허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

이 절차의 전반적인 목표는 다파라메트릭 유세포 분석에 의한 정량화 및 표현형 특성화를 위해 허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포를 분리하는 것입니다. 다색 유세포 분석법에 의한 뇌의 허혈 후 염증 분석은 병변 진행, 회복 및 뇌졸중의 전반적인 결과와 관련된 면역학적 과정에 대한 심층적인 이해를 제공합니다. 이 절차의 주요 장점은 허혈성 마우스 뇌에서 많은 수의 생존 가능한 면역 세포를 분리할 수 있는 빠른 1단계 밀도 구배 원심분리입니다.

이 기술의 적용은 뇌졸중의 더 넓은 시간대에 적용할 수 있는 새로운 면역 조절 치료 전략의 식별 및 검증을 목표로 합니다. 먼저 연동 관류 펌프 튜브의 한쪽 끝을 얼음처럼 차가운 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS에 담그는 것으로 시작합니다. 뭉툭한 23게이지 바늘을 튜브의 다른 쪽 끝에 고정합니다.

그리고 펌프를 켜서 튜브를 HBSS로 완전히 채웁니다. 다음으로, 안락사된 쥐를 플라스틱 쟁반에 박혀 있는 해부판에 등쪽으로 올려 놓고, 20게이지 바늘로 가능한 한 넓게 뻗은 앞발을 핀으로 고정합니다. 복부 피부를 잡기 위해 한 쌍의 곧은 두 개의 치아 집게를 사용하여 날카로운 홍채 가위로 외피와 복벽을 통해 측면 절개를 만들어 간을 노출시킵니다.

그런 다음 흉골을 들어 올리고 날카롭고 뭉툭한 홍채 가위의 뭉툭한 칼날을 사용하여 횡격막을 절개합니다. 폐, 심장, 흉동맥을 다치지 않도록 주의하면서 양쪽 측면 흉곽을 백두개 방향으로 계속 자르고 뭉툭한 집게를 사용하여 피부 덮개에 맞춥니다. 덮개를 박리판에 고정하고 심장과 결합 조직을 조심스럽게 분리합니다.

뭉툭한 집게로 심장을 잡은 다음 관류 튜브 끝에 있는 23게이지 바늘 끝을 심실 중격이 손상되지 않도록 주의하면서 좌심실 정점에 삽입합니다. 날카로운 홍채 가위를 사용하여 오른쪽 심방을 절개하고 즉시 펌프를 시작하고 펌핑 내에서 거품이 형성되지 않도록 주의하십시오. 간이 옅은 커피색이 되면 수술용 가위를 사용하여 두개골 바로 뒤에 있는 쥐의 목을 베십시오.

그런 다음 홍채 가위를 사용하여 두피의 정중선을 절개합니다. 두개골이 보이면 날카로운 홍채 가위 한 끝을 구멍에 넣고 뼈를 옆으로 절개합니다. 반대쪽도 절개 과정을 반복합니다.

그런 다음 날카로운 아이리스 가위를 사용하여 같은 구멍에서 정중선을 따라 코 쪽으로 조심스럽게 자릅니다. 가는 집게를 사용하여 각 뇌 반구의 두개골 뼈를 부드럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 주걱으로 뇌를 들어 올리고 날카로운 홍채 가위를 사용하여 두개골에 고정하는 뇌 신경 섬유를 조심스럽게 절개합니다.

얼음 위에 칼슘과 마그네슘이 함유된 HBSS 10ml가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 뇌를 넣습니다. 대뇌 조직을 단세포 현탁액으로 해리시키려면 먼저 깨끗한 면도날을 사용하여 뇌간과 대뇌를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 다른 깨끗한 면도날을 사용하여 뇌를 반분파하고 관상면(coronal plane)을 따라 각 반구를 대략 같은 크기의 세 조각으로 자릅니다.

5밀리리터 주사기의 플런저 끝을 사용하여 100미크론 세포 여과기를 통해 뇌 조직 조각을 으깨고 칼슘과 마그네슘이 함유된 얼음처럼 차가운 HBSS로 여과기를 계속 헹굽니다. 그런 다음 균질화된 조직을 얼음 위에 놓습니다. 모든 샘플이 처리되면 세포 현탁액을 스핀다운하고 상층액을 조심스럽게 폐기합니다.

펠릿을 1ml의 소화 완충액에 재현탁시킵니다. 그런 다음 세포 현탁액을 2mm 튜브로 옮기고 섭씨 37도에서 천천히 연속 회전하면서 세포를 배양합니다. 1시간 후 70미크론 세포 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 체로 치고 DNase가 함유된 3ml의 세척 버퍼로 필터를 철저히 헹굽니다.

그런 다음 15ml의 DNase-free 세척 버퍼로 스트레이너를 세척하고 세포를 회전시킨 다음 상층액을 버립니다. 세포 파편과 미엘린을 제거하려면 5ml의 실온, 25% 밀도 구배 배지에 세포를 재현탁하고 세포 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 반복적이고 부드러운 피펫팅으로 세포를 gradient에 따라 철저히 혼합합니다.

그런 다음 셀 용액을 스핀다운합니다. 분리가 끝나면 펠릿을 방해하지 않고 미엘린 코트와 상층액을 조심스럽게 흡인하고 10ml의 DNase-free 세척 완충액에 세포를 재현탁합니다. 세포를 15ml 튜브로 옮기고 다시 스핀다운하여 펠릿을 100마이크로리터의 냉세척 버퍼에 다시 현탁시킵니다.

그런 다음 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)로 생존 가능한 세포의 수를 세고 섭씨 4도에 보관합니다. 면역염색을 시작하기 전에 항 쥐 CD26/CD32 Fc 수용체 차단 시약으로 섭씨 4도에서 10분 동안 세포를 배양하여 비특이적 결합을 방지합니다. 그런 다음 관심 있는 형광단 접합 1차 항체를 섭씨 4도에서 어둠 속에서 20분 동안 추가합니다.

배양이 끝나면 2ml의 유세포 분석 완충액으로 세포를 세척합니다. 스핀 다운. 펠릿을 200마이크로리터의 유세포 분석 버퍼에 재현탁하고 유세포 분석이 완료될 때까지 샘플을 섭씨 4도에서 보관합니다.

비드 카운팅을 통해 침투하는 면역 세포의 절대 수를 정량화하려면 정확히 40마이크로리터의 유세포 분석과 10마이크로리터의 세포 현탁액을 알려진 수의 형광 비드가 들어 있는 계수 튜브에 리버스 피펫으로 주입합니다. 다음으로, 암흑 속에서 20분 동안 섭씨 4도에서 FITC 표지 CD45 항체로 세포 및 비드 현탁액을 배양한 다음 200마이크로리터의 유세포 분석 완충액으로 계수 튜브를 역충진합니다. 그런 다음 즉시 유세포분석기에서 샘플을 실행하여 비드 및 CD45 양성 세포 이벤트를 기록합니다.

중대뇌동맥 폐색 후 24시간이 지나면 뇌에 침투하는 백혈구는 CD45-high 발현으로 식별할 수 있습니다. CD45가 높은 집단 내에서 다형성 핵 호중구는 LY-6G 발현으로 식별되는 반면 T-림프구는 CD45 높은, CD3 양성 세포 표면 표현형을 나타냅니다. 나머지 CD45 high cell은 CD19 및 CD11b 발현에 의해 더욱 구별될 수 있습니다.

CD11b 양성 분획은 Ly-6C-높은 염증성 단핵구와 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포 집단을 포함하는 Ly-6C-low 집단으로 하위 분류될 수 있습니다. 뇌졸중의 급성 단계에서는 혈관 폐색 후 Ly-6G 양성 호중구가 뇌로 빠르게 들어갑니다. 대조적으로, 허혈성 반구에서 CD3 양성 T 세포의 빈도는 가짜 수술 뇌 및 반대쪽 반구에 비해 감소합니다.

CD11b 양성 집단 내에서 뇌허혈은 Ly-6C-높은 염증성 단핵구가 우세한 쪽으로 균형을 이동시킵니다. 또한, 경색된 반구의 총 백혈구 수는 중대뇌동맥 폐색 후 24시간 후에 반대쪽 반구 및 가짜 수술 뇌에 비해 크게 증가합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 기계적 단편화, 효소 분해 및 밀도 구배 원심분리를 통해 허혈성 뇌에서 면역 세포를 분리하는 방법과 유세포 분석을 통해 이러한 세포를 특성화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행한다면 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 세포 수율은 뇌 조직의 철저한 해리에 결정적으로 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한, 뇌에 침투하는 백혈구가 비염증성 순환 면역 세포로 오염되는 것을 방지하기 위해 충분한 경심 관류가 필요합니다.

이 절차에 따라 유전자 발현 분석 또는 사이토카인 프로필 분석과 같은 다른 방법을 수행하여 허혈성 뇌졸중의 맥락에서 뚜렷한 면역 농양의 기능적 관련성에 대한 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다.