분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

이 절차의 전반적인 목표는 초기 뇌종양 미세환경에 침투한 말초 혈액 단핵 세포의 수를 특성화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 말초 면역 세포가 뇌종양 미세환경으로 이동하는 데 중요한 요인을 식별함으로써 뇌종양 면역학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 CNS에 진입한 백혈구의 수와 활성화 상태에 대한 시간 의존적 정량적 데이터를 산출한다는 것입니다.

마취된 마우스를 정위 프레임에 삽입한 후 메스 블레이드를 사용하여 전두골에서 후두골까지 두개골을 2cm 정도 정중선으로 절개합니다. 그런 다음 Collibra 견인기를 사용하여 절개 부위의 피부를 수축시킵니다. 그런 다음 33 게이지 바늘이 장착된 마이크로리터 주사기를 bma 바로 위로 내립니다.

종양 이식을 위한 대상 부위에 도달하도록 바늘의 위치를 조정합니다. 그런 다음 26게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 투베르쿨린 주사기를 사용하여 골막을 부드럽게 절제하여 이 위치를 표시합니다. 드릴링하는 동안 아래에 있는 경막에 도달할 때까지 0.8mm 드릴 비트로 대상 부위의 두개골에 구멍을 뚫습니다.

과도한 열과 힘을 피하기 위해 두개골 표면에서 드릴 비트를 빠르게 제거한 다음 간헐적인 압력을 가합니다. 다음으로, 바늘이 막히지 않도록 0.9ml 원추형 폴리프로필렌 마이크로 튜브에 1.7% 염화나트륨이 함유된 마이크로리터 주사기를 세척합니다. 종양 세포가 들어 있는 0.6ml 원뿔형 폴리프로필렌 마이크로 튜브를 여러 번 부드럽게 두드려 세포를 완전히 현탁시킵니다.

그런 다음 2마이크로리터의 세포를 마이크로리터 주사기로 끌어당기고 주사기에 기포가 유입되지 않도록 합니다. 70% 이소프로필 알코올 준비 패드에 1마이크로리터의 세포를 분배하여 주사기에 정확히 1마이크로리터의 종양 세포를 남깁니다. 그런 다음 경막에 닿을 때까지 바늘을 아래로 내립니다.

그런 다음 바늘을 뇌 속으로 3.5mm 내린 다음 바늘을 천천히 부드럽게 0.5mm 후퇴시킵니다. 1-2분 동안 주사기 플런저를 눌러 세포를 전달합니다. 심부 마취된 마우스에서 트랜스 카디알 관류를 수행합니다.

뭉툭한 바늘을 심장의 좌심실에 삽입한다. 작은 해부 가위를 사용하여 오른쪽 심방을 잘라 피를 흘리고, 간과 폐가 혈액 부족으로 완전히 희어질 때까지 몇 분 동안 티로 용액으로 마우스 순환계를 관류합니다. 총 양의 혈액이 우심방으로 계속 빠져나가지 않도록 합니다.

좌심실에서 20게이지 알루미늄 허브 무딘 바늘을 제거하기 전에. 바늘을 제거한 후 압출 폴리스티렌 폼 블록에서 마우스의 핀을 풀고 마우스의 복부 쪽을 아래로 돌립니다. 큰 해부 가위를 사용하여 머리를 몸의 나머지 부분과 분리하십시오.

그런 다음 두개골을 노출시키기 위해 후두골에서 주둥이까지 작동하는 작은 해부 가위를 사용하여 정중선의 두피를 자릅니다. 그런 다음 두개골 양쪽의 피부를 수축시키고 두개골을 단단히 잡습니다. 한 쌍의 뼈 URS를 사용하여 후두골에서 시작하여 두개골을 조심스럽게 뚫고 앞으로 나아가 뇌의 등쪽 및 측면 표면을 완전히 노출시킵니다.

두개골에 손상을 입히지 않고 쥐의 뇌를 채취하여 두개골을 채취하는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다. 이 기술에 대한 경험이 없는 사람들은 적절한 실험을 실행하기 전에 여러 번 시도하고 싶을 수 있습니다. 두개골 뼈가 제거되면 마우스의 복부 쪽을 위로 돌립니다.

두개골에서 뇌를 분리하기 위해 뇌 기저부의 뇌 신경을 잘라냅니다. 이 절차에서는 깨끗한 한쪽 면도날을 사용하여 뇌의 중심을 시상으로 잘라 종양이 있는 뇌 영역을 분리합니다. 두 반구를 절개하려면 동측 반구 내측을 아래로 돌려 소뇌에서 관상동맥 절개를 하고 후각구를 절개하여 종양 보형물을 포함하는 표적 조직을 분리합니다.

다음으로, 1ml의 DPBS가 들어 있는 라벨이 부착된 유리 다운 티슈 그라인더에 대상 조직을 넣습니다. 플런저를 끝까지 누르고 7번 비틀어 조직을 파괴합니다. 그런 다음 플런저를 들어 올려 액체가 티슈 그라인더 바닥으로 다시 가라앉을 수 있도록 합니다.

이 단계를 세 번 반복합니다. 그러나 다음 두 번 반복하는 동안 플런저를 네 번, 마지막 반복 동안 세 번만 비틀십시오. 뇌 조직을 과도하게 자극하지 않기 위해.

그런 다음 플런저 측면에 1밀리리터 부피의 얼음처럼 차가운 DPBS를 3개 바르고 잔여 뇌 물질을 조직 그라인더로 헹굽니다. 그런 다음 위아래로 피펫팅하여 TRID 뇌 물질을 현탁시키고 얼음 위에 표시된 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 다운 티슈 그라인더의 측면을 얼음처럼 차가운 DPBS 1ml로 추가로 헹구고 동일한 15ml 원심분리기 튜브에 추가합니다.

모든 샘플이 처리될 때까지 TRID 뇌 물질이 들어 있는 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 15ml 원심분리기 튜브에 있는 TRID 뇌 물질을 섭씨 4도에서 20분 동안 740배 G로 회전시킵니다. 다음으로, 상층액을 제거하고 펠릿화된 뇌 물질을 미리 준비된 콜라겐 분해 효소와 DNA 1 소화 효소의 혼합물 1ml에 다시 현탁시킵니다.

15ml 원심분리기 튜브를 시험관 랙에 넣고 랙을 37도 셀 CS 수조에 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 조직 분해를 용이하게 하기 위해 튜브를 튕겨 배양 기간 동안 샘플을 두 번 부드럽게 교반합니다. 그런 다음 각 튜브에 6ml의 바이콜드 DPBS를 첨가하여 소화 효소를 희석합니다.

이를 위아래로 파이프하여 멸균 70미크론 나일론 메쉬 필터를 통해 총 부피를 얼음 위의 새로 표시된 15밀리리터 원심분리기 튜브에 다시 부유시키고 필터링합니다. 그 후, 뇌 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 20분 동안 740배 G로 회전시켜 단일 세포 펠릿을 얻습니다. 원심분리기에서 15ml 튜브를 제거하고 얼음 위에 놓습니다.

그런 다음 다음 단계를 준비하기 위해 원심분리기의 온도 설정을 약 섭씨 21도로 높입니다. 다음으로, Cell snat을 완전히 제거하고 P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 1ml의 70% 밀도 원심분리 배지에 세포 펠릿을 초기에 재현탁합니다. 그런 다음 각 튜브에 70% 밀도 원심분리 매체 4밀리리터를 추가로 추가합니다.

캡을 단단히 씌우고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포 현탁액을 균질화한 다음 70% 밀도로 재현탁하는 뇌 세포가 포함된 15ml 원심분리기 튜브를 옮깁니다. 얼음에서 시험관 랙으로 원심분리 매체를 한 번에 하나씩 실온에서 추출합니다. 2밀리리터의 37% 밀도 원심분리 매체 용액을 5밀리리터의 70% 밀도 원심분리 매체에 조심스럽게 오버레이하여 두 밀도 원심분리 매체 층 사이에 깨끗한 계면을 형성합니다.

그런 다음 두 레이어 사이의 계면 위치를 미세한 팁 마커로 표시하여 원심분리 후 구분이 명확하지 않을 때 쉽게 식별할 수 있도록 합니다. 15ml 원심분리기 튜브를 740배 G로 실온에서 20분 동안 쉬지 않고 회전시킵니다. 나중에 밀도 원심분리 매체 층 간의 계면이 중단되는 것을 방지하려면 P 200 마이크로 피펫을 튜브에 도입하여 두 밀도 원심분리 매체 층 사이의 계면에 축적된 pbmc를 수집합니다.

PBMC 밴드 수준에서 지질층을 한 번 조심스럽게 우회하고 70% 밀도 원심분리 매체 층의 표면에서 200마이크로리터를 천천히 추출하고 얼음 위에 각각 표시된 폴리프로필렌 팩스 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 반복하면 샘플당 총 400마이크로리터의 부피를 얻을 수 있습니다. 두 밀도 원심분리 매체 층 사이에 깨끗한 계면을 형성하는 실험자의 능력은 p BMC의 재현 가능한 분리에 매우 중요합니다.

37% 밀도의 원심분리 매체를 천천히 붓고 튜브를 벤치 상판에서 20-30도 각도로 기울여야 합니다. 이 그림은 5단계에서 보여준 GR 1개의 양성 CD 11 B 양성 골수성 세포와 NK 1.1에 배치된 일반적인 실험 게이트에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. 6단계에서 나타난 양성 자연살해세포(positive natural killer cell)는 각각 5단계 프라임(prime)과 6프라임(prime)에서 GZMB 발현을 기반으로 층화됩니다.

이 그림에서 FSCA와 비교하여 GR 1개의 양성 CD 11 B 양성 골수성 세포와 NK 1.1 양성 자연살해세포를 FSCA에 대조하여 비교하면 상대적으로 큰 크기의 골수성 집단에 비해 자연살해세포의 림프구 크기가 더 작다는 것을 보여주며, 따라서 이 두 pbmc 하위 집단의 정체를 추가로 확인할 수 있습니다. 여기의 데이터는 GL 26 sital one I 신경교종 세포가 syngen에 생착하는 것을 보여줍니다. XC 57 black six J 마우스 뇌는 GL 26 sit GAL one I 곡선을 따라 각 데이터 포인트와 관련하여 표시되는 CD 45 양성 PBMC 숫자의 동원을 빠르게 유도하며, 이는 대조군 위의 PBMC 침윤 종양의 접힘 유도를 나타냅니다.

GGL 26은 종양 이식 후 지정된 시간에 NT 종양 또는 HPI를 시연에 사용된 특정 항체 칵테일에 기초하여 GR 1개의 양성 CD 11 B 양성 골수성 세포 및 NK 1.1 양성 자연 살해 세포가 종양 생착 후 48시간 이내에 GAL 1개의 결핍 종양 미세환경에 특이적으로 진입하는 것으로 나타났습니다. 그러나 골수성 세포에 침투하는 신경교종의 총 수는 자연살해세포의 수보다 훨씬 많았다. 일단 숙달되면 방법론은 두뇌 수확에서 흐름에 이르기까지 요약됩니다.

세포 분석은 한 명의 실험자에 의해 약 6시간 내에 수행될 수 있습니다. pbmc 상보적 실험에 침투하는 신경교종의 총 수를 공정하게 비교하기 위해 각 PBMC 샘플의 전체 부피를 유세포분석기로 분석하는 것이 필수적입니다. 이러한 면역조직화학적 분석은 면역세포 침투에 대한 공간 데이터를 획득하고 이러한 절차를 사용하여 평가된 것과 일치하는 시점에서 전체 종양 크기 및 미세해부학을 측정할 수 있도록 하기 위해 수행될 수 있습니다.

이 기술은 전체 절차에 큰 변경 없이 혈장 DNA를 인코딩하는 종양유전자를 사용하여 새로 생성된 모델을 포함하여 다양한 뇌종양 모델의 연구에 적용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스의 뇌에 정위 및 이식을 위한 신경교종 세포 현탁액을 준비하는 방법, 풍부한 종양, 뇌를 가진 마우스를 transi하는 방법, 말초 혈액 단핵 세포에 침투하는 신경교종을 미터법으로 분리하고 유동시키는 방법, 신경교종을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.