Name: CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 배우세요 마우스 척수에서 CLARITY/CUBIC 기술을 이용한 세로토닉 섬유의 3D 이미징 방법을. 이 기술은 전통적인 조직학으로 관찰할 수 없는 신경섬유 분포를 원위치에서 관찰하여 중추신경계 조직 구조와 통각 기전 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 호주 연구 위원회 통합 뇌 기능을 위한 우수 센터(ARC Centre Grant CE140100007), NHMRC 프로젝트 보조금(#1086643)의 지원을 받았습니다. George Paxinos 교수는 NHMRC 보조금(#1043626)의 지원을 받고 있습니다.

윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 모든 절차 (승인 ACEC 번호 14 / 94A입니다) 뉴 사우스 웨일즈 대학의 동물 관리 및 윤리위원회 (ACEC)의 지침을 따르십시오. 투명 마우스 척수 1. 준비 <ol><li> 아이스 콜드 하이드로 겔 용액의 조제 <ol><li> 16 % 파라 포름 알데히드 용액의 조제 (PFA) <ol><li> 70 ml의 미리 예열 증류수 (50-55 °에 C)에 16g 파라 포름 알데히드 분말을 추가하고 파라 포름 알데히드가 용해 될 때까지 가열 자석 교반기에서 교반한다. 참고 :이 솔루션은 이상 55 ° C 열 및 파라 포름 알데히드는 독성이 알고 있어야하는 것을 허용하지 않습니다. </li><li> 실린더에 파라 포름 알데히드 용액을 전송하고 100 ㎖에 증류수를 추가합니다. 4 ℃의 냉장고를 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 냉각. </li></ol></li><li> 증류수 26.25 mL에 125 mg의 VA-044 개시제를 용해 4 용액을 냉각C의 냉장고 °. </li><li> 차가운 5 ㎖ 아크릴 아미드 수용액 (40 %) 1.25 mL의 비스 용액 (2 %) (주의 : 비스 아크릴 아미드 솔루션은 유전 적 결함이나 암을 유발할 수 있고, 독성), 5 ㎖의 10 배 PBS, 12.5 ml의 16 % PFA 용액 및 얼음 VA-044의 개시제 용액. </li><li> 얼음 위의 솔루션을 섞는다. 주 : 전량을 50 ㎖이다. </li></ol></li><li> 마우스 척수의 관류 및 컬렉션 <ol><li> 0.9 % 생리 식염수에 희석 케타민 (80 ㎎ / ㎏) 및 xyzaline (5 ㎎ / ㎏)의 복강 내 주사로 마우스를 마취. 마우스의 투여 량은 생쥐의 경우보다 더 낮을 수있다. </li><li> 마우스가 다리의 피부에 핀치에 응답하지 않습니다 일단 흄 후드에 적합한 플라스틱 표면에, (접착 테이프가 효과가있다) 떨어져 몸에서 마우스의 사지를 고정합니다. </li><li> 가슴 위에 마우스 피부를 잘라 후 뼈 가슴은 가위로 가슴을 노출. </li><li> 25 G 바늘 토륨에 부착하여, 연동 펌프를 사용하여튜브의 E 단부는 심장의 좌심실로 니들을 삽입 약 10 ㎖ / 분의 속도를 피 종료점을 만든 다음 40 ml의 0.9 % 생리 식염수로 세정을 시작 우심방 자르지. </li><li> 완료되면, 35 ml의 차가운 얼음 하이드로 겔 용액으로 마우스를 관류. 참고 : 10 ML의 속도로 관류 / 분 신경 조직의 부종을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 블레이드와 뒷면에 피부를 절개하고 척추 옆 근육을 제거합니다. 일측에 척추 아치를 절단하고, 다른 쪽에게 튀기는 후 미세 시저와 척주에서 척수를 취할. </li></ol></li><li> 마우스 척수 지우기 <ol><li> 밤새 4 ℃에서 하이드로 겔 용액을 15 ml의에서 척수를 놓습니다. </li><li> 겔 용액 10 ㎖를 제거하고 5 ㎖ 튜브에 척수 세그먼트 용액의 나머지를 붓는다. 그것이 완전히 찰 때까지 겔 용액 5 ㎖ 튜브를 채우기. </li><li> 5 ㎖ 튜브의 맨 위에 파라 필름의 작은 조각을 스트레칭 후 튜브 목 파라 필름 랩. 참고 : 파라 필름 접촉을 하이드로 겔 솔루션을 확인하고 하이드로 겔 용액과 파라 필름 사이에 거품이 없습니다. </li><li> 37 년 5 ML 튜브를 넣어 &#160; ° C 오븐에서 밤새. 이 겔하게까지 하이드로 겔 솔루션을 관찰한다. </li><li> 오븐에서 5 ML 튜브를 타고 (예 : 삽 1 ML의 피펫 팁 등) 스패너와 튜브에서 젤을 제거합니다. 겔에 거친 조직을 고집하여 척수 조직에서 젤을 제거하고 (겔 조직에 충실하고, 따라서 조직에 의해 제거됩니다) 떨어진 거친 조직을. </li><li> 척수 조직으로부터 겔을 제거 후, ​​쉐이커상에서 24 시간 동안 1X PBS (PH 7.4)와 척수 4 회 반복한다. </li><li> 3.85 g의 우레아 및 385 g의 N, N, N &#39;, N&#39;- 테트라 키스 (2- 히드 록시 프로필) ethylenediam 용해 CUBIC 클리어 용액을 준비5.38 용액에 오프라인은 증류수. 주 : 뜨거운 교반기가 사용됩니다. 분명히하고 실온까지 냉각 후, 용액에 2.31 g의 폴리에틸렌 글리콜 모노 메틸 -p- isooctylphenyl 에테르 / 트리톤 X-100을 추가한다. 참고 :이 세 가지 화학 물질 10 g을 하나의 마우스입니다. </li><li> 면도날 2-3 mm 길이 세그먼트로 coronally 마우스 척수를 잘라 위의 CUBIC 청소 용액 5 ㎖로했습니다. 37 ℃ 오븐에서 진탕 놓고 &#160; 3 일간 C를 °. </li><li> 3 일 후 새로운 하나에 청소 솔루션을 변경합니다. 주 : 상기 용액은 사용 전에 제조한다. </li><li> 2 ~ 3 일 후에 CUBIC 청소 솔루션을 새로 고침 후, 글꼴 8 문자 용지에 조직의 투명성을 확인합니다. 이 투명한 경우, 글자 삭제 조직을 통해 알 수있다. (0.1 % 트리톤-X100)는 조직 4 회 (6 시간마다)을 씻어 청소 용액을 제거하고 PBST의 4를 가하여. </li></ol></li></ol><ol><li> 37 ° C 오븐에서 진탕 기에서 3 일 : 차 항체 용액에서 척수 세그먼트를 품어 (PBST 100 항 세로토닌은 토끼에서 제기, 1 희석). </li><li> 항체 용액을 제거하고 4 PBST를 가하여 (0.1 % 트리톤 X100)는 37 ° C의 오븐에서 척수 세그먼트 4 회 (매 6 시간)을 씻어. </li><li> 37 ° C 오븐에서 진탕 기에서 3 일간 조직을 배양 : PBST 용액을 제거하고 이차 항체 솔루션을 추가 (PBST 100 594 복합 염소 항 - 토끼 IgG의를 1 희석). </li><li> 이차 항체 용액을 제거하고 37 ° C 오븐에서 통에 하루 척수 세그먼트 4 번 씻어 (6 시간마다) PBST 4를 가하여. 다음날 조직 이미징을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 3. 이미지 <ol><li> PBST 용액을 제거하고, 심지어 조직의 굴절률을 85 % 글리세롤 (4)를 가하여. </li><l난&gt; 조직의 선명도를 확인합니다. 그것은 약 1 시간 분명되면 멀티 포토 형광 현미경 유지 프레임 맞는 크고 얇은 유리 슬라이드 상 조직을 넣어. </li><li> 척수 조직 옆에 85 % 글리세롤을 몇 방울을 넣어 22 X 50mm 유리 커버 슬립이 그것을 커버 슬립. 참고 : 척수의 방향은 이미지가 어떻게 보이는지를 결정한다. </li><li> 다중 광자 형광 현미경의 유지 프레임에 유리 슬라이드를 넣고 빛 경로로 조직을 이동합니다. </li><li> 헬륨 네온 레이저 라인 594 nm의 선택 및 라이브 화상에 양 신호의 밝기를 검사하여 최적의 레벨로 레이저의 세기를 조절한다. </li><li> (물, NA 0.7) 20X 대물 렌즈를 이용하여 척수 조직의 스캔 영역을 선택하고, Z 스택을 만들 준비하고,이 3 μm로 설정된 각 단계의 깊이. </li><li> 20X 미만의 objec Z 스택의 상단부터 하단까지의 조직을 검사적인하고 (오일 중, NA 1.4)를 63X 대물 각각 (스텝 크기는 1 ㎛였다). 3D 소프트웨어 (28)를 이용하여 3 차원 영상을 재구성한다. </li></ol>

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이 프로토콜은 결합 된 선명도와 CUBIC 기술로 마우스 척수의 이미지 세로토닌 섬유하는 방법을 보여줍니다 설명했다. 이 청 등. 14 토 메르 외. (15)에 의해 개발 된 수동적 지우기 프로토콜에 비해 빨리 소거 과정을 소개하고 척수 조직이 아니라 클리어시 하이드로 겔에 의해 지원 될 수있다. 청 등. (14)와 토 메르 등. (15)에 의해보고 된 마우스 척수의 고정시 중요한 단계는 모든 솔루션은 화학 물질의 중합을 방지 얼음에 냉각 유지하는 것입니다. 다른 중요한 단계는 신경 조직의 팽창을 방지하기 위해 하이드로 겔 용액으로 천천히 마우스 관류한다. 겔 용액을 겔화하기 위해서는 탈이 요구된다. 이에 대한 대안으로, 우리는 HYD 사이에 공기 방울이 튜브의 상단을 덮도록 파라 필름을 사용하지 않고 남겨rogel 솔루션 및 파라 필...

척추 돌기는 통증 인식과 같은 다양한 행동의 조절을 담당합니다. 통각(유해) 정보를 전달하는 돌기 중 하나는 후뇌 랩(hindbrain raphe)과 인접한 망상핵(reticular nuclei)1,2에서 유래한 세로토닌 섬유(serotoninergic fibers)를 포함하고 있습니다. 생리학적 및 약리학적 연구는 후뇌의 강간핵에 대한 전기 자극 후 척수의 등쪽 뿔에서 세로토닌 방출이 증가한다는 것을 입증했습니다3-5. 쥐와 주머니쥐에서 세로토닌성 랩척수 섬유는 등쪽 뿔6-8뿐만 아니라 중간 영역7,9,10, 복부 뿔7,11, 심지어 얇은 판 1012,13에도 조밀한 말단을 가지고 있습니다. 마우스에 대한 유사한 연구는 없습니다. 본 연구는 최근 발표된 CLARITY14 방법과 그 변형인 CUBIC15를 사용하여 쥐의 척수에서 후뇌 강피 핵과 인접한 망상 핵에서 발생하는 세로토닌 섬유의 종결 패턴을 매핑하는 것을 목표로 했습니다. 
척수의 기존 형광 또는 과산화효소 면역조직화학은 30-40μm 두께의 단면에서 척수의 회백질에서 세로토닌 섬유의 분포를 명확하게 보여줍니다. 그러나 이 접근법은 백질에서 세로토닌 섬유관(serotonergic fiber tract)의 연속성과 회백질에서 그 담보(collateral)의 연속성을 보여주지 않습니다. 조직학적 단면의 3D 재구성이 섬유관에 대한 우리의 지식을 발전시켰지만, 절단으로 인한 조직의 작은 왜곡으로 인해 조직학자와 해부학자들이 단일 관을 따라가는 것은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다. 이러한 장애를 피하기 위해 많은 연구자들이 전체 조직 구조를 투명하게 만들고 변경되지 않은 조직의 이미지를 단일 비디오 파일17-21에서 수집하기 위한 다양한 프로토콜을 개발했습니다. 지금까지는 Deisseroth의 그룹14,15에 의해 개발된 투명, 지질 교환, 아크릴아미드 혼성화, 경질, 이미징/면역염색 호환, 조직 하이드로겔(CLARITY) 기술과 Susaki etal 16에 의해 개발된 CUBIC이 가장 성공적이다. 프로토콜이 발표된 이후 많은 연구자들은 이러한 기술을 사용하여 뇌22-25뿐만 아니라 심장, 신장, 장 및 폐26,27를 포함한 생물학적 조직의 다양한 측면을 조사하기 시작했습니다. 
하이드로겔 용액(CLARITY)으로 마우스 척수를 고정하고 CUBIC 시약으로 투명화함으로써(원래 CLARITY 프로토콜14,15에 설명된 것보다 훨씬 빠른 방법) 2-3mm 길이의 척수 조직 블록을 2주 이내에 제거하고 세로토닌에 대한 면역형광 염색을 8일 만에 완료했습니다. 화학 작용제의 조합만으로 기존의 면역조직화학을 사용하여 약 1개월 만에 3D 비디오 파일의 개별 섬유 관의 이미지를 생성할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>광개시제 VA044</td><td>Wako</td><td>va-044/225-02111</td><td>http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm</td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드 용액</td><td>Bio Rad</td><td>161-0140</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0140-40-acrylamide-solution</td></tr><tr><td>2% Bis 용액</td><td>Bio Rad</td><td>161-0142</td><td>http://www.bio-rad.com/en-au/sku/161-0142-2-bis-solution?parentCategoryGUID=5e7a4f31- 879c-4d63-ba0b-82556a0ccf1d</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마</td><td>158127</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/158127?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>요소</td><td>머크 밀리포어</td><td>66612</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Urea---CAS-57-13-6---Calbiochem,EMD_BIO-66612</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민</td><td>머크 밀리포어</td><td>821940</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Ethylenediamine-N,N,N',N'-테트라-2-프로판올,MDA_CHEM-821940</td></tr><tr><td>트리톤-X 100</td><td>머크 밀리포어</td><td>648462</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/TRITON&reg;-X-100-Detergent---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648462</td></tr><tr><td>자당</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s0389?lang=en&region=AU</td></tr><tr><td>세로토닌 항체</td><td>Merck Millipore</td><td>AB938</td><td>http://www.merckmillipore.com/AU/en/product/Anti-Serotonin-Antibody,MM_NF-AB938</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG (H+L) 보조 항체, Alexa Fluor&reg; 594 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>&nbsp; A-11012</td><td>https://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/antibody/Rabbit-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012</td></tr><tr><td>다광자 현미경</td><td>Leica</td><td>Leica TCS SP5 MP STED</td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/details/product/leica-tcs-sp5-mp/</td></tr></tbody></table>

clarity를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / cubic 기술

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

척수 긴 하강 섬유 운동 통증 지각, 및 다른 동작을 위해 필수적이다. 이러한 섬유 시스템의 대부분의 척수 광섬유 종단 패턴 철저 종 조사되지 않았다. 척수 돌출 세로토닌 섬유, 조직 학적 섹션에 쥐 주머니쥐 연구되었으며 기능적 의미는 척수에서의 광섬유 종단 패턴에 기초하여 도출되었다. 명확성과 CUBIC 기술 개발과 함께,이 광 시스템 및 세로토닌 척 주상 경로의 알려지지 않은 특징을 밝힐 가능성 척수에서의 분포를 조사하는 것이 가능하다. 여기서는 결합 선명도 CUBIC 기술을 사용하여 마우스 척수 세로토닌 섬유 영상화 상세한 프로토콜을 제공한다. 방법은 COMBIN와 조직 겔 용액 설명과 마우스의 관류를 포함시약을 삭제의 ATION. 척수 조직 바로 아래 2 주 클리어하고, 세로토닌에 대한 후속 면역 염색 미만 십일 년에 완성되었다. 다중 광자 형광 현미경으로 조직을 검사하고, 3D 이미지 Osirix 소프트웨어를 사용하여 재구성 하였다.

이 섹션은 명확성과 CUBIC 프로토콜의 조합을 사용하여 투명 마우스 척수 세로토닌 항체 염색의 결과를 나타낸다. 우리는 (또한 비디오 (1) 그림 1 참조) 세로토닌 섬유는 복부 뿔의 복부 부분에서 우위와 척수의 모든 라미에 존재하는 것으로 나타났다. 제어 조직은 긍정적 인 섬유 (결과가 표시되지 않은)하지 않았다. 복부 호른에서 조밀 세로토닌 섬유 복부 혼 ventromedial 부분에 존재하고 이들이 복부 혼 측방으로 연장 (도 2,도 비디오 2 참조). 일부 면역 양성 섬유는 또한 후각 또는 중앙 운하쪽으로 복부 혼에서 확장 할 수 있습니다. 면역 양성 섬유 후각 모든 엽층에 존재하지만, 양의 섬유 사이의 작은 갭은, 특히 횡 방향으로 라미 나 (2, 4)에 존재후각의 일부. 후각에서 세로토닌 섬유의 대부분은 작은 직경이고 그 중 소수는 큰 ...

척추 상상돌기는 통증 인식 및 기타 행동에 중요하며, 세로토닌 섬유는 이러한 섬유 시스템 중 하나입니다. 본 연구는 이러한 세로토닌 섬유의 종결을 조사하기 위해 결합된 CLARITY/CUBIC 프로토콜을 마우스 척수에 적용하는 데 중점을 두었습니다.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

본 CLARITY/CUBIC 실험의 전반적인 목표는 전통적인 조직학적 방법으로는 관찰할 수 없는 생쥐 척수 내 세로토닌성 섬유의 3D 특성을 밝히는 것입니다. 이 방법은 세로토닌성 섬유가 척수 전체에 어떻게 분포되어 있는가와 같은 신경해부학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세로토닌성 섬유를 제자리(in situ)에서 관찰할 수 있게 하며, 전통적인 조직학으로는 관찰할 수 없는 벡터들의 식별이 가능하다는 점입니다.이 방법은 중추신경계의 조직에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 심혈관계와 같은 다른 계통에도 적용될 수 있습니다. 연구진은 마우스 척수의 세로토닌성 섬유를 분석하기 위해 기존의 추적법을 사용하던 중 한계에 부딪혔을 때 처음으로 이 방법을 사용하고자 했습니다. 먼저, 흄 후드 내의 플라스틱 해부대 위에 마취된 마우스의 사지를 고정하는 것으로 시작하십시오.발가락 꼬집기에 반응이 없는 것을 확인하고 가위로 가슴 피부를 절개합니다. 다음으로 가슴을 열어 심장을 노출시키고, 연동 펌프 튜브가 연결된 25 gauge 바늘을 좌심실에 삽입합니다. 혈액이 배출될 수 있도록 우심방을 절개합니다.그 다음, 약 10 mL/min의 속도로 9% 식염수 40 mL를 사용하여 심장을 세척합니다. 혈액이 모두 씻겨 나가면, 동일한 관류 속도로 갓 제조하여 얼음처럼 차갑게 유지한 하이드로겔 35 mL를 동물에게 관류합니다. 그런 다음, 마우스 등의 피부를 절개하고 척추 옆의 근육을 박리합니다.한쪽의 척추궁을 절개하여 반대편으로 젖힌 후, 미세 가위를 사용하여 척수줄기를 척주에서 적출합니다. 적출 직후, 척수를 새로 제조한 하이드로젤 용액 15 milliliters에 넣고 4 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 다음 날, 하이드로젤 10 milliliters를 제거하고 남은 용액과 척수를 5 milliliter 튜브에 붓습니다.튜브가 가득 찰 때까지 신선한 하이드로젤 용액을 추가한 다음, 파라필름 조각을 튜브 상단에 팽팽하게 씌웁니다. 이때 파라필름이 하이드로젤에 밀착되도록 하고, 용액과 필름 사이에 기포가 생기지 않도록 주의하십시오. 튜브에서 공기를 제거하는 것이 가장 어려운 단계입니다. 기포가 생기지 않도록 하이드로젤 용액을 천천히 채운 다음, 젤을 쏟지 않도록 주의하며 파라필름을 튜브 상단에 조심스럽게 덮으십시오.이제 파라필름 조각을 튜브 목 부분에 한 번 더 감고, 척수를 37 °C 오븐에서 하룻밤 동안 배양합니다. 하이드로젤 용액이 젤 상태가 되면, 스패너를 사용하여 튜브에서 젤과 신경 조직을 꺼냅니다. 척수에서 하이드로젤을 제거하려면, 거친 조직지를 젤에 짧게 누릅니다.젤은 조직을 제거할 때 함께 떨어져 나옵니다. 척수가 깨끗해지면, 셰이커 위에서 PBS로 4~6시간 동안 세척합니다. 24시간 후, 면도날을 사용하여 척수를 2~3 mm 길이의 관상면 세그먼트로 자르고, 조직 조각들을 새로 조제한 5 mL의 CUBIC 투명화 용액으로 옮깁니다.37 °C 오븐에서 시편을 72시간 동안 흔들어 준 다음, 3일 된 투명화 용액을 새로 조제한 투명화 용액으로 교체합니다. 2~3일 후, 폰트 크기 8pt의 글자가 적힌 종이를 통해 조직의 투명도를 확인합니다. 투명해진 조직을 통해 글자가 보이면, CUBIC 투명화 용액을 4 mL의 신선한 PBST로 교체하여 6시간씩 4회 세척합니다.형광 이미징을 위해 척수 분절을 염색하려면, 조직을 적절한 1차 항체 용액에 넣고 37 °C 오븐 내 쉐이커에서 3일 동안 배양합니다. 1차 항체 염색이 끝나면, 조직을 4 mL의 PBST에 담가 37 °C 오븐에서 6시간씩 4회 세척합니다. 그런 다음, PBST를 적절한 2차 항체 용액으로 교체하고 37 °C 오븐 내 쉐이커에서 3일 더 배양합니다.넷째 날에는 방금 시연한 것과 같이 PBST로 결합되지 않은 2차 항체를 씻어냅니다. 절편을 이미지화하려면, 마지막 PBST 세척 단계를 85% glycerol 4 mL로 대체하여 조직의 굴절률을 균일하게 맞춥니다. 약 1시간 후, 조직의 투명도를 확인합니다.조직이 투명해지면, 척수 분절을 크고 얇은 유리 슬라이드로 옮깁니다. 다음으로, 척수 조직 옆에 85% glycerol을 몇 방울 떨어뜨리고 22 by 50 millimeter 유리 커버 슬립으로 조직을 덮습니다. 슬라이드를 현미경의 고정 프레임에 놓고 조직을 광로로 이동시킵니다.그런 다음, Helium Neon 레이저를 선택하고 라이브 이미지에서 양성 신호의 밝기를 확인하여 레이저 강도를 조절합니다. 레이저 강도를 최적 상태로 설정한 후, 20x 대물렌즈를 사용하여 척수 조직의 스캔 영역을 선택합니다. 이어서, 각 스택의 깊이를 3 µm로 설정하여 z-stack을 생성하도록 기기를 설정합니다.마지막으로, 먼저 20x 대물렌즈에서, 이어서 63x 대물렌즈에서 z-stack의 상단부터 하단까지 조직을 스캔합니다. 이후 3D 소프트웨어를 사용하여 적절한 3D 영상을 재구성할 수 있습니다. 여기에서 척수 모든 층에 걸쳐 세로토닌성 섬유가 존재하며, 특히 전각의 복측 부분에 집중되어 있음을 관찰할 수 있습니다.복측각의 복측 내측 영역에는 세로토닌성 섬유들이 밀집되어 있으며, 이는 복측각의 외측 부분으로 뻗어 있고, 일부 면역양성 섬유들은 복측각에서 배측각 또는 중심관 쪽으로 연장되어 있습니다. 면역양성 섬유들은 배측각의 모든 층판에 존재하지만, 특히 배측각의 외측 부분에서 2층과 4층의 양성 섬유들 사이에 작은 간격이 관찰됩니다. 수평 절편에서는 척수의 종축을 따라 복측각에 밀집된 세로토닌성 섬유들이 섬유 다발에 수직인 축을 따라 규칙적으로 분지를 내는 것을 관찰할 수 있습니다.이 가지들은 복측각의 외측 부분을 향해 경로를 따라 더 세분화됩니다. 이러한 가지들과 비교했을 때, 정중선을 향해 뻗어 있는 가지들은 더 불규칙하고 크기가 작습니다. 63배 대물렌즈 하에서 관찰하면, 배측각의 세로토닌성 섬유들은 척수의 축을 따라 이동하며, 얇은 섬유들 사이에 산발적으로 분포된 굵은 섬유들과 함께 신경로의 경로를 따라 다양한 지점에서 종말되는 것이 관찰됩니다.이 기술을 숙달하면 적절하게 수행했을 때 3주 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차 이후에는 choline acetyltransferase 항체를 이용한 이중 표지법과 같은 다른 방법을 사용하여, 세로토닌성 섬유가 운동 뉴런에서 끝나는지에 대한 추가적인 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술의 개발 이후, 생의학 영상 분야의 연구자들은 동물 표본이나 인간 조직 내의 다양한 세포 유형 간의 복잡한 공간적 관계를 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 영상을 시청하신 후에는 면역형광 염색 후 3D 이미징을 위해 마우스 척수 조직을 투명화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

imaging-serotonergic-fibers-mouse-spinal-cord-using-claritycubic

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

마우스 척추를 안정화하고 반복 수행하는 법으로서...

두 광자 현미경을 사용하여 마우스 척수의 생체내 이미징에

출처: Pekarek, B. T., et. al., CLARITY 조직 투명화를 통한 온전한 신경 수상돌기의 이미징 및 정량화. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오에서는 컨포칼 현미경 및 3D 재구성 기술을 사용하여 수지상 가지, 척추 형태 및 신경 분포를 조사하기 위해 제거된 마우스 뇌의 준비, 이미징 및 분석을 보여줍니다.

Confocal Microscopy Imaging of intact dendritic arbors and spine morphology in a cleared mouse brain(투명화된 쥐 뇌에서 온전한 수지상 가지와 척추 형태에 대한 컨포칼 현미경 이미징)

큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

이 비디오에서는, 우리는 라이브 마우스의 등쪽 척수를 통해 만성 광학 영상 실을 주입하는 절차에 대해 설명합니다. 실, 수술, 만성 이미징 검토하고 증명한다.

종의 척추 상공 회의소를 주입하는 절차 생체 마우스 척수의 영상

마우스 척수 이미징을위한 새로운 생체 준비. 이 프로토콜은 척수 걸쳐 라이브 세포 상호 작용의 두 광자 이미징을 허용한다.

마우스 척수의 세포 역학의 두 광자 이미징

광학 투명화 기술은 조직을 시각화하는 방식에 혁명을 일으키고 있습니다. 이 보고서에서는 보다 일관되고 저렴한 결과를 제공하는 원래의 CLARITY(Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel) 프로토콜의 수정 사항에 대해 설명합니다.

수동 CLARITY를 사용하여 마우스 중추 신경계의 광학 지우기

여기서 우리는 표준 면역 조직 화학 염색 및 망막 뉴런및 그 하위 세포 구조의 고해상도 화상 진찰의 질을 향상시키기 위하여 전산 망막에 대한 뇌 조직의 CLARITY 방법을 적응하는 프로토콜을 제시합니다.

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

신경 수지상 형태는 종종 기능의 근간을 이수합니다. 실제로, 뉴런의 발달에 영향을 미치는 많은 질병 프로세스는 형태학적 표현형으로 나타납니다. 이 프로토콜은 그대로 수지상 식소및 연관된 척추를 분석하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

최소 침습 기술과 간단한 실험실 장치는 실험 동물에 대한 수술 손상을 줄이고 해부학적 형태 유지를 허용하여 척수 손상 모델의 재현성을 향상시킵니다. 이 방법은 신뢰할 수있는 결과와 재현 가능한 절차가 질병 배상 메커니즘의 조사를 용이하게하기 때문에 가치가 있습니다.

최소 침습 기술을 기반으로 한 마우스 타박상 척수 손상 모델 설정

배우세요 마우스 척수에서 CLARITY/CUBIC 기술을 이용한 세로토닉 섬유의 3D 이미징 방법을. 이 기술은 전통적인 조직학으로 관찰할 수 없는 신경섬유 분포를 원위치에서 관찰하여 중추신경계 조직 구조와 통각 기전 연구에 새로운 통찰을 제공합니다.

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

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