재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

본 절차의 전반적인 목적은 중추신경계 내 정위 주입법(Stereotactic Injection)을 통해 파킨슨병의 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 구축하는 것입니다. 이 방법은 전임상 약물 테스트가 가능한 정상 동물 모델을 개발하는 데 사용될 수 있으며, 파킨슨병 및 기타 여러 신경퇴행성 질환의 분자적 기전을 연구하는 데 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 뇌 영역을 특이적으로 표적화할 수 있다는 점입니다.

높은 수준의 뇌 발현을 달성할 수 있으며, 이를 통해 특정 동물 계통 및 종에서 동물 모델을 제작할 수 있습니다. 다양한 최종 벡터 시스템이 개발되었습니다. 벡터 시스템의 선택은 발현시키고자 하는 유전자의 크기, 유전자 발현 기간, 표적으로 하는 부위, 그리고 생물학적 안전성 문제에 따라 달라집니다.

실험 절차 시연은 저희 실험실의 기술자인 Annelies Aertgeerts가 진행하겠습니다. 우선 승인된 프로토콜에 따라 8주령의 암컷 Wistar 랫드를 적절히 마취하십시오. 각 발을 쥐어보아 회피 반사가 없는 것을 확인하여 수술 가능 수준의 마취 상태에 도달했는지 점검합니다.

다음으로, MicroTransponder implanter를 사용하여 쥐의 등 쪽에 MicroTransponder를 삽입합니다. MicroTransponder가 정확한 위치에 배치되었는지 확인하고 판독 값이 얻어지는지 확인합니다. 이제 쥐의 두피 부분 털을 깎고, 두피와 귀에 국소 마취제를 도포합니다.

쥐를 층류 후드(laminar flow hood)로 옮기고, 무균 조작법을 사용하여 나머지 절차를 수행합니다. 이어바(ear bars)를 고정한 후 입과 코 바(mouth and nose bar)를 고정하여 쥐를 정위 고정 장치(stereotaxic frame)에 배치합니다. 체온 저하를 방지하기 위해 종이 담요로 쥐의 몸을 덮어줍니다.

눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안구 윤활제를 도포합니다. 다음으로 승인된 절차에 따라 두피를 소독합니다. 여기서는 70% isopropyl에 희석한 1% 요오드 용액을 사용합니다.

두피의 중앙선에 작은 절개를 가한 후, 두개골 위의 막을 조심스럽게 긁어내고 식염수로 헹굽니다. 두개골을 건조시킨 후, bregma와 lambda가 명확하게 보이는지 확인합니다. 이제 10 µL, 30 gauge 20 mm 미세 주입용 주사기에 재조합 AAV를 채우고, 정위 고정 장치에 연결된 전동 미세 주입 펌프에 장착합니다.

흑질의 도파민성 뉴런을 특이적으로 형질전환하기 위해서는 높은 역가와 도파민성 뉴런에 대한 뛰어난 형질전환 효율 덕분에 재조합 AV 벡터가 최우선적으로 선택됩니다. AAV 한 방울을 떨어뜨려 흐름을 테스트하십시오. 유출된 AAV는 다가 세정제로 처리하십시오.

머리가 헤드 프레임에 똑바로 고정되었는지 육안으로 확인합니다. 그런 다음, 먼저 바늘 끝을 bregma로 이동시킨 후 바늘 끝을 등-배(dorsal-ventral) 방향으로 내려 두개골에 닿을 때까지 높이를 측정하여 두개골이 평평한지 확인합니다. lambda에서도 동일한 절차를 반복합니다.

바늘을 다시 브레그마(bregma) 위치로 되돌린 후, 미세주입을 위한 입체좌표에 맞춰 바늘을 전후 및 내외 방향으로 이동시킵니다. 해당 좌표를 기록하십시오. 주입 부위에서 이전과 동일하게 두개골의 높이를 측정하고, 이 높이가 브레그마의 높이와 0.3mm 이상 차이 나지 않는지 확인하십시오.

그런 다음 두개골에 2 mm 구멍을 조심스럽게 뚫습니다. 구멍을 뚫은 후, 경막의 높이를 측정하여 등-배측 좌표를 적용할 기준점을 결정합니다. 26 gauge 바늘을 사용하여 경막을 관통합니다.

멸균 티슈로 혈액을 흡수하고, 모든 출혈이 멈춘 후에만 다음 단계를 진행하십시오. 이제 미리 충전된 미세주입용 주사기의 바늘을 뇌의 배측-복측 좌표까지 천천히 내립니다. 그리고 1분 동안 대기하십시오.

그 다음 0.25 µL/min의 속도로 AAV 3 µL를 주입합니다. 주입 후에는 바늘 경로를 통한 역류를 방지하기 위해 바늘을 5분 동안 그대로 둔 후 천천히 제거합니다. 3.0 코팅 땋은 폴리에스테르(coded braided polyester 3.0)로 두피를 봉합하고, 1% 요오드와 70% isopropyl로 피부를 소독합니다.

코와 입 바(bar)를 풀고, 이어서 두 개의 귀 바를 풀어 동물을 정위 고정 기구에서 조심스럽게 제거합니다. 이때 진통제를 투여하고, 필요에 따라 마취 역전제를 투여합니다. 그 다음 쥐를 38 °C로 설정된 가열판 위의 깨끗한 케이지에 넣고, 깨어날 때까지 면밀히 관찰합니다.

수술 후, 행동 테스트와 PET 영상 촬영을 통해 살아있는 동물 전체에서 신경 퇴행의 역학을 연구할 수 있으며, 희생 후에는 면역조직화학적 기법을 통해 연구할 수 있습니다. 자발적인 앞다리 사용 능력을 평가하기 위한 실린더 테스트는 흑질(substantia nigra)에 A53T 변이 alpha synuclein을 발현하는 재조합 AAV를 미세 주입한 후 다양한 시점에서 수행되었습니다. 주입 3주 후부터 중간 용량을 투여받은 쥐에서 유의미한 운동 장애가 관찰되었습니다.

주사 후 4주가 되었을 때, 반대측 전발의 자발적 사용이 50% 감소한 것이 관찰되었습니다. 반면, 대조군인 eGFP 주입 동물에서는 전발 사용의 비대칭성이 나타나지 않았습니다. 재조합 AAV 2/7A53T alpha synuclein을 고용량으로 투여받은 쥐는 주사 후 29일째에 전발 사용 능력이 더 현저하게 저하된 모습을 보였습니다.

관찰된 운동 장애가 도파민 의존적임을 증명하기 위해, L-doba를 단회 투여하였습니다. L-dopa 처리 45분 후 실린더 테스트를 반복했을 때, 재조합 AAV 2/7A53T alpha synuclein을 주입한 동물에서 앞발 사용 능력이 완전히 회복된 것이 관찰되었습니다. 개별 동물에서 시간에 따른 흑질-선조체 도파민성 신경 퇴행의 역학을 비침습적으로 추적하기 위해, F-18FECT를 방사성 리간드로 사용하는 소동물 양전자 방출 단층촬영을 통해 도파민 운반체 결합 정도를 정량화하였습니다.

재조합 AAV 2/7A53T alpha synuclein을 주입한 쥐의 동측 미상핵에서 시간이 경과함에 따라 DAT 결합이 유의하게 감소했습니다. 32일 후, DAT 결합이 최대 85%까지 감소하는 것이 관찰되었습니다. 양성 대조군으로서, SN에 신경독소 6 OHDA를 주입한 결과 7일 이내에 DAT 결합의 90% 손실이 유도되었습니다.

재조합 AAV 2/7A53T alpha synuclein을 미세 주입한 쥐의 뇌 절편을 시간에 따라 도파민성 뉴런의 마커인 tyrosine hydroxylase로 면역 염색하였습니다. 이 그림은 미세 주입 후 29일 동안 도파민성 뉴런이 점진적으로 소실되는 과정을 보여줍니다. 이 기술을 숙달하면 45분 이내에 완료할 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때는 고품질의 최종 벡터 매치를 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 신경퇴행 및 신경병리학적 수준을 결정하기 위해 비침습적 PET 영상 촬영, 행동 분석 및 면역조직화학 분석과 같은 다른 기술을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 파킨슨병의 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 개발하기 위해 흑질에 바이러스 벡터를 주입하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.

바이러스 벡터를 다루는 작업은 위험할 수 있으므로, 본 절차를 수행할 때는 항상 층류 작업대(laminar flow) 내에서 작업하고 적절한 폐기물 멸균 처리와 같은 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.