기천공용 혼합 용액 100 µL를 첨가하고 피펫팅을 통해 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그다음 세포 현탁액에 2 µg의 EYFP Parkin 발현 플라스미드와 1 µg의 DsRed2 Mito 발현 플라스미드를 첨가합니다. 일회용 파스퇴르 피펫을 사용하여 용액을 멸균 큐벳으로 옮깁니다.

설정된 프로그램을 사용하여 세포를 전기천공합니다. 전기천공 직후, 500 µL의 신선하고 미리 가온된 완전 DMEM 배지를 세포에 첨가하고, 6 cm 라이브 이미징 등급 조직 배양 플레이트에 세포를 분주합니다.

세포를 5% 이산화탄소가 포함된 습윤한 분위기에서 37 °C로 24시간 동안 배양합니다. 이 절차를 시작하기 전에 현미경 챔버의 온도를 37 °C로 설정하십시오. 다음으로, 10% FBS, 2 mM L-Glutamine, 100 U/mL penicillin 및 100 mg/mL streptomycin이 첨가된 Phenol-free DMEM을 혼합하여 특정 라이브 이미징 배지를 준비합니다.

배지를 항온수조에서 37 °C로 예열합니다. 전기천공된 세포의 배지를 멸균 흡입기로 제거하고, 예열된 라이브 이미징 배지 1 mL를 첨가합니다. 플레이트를 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.

현미경 챔버의 온도가 37°C로 안정된 것을 확인한 후, 챔버 내에 5% 이산화탄소를 주입하십시오. 전기천공된 세포가 담긴 플레이트를 큰 움직임이나 흔들림 없이 조심스럽게 현미경 챔버 안에 넣으십시오.

소프트웨어 인터페이스를 사용하여 EYFP Parkin 및 DsRed2 Mito 발현 벡터에 의해 인코딩된 융합 단백질의 형광 신호를 검출하도록 현미경을 설정하십시오. 타임랩스 비디오 현미경 소프트웨어를 엽니다. 상단 메뉴에서 EYFP Parkin은 FITC를, DsRed2 Mito는 Rhodamine을 선택하십시오.

배율을 20X로 선택하십시오. 소프트웨어 인터페이스를 사용하여 공동 형질전환된 두 벡터를 모두 발현하는 단일 세포를 찾아 위치를 기록하십시오. 모든 실험 조건에 대해 최소 10개의 세포에 대해 이 과정을 수행하십시오.

Apps 메뉴를 선택하고 Multi Dimensional Acquisition을 클릭합니다. Multi Dimensional Acquisition 창에서 획득 횟수, 각 획득 간의 시간 간격, 기록될 세포의 위치와 같이 필요한 파라미터를 선택합니다. Acquire를 클릭하여 두 형광 신호의 기저 상태 획득을 시작합니다.

총 15분 동안 5분 간격으로 이미지를 수집합니다. 이미지 획득이 진행되는 동안, 최종 작동 농도의 2배 농도로 Carbonyl Cyanide 4 trifluouromethoxy phenylhydrazone(FCCP)이 포함된 미리 데워진 라이브 이미징 배지를 준비합니다. 이미지 획득 과정을 중단하고, FCCP가 포함된 미리 데워진 라이브 이미징 배지 1 mL를 현미경 챔버 내의 플레이트에 조심스럽게 첨가합니다.

FCCP를 첨가한 후, 이미지 획득을 다시 시작하기 전에 현미경의 초점을 다시 맞추는 것이 중요합니다. 앞서 설명한 대로 획득 과정을 다시 시작하고, 기록된 위치를 사용하여 총 3시간 동안 이미지를 수집합니다. 이미지 획득이 완료되면, 이후 분석을 위해 획득한 모든 이미지를 저장하십시오.

FCCP 투여 전 섬유아세포에서 EYFP-Parkin 및 DsRED2-Mito 형광 신호를 촬영한 타임랩스 이미지입니다. 흰색 상자는 오른쪽 각 패널의 확대 영역을 나타냅니다. 기저 시점 동안 녹색으로 시각화된 EYFP-Parkin은 세포 전체에 균일하게 확산되어 있습니다.

빨간색으로 시각화된 미토콘드리아 네트워크는 흰색 화살표로 표시된 바와 같이 잘 연결되어 있는 것으로 보입니다. FCCP 투여 후, 5분 시점에 막 탈분극으로 인한 미토콘드리아 분획화가 관찰됩니다. 하지만 EYFP-Parkin은 여전히 세포질 전체에 균일하게 확산되어 있습니다.

FCCP 투여 후 55분 시점에 EYFP-Parkin이 손상된 미토콘드리아 막으로 보충되어 미토파지 과정을 유도합니다. FCCP 투여 후 EYFP-Parkin이 미토콘드리아 막으로 이동하는 모습이 이 대표 타임랩스 영상에 나타나 있습니다. 이 기술을 숙달하고 적절히 수행한다면 2시간 이내에 완료할 수 있습니다.

이 기술이 개발된 이후, 오토파지 분야의 연구자들은 미토콘드리아 재활용을 실험할 수 있는 길을 열게 되었습니다. 이를 통해 세포 내 미토콘드리아 품질 관리로서의 미토파지 과정을 연구할 수 있게 되었습니다.