Name: 분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: 배우세요 교종 침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석 방법을 통해 뇌종양 미세환경에서 면역 세포의 수와 활성화 상태를 시간 의존적으로 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 뇌종양 면역학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 신경 질환 및 뇌졸중 (NIH / NINDS) MGC에 R01-NS074387, R01-NS057711 및 R21-NS091555 부여의 / 국립 연구소 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다; NIH / NINDS는 PRL에 R01-NS061107, R01-NS076991, R01-NS082311 및 R21-NS084275을 부여; 레아의 행복한 마음에서 보조금, MGC 및 PRL에게 수여 미시간 종합 암 센터의 대학; 신경 외과, 의학 미시간 대학의 대학의 부; NIH 보조금 2UL1-TR000433 지원하는 임상에 대한 미시간 연구소 및 건강 연구,; NIH / NCI (국립 암 연구소) 부여 T32-CA009676에 의해 지원되는 미시간 대학 암 생물학 교육 보조금; NIH / NINDS 지원하는 임상과 기초 신경 과학 미시간 교육 대학은 T32-NS007222을 부여; 그리고 NIH / NIGMS (일반 의학 과학의 국립 연구소)에 의해 지원 미시간 의료 과학자 교육 프로그램의 대학은 T32-GM007863을 부여합니다. 저자박사 카린 Muraszko 및 신경 외과의 부서에서받은 교육 리더십과 지원에 감사 재; M. 달 그렌, D. Tomford,과 최상의 행정 지원에 대한 S. 나폴리탄에; 뛰어난 기술 지원 M. Dzaman에; 그리고 자이스 3D 스캐닝 전자 현미경의 구입을 향해 관대 한 지원을위한 필 F. 젠킨스에. 우리는 또한 뇌 단핵 세포의 분리를위한 밀도 원심 분리 미디어 매개 전략의 수정 된 버전이 그려진하는 하버드 의과 대학에서 Kuchroo 실험실을 인정합니다.

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 초기 마우스 뇌 종양 미세 환경에 침투 한 한 PBMC의 분리 및 유세포 분석을위한 견고하고 재생 가능한 방법을 설명한다. 신경 교종 세포 현탁액 정위 마우스 뇌의 선조체에 접목 된 실험자에 의해 지정된 농도로 생성된다. 마우스는 다음 실험 디자인에 의해 지정된 소정의 시점에서 안락사 그들의 뇌를 수거하고, 형광 접합 된 일차 항체의 조합으로되어 immunolabeled 교종 함침 한 PBMC를 분리하기 위해 처리된다; immunolabeled 세포를 유동 세포 계측법에 의해 정량화된다. 여기에 제시된 시위 초기 시점에 초점을 맞추고 있지만, 신경 교종-침투 PBMC를 마우스 사망 분석까지 어느 시점 이후 종양 생착 최대로 평가 될 수있다. 다른 항체 조합의 임의 개수이자 난의 면역 세포를 검사하는 데 사용될 수있는 방법으로는 뛰어난 모듈T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 대 식세포를 ncluding. 프로토콜이 여성 C57BL / 6J 마우스 시대의 8~10주에서 사용하도록 최적화되어 있습니다. 이 연령...

신경 교종은 중추 신경계 (CNS)에서 발생하는 변형 신경교 neuroepithelial 뇌암의 클래스이다. 모든 신경 교종의, 세계 보건기구 (WHO) 등급 IV 신경 교종, 또는 아교 모세포종 (GBM), 가장 일반적인 1 치명적이다. GBM은 테모 졸로 마이드 2 방사선 플러스 수반과 보조 화학 요법 다음에 가능한 범위에 종양 절제술로 구성되어 현재의 표준 진료에 매우 내화입니다. 이 치명적인 암 5 년 3 후에 질병을 생존 환자의 5 %와 초기 진단의 시간에서 생존의 15-18개월의 실력 예후를 수행한다. 혈액 뇌 장벽 (BBB)의 존재는, 전문적인 항원 제시 세포의 부족 (장갑차) 및 뇌 내에서 4 선의 림프 구조의 존재는 이전 미확인 특권 면역 GBM의 개념을 이끌어왔다. 그러나, 많은 연구가 지금 SHO이러한 뇌 암은 참으로 단핵구, 대 식세포 및 골수 유래 억제 세포 (MDSCs) (5)를 포함 기원에 주로 골수 있습니다 주변 면역 세포의 채용을 발생시킬 것을 승. GBM은 6,7 프로 종양 될 뇌 상주 미세 아교 세포의 활동에 영향을 미친다. 이러한 CD8 + T 세포 (8)과 CD56 + 자연 살해 세포 (9) 등의 림프 세포는 종양 미세 환경 내 존재하지만 훨씬 적은 숫자 생각 사실 (인해 종양 연관된 대 식세포에 신경 교종 - 유래 요인에 의해 유발 면역 기능 할 TAMS) 10. CD4 + T 세포는 GBM도 존재하지만이 인구의 대부분은 CD25 및 Foxp3를, 면역 T 규제 (T의 REG) 셀 (11)의 업체를 표현한다. GBM의 전반적인 면역 억제 상태는 면역 탈출 및 종양 진행 (12)의 증진에 절정. 13-19을 개발하기 위해 뇌 종양 immunosuppresson의 메커니즘을 극복하기 위해 노력하고있다. 이 작품의 절정은 이제 새로 진단 GBM (: NCT01811992 ClinicalTrials.gov 식별자) 환자 결합 된 세포 독성 및 면역 자극 치료를 평가하기위한 임상 시험을 주도하고있다. 가장 최근의 연구는 마우스 GL26 쥐 CNS -1- GBM 셀 β - 갈 락토 시드 - 결합 렉틴 ​​galectin-1 (GAL-1) ~ (20)의 대량 생산함으로써 항암 NK 세포의 면역 감시를 차단하는 것으로 나타났다. 이것은 shRNA를 매개 유전자 녹다운을 사용하여 신경 교종 세포의 GAL-1의 발현을 억제함으로써 입증되었다. 시험 관내 experimenTS는 GAL-1 결핍 신경 교종 세포 배양에 정상적으로 증식 것으로 나타났다, 아직 동계 C57BL / 6J 또는 RAG1에 두개 내 생착 후 곧 빠른 거절을 시행 - / - 마우스, 따라서 이러한 형태에 T- 또는 B- 세포의 독립성을 확립 종양 제거. 안티 아시 알로 GM 1 항혈청 또는 GAL-1 결핍 신경 교종 제거에서 NK 세포의 역할을 설정하는 두개 GAL-1 결핍 교종 성장의 완전한 회복되었다 모노클 NK1.1 항체와 NK 세포 immunodepletion. 우리는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 immunodepletion 표시하는 따라서 NK 매개 GAL의 돕는데 골수 세포를위한 필수 불가결 한 보조 역할을 드러내는, NK 세포의 존재에도 불구하고 GAL-1 결핍 신경 교종 제거를 방지하기에 충분한 -1 결핍 종양 용해 (게시되지 않은 데이터). 이는 예기치 않은 결과는 말초 혈 단핵 세포의 분리 및 분석 (한 PBMC)를위한 광범위한 프로토콜을 개발할 주도했음을우리는 더 나은 GAL-1 결핍 신경 교종 거부 조건부 면역 침투 이벤트를 특성화 할 수 있도록 즉시 두개 내 생착 후 뇌 종양 미세 환경에 침투. 방법은 GL26-CIT를 불리는 구조적 익스프레스 mCitrine 형광 단백질은, 형광 현미경 (21)에 의해 직접 종양 세포의 가시화를 허용 GL26 마우스의 신경 교종 세포를 사용하여 여기에 설명된다. 이 세포들은 정위 동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접목하고, 이전에 마우스 안락사에 24, 48, 또는 72 시간 동안 성장을 사용할 수 있습니다. 신경 교종-침투 PBMC를 다음 항 -CD45를 사용하여 격리 및 immunolabeled되어, -GR-1, -CD11b과 그랜 자임 B의 세포 내 immunolabeling와 함께 -NK1.1 세포 표면 항체 (GzmB). 항체의 이러한 특정 조합이 우리가 B가 종양 침윤 GR-1 + / + CD11b를 골수 세포의 식별 및 NK1.1 +, NK 세포, 세포 유형을 허용EEN는 GAL-1 결핍 종양 제거에 관여. GAL-1 결핍 GL26-CIT의 신경 교종의 면역 침투 프로파일, GL26-CIT의-gal1i 여기에 언급하고 비를 포함 GAL-1 GL26-CIT의-NT 호출의 정상 수준을 발현하는 신경 교종의 것과 비교된다 제어 shRNA를 머리핀을 대상으로. 프로토콜 동소 동계 C57BL / 6J 마우스의 선조체로 이들 세포를 접목하는 방법에 대한 설명이 뒤 따른다 시험 관내 배양 방법 GL26-CIT의 신경 교종 세포에 대한 설명으로 시작한다. 그러므로 분리 및 유세포 분석 교종 함침 된 PBMC의 immunolabeling 관련된 단계를 열거 진행한다. 표준 프로토콜은 데이터 분석 및 그래픽 표현의 설명으로 종결. 데모는 밝혀 그 모두 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포와 NK1.1 + NK 세포 우선적으로 48 내 여자-1 결핍 뇌 종양 미세 환경 내에서 축적종양 주입,이 종양이 빠른 속도로 완전한 종양 용해 약 일주 후 종양 생착 (20)를 받아야하는 이유를 설명하는 데 도움이되는 결과의 시간. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 다양한 실험 디자인에 용이하게 적응할 수있다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출로부터 프로토콜을 수행 할 수있다. 방법은 또한 특히 종양 미세 환경에 의해 유도 된 면역 표현형을 식별하도록 뇌 침투 것들과의 비교를 위해 종양 함유 마우스에서 PBMC를 순환 프로파일을 특성화하기 위해 실험 목적과 결합 될 수있다. 이것과 유사한 방법을 적용 뇌 종양 미세 환경 내로 말초 면역 세포의 거래에 관련된 요인의 더 나은 이해를 용이하게한다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' Eagles Medium</td><td>Gibco</td><td>12430-054</td>의 변형은 <td>4.5g/L D-글루코오스, L-글루타민, 25 mM HEPES 및 페놀 레드를 함유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td>염화칼슘 또는 염화마그네슘 없이</td></tr><tr><td>소 태아 세럼</td><td>Omega Scientific Inc.</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10,000 U/ml 페니실린; 10,000 &mu; g/ml 스트렙토마이신&nbsp;</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>200 mM</td></tr><tr><td>G418 황산염&nbsp;</td><td>오메가 사이언티픽 Inc.</td><td>GN-04</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신 디하이드로클로라이드&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>from Streptomyces alboniger</td></tr><tr><td>HyClone HyQTase 비포유류 트립신 대안&nbsp;</td><td>EDTA를 사용한 DPBS의</td> <td>Thermo Scientific</td><td>SV30030.01</td>&nbsp;</tr><tr><td>위상차 혈구계</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>0.1mm 깊이</td></tr><tr><td>Trypan blue stain</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>멸균 0.9% NaCl 주입, USP</td><td>Hospira</td><td>NDC: 0409-4888</td><td>10ml 바이알</td></tr><tr><td>0.6ml 원추형 폴리프로필렌mi 마이크로튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-272</td><td></td></tr><tr><td>아티파메졸 염산염 주입</td><td>Orion Pharma</td><td>NDC: 52483-6298</td><td>5mg/ml 용액</td></tr><tr><td>케타민 염산염 주사</td><td>Fort Dodge</td><td>NDC: 0409-2051</td><td>100mg/ml 용액</td></tr><tr><td>덱스메데토미딘 염산염 주사</td><td>Zoetis</td><td>NDC: 54771-2805</td><td>0.5mg/ml 용액</td></tr><tr><td>자일라진 염산염 주사</td><td>로이드</td><td>NDC: 61311-481</td><td>100mg/ml 용액</td></tr><tr><td>카르프로펜 주사</td><td>화이자</td><td>NDC: 61106-8501</td><td>50 mg/ml 용액</td></tr><tr><td>부프레노르핀 염산염 주사</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>NDC: 12496-0757</td><td>0.3 mg/ml 앰플</td></tr><tr><td>1 ml 투베르쿨린 주사기&nbsp;</td><td>코비디엔</td><td>8881501400</td><td></td></tr><tr><td>26G x &frac12; (0.45mm x 13mm) 주사기 바늘&nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>외과용 클리퍼</td><td>3M</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>프로비돈-요오드 용액</td><td>Aplicare</td><td>82-217</td><td>NDC: 52380-1905</td></tr><tr><td>멸균 페트롤라툼 안과 연고&nbsp;</td><td>Dechra</td><td>NDC: 17033-211</td><td></td></tr><tr><td>70% 이소프로필 알코올 준비 패드</td><td>Kendall</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td>비직물, 4" x 4", 4-플라이&nbsp;</td></tr><tr><td>1.7ml 원추형 폴리프로필렌 마이크로튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td></td></tr><tr><td>마우스 정위 프레임</td><td>스톨팅</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>수술용 램프</td><td>Philips Burton</td><td>CS316W</td><td>Coolspot II 가변 스포트라이트</td></tr><tr><td>곡선 해부 겸자</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>5431</td><td></td></tr><tr><td>Colibri 견인기&nbsp;</td><td>FST</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>무선 정밀 파워 드릴</td><td>Dremel&nbsp;</td><td>1100-01</td><td>스타일러스 모델; 7.2-볼트 리튬 이온과 도킹 스테이션</td></tr><tr><td>조각 커터</td><td>Dremel</td><td>105</td><td>1/32" 또는 0.8 mm 비트 직경</td></tr><tr><td>마이크로리터 주사기</td><td>해밀턴</td><td>75</td><td>해밀턴 마이크로리터 주사기 700 시리즈; 5 &mu; l 볼륨</td></tr><tr><td>마이크로리터 주사기 바늘</td><td>Hamilton</td><td>7762-06</td><td>33 G, 작은 허브 RN NDL, 1.5 인치, 포인트 스타일 3, 6/PK</td></tr><tr><td>Ethilon 3-0 블랙 모노필라멘트 나일론 봉합사&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>1663</td><td></td></tr><tr><td>자석 스티어 바</td><td>VWR</td><td>74950-296</td><td>7.9 mm 직경 x 50 mm 길이 (5/16" 직경 x 2" 길이)</td></tr><tr><td>1 L 유리 나사-캡 보관 병</td><td>Corning</td><td>1395</td><td>Type 1, Class A borosilicate 유리</td></tr><tr><td>Heparin 나트륨&nbsp;</td><td>Sagent</td><td>NDC: 25021-400</td><td>1,000 U/ml 용액</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Cole Parmer Instruments Group</td><td>77200-60</td><td>Master Flex Easy Load II 콘솔 드라이브</td></tr><tr><td>압축 카보겐 (95% O2 / 5% CO2)</td><td>는 현지 공급업체에서 구할 수 있습니다</td>. N<td>/A</td><td>A-type, 대형 실린더&nbsp;</td></tr><tr><td>20 G x 1 &frac12; "알루미늄 허브 둔기 바늘</td><td>Kendall</td><td></td><td>8881202363 0.9 mm x 38.1 mm</td></tr><tr><td>폴리우레탄 얼음 양동이</td><td>Fisherbrand</td><td>02-591-45</td><td>용량: 0.152 oz. (4.5L)</td></tr><tr><td>Collagenase (Type I-S)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1639</td><td>from Clostridium histolyticum&nbsp;</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>LS002007</td><td>>2,000 Kunitz 단위/mg 건조 중량</td></tr> 정전기 <tr><td>방지 폴리스티렌 육각형 계량 접시</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>20157-3</td><td>상단 I.D. 115mm, 기본 I.D. 85mm, 203ml 용량&nbsp;</td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 단일 가장자리 면도날&nbsp;</td><td>Garvey</td><td>40475</td><td></td></tr><tr><td>Bone rongeurs</td><td>FST</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13014-14</td><td></td></tr><tr><td>대형 해부 가위</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>1316</td><td></td></tr><tr><td>소형 해부 가위</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>무딘 끝 집게</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>13250</td><td></td></tr><tr><td>7 ml 유리 Dounce 티슈 그라인더</td><td>Kontes</td><td>KT885300-0007</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 밀도 원심분리 미디어&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>10ml 혈청학 피펫</td><td>Genesee Scientific</td><td>12-104</td><td>일회용; 멸균</td></tr><tr><td>70 &mu; M 멸균 나일론 메시 셀 스트레이너&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugated rat anti-mouse CD45 (클론: 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103128</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse anti-mouse NK1.1 (클론: PK136)</td><td>eBiosciences&nbsp;</td><td>17-5941-82</td><td></td></tr><tr><td>PE 활용 쥐 안티 마우스 Gr-1 (클론 : RB6-8C5)</td> <td>BD Pharmigen</td><td>553128</td><td></td></tr><tr><td>PerCP / Cy5.5 복합 쥐 안티 마우스 CD11b (클론 : M1 / 70) &nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101228</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-conjugated rat IgG2b, &kappa; (클론 : RTK4530) isotype control&nbsp;</td><td>APC</td><td></td> 접합 마우스 IgG2a, &kappa를 400628 <td></td>Biolegend</tr><tr><td>; (클론 : eBM2a) 동형 제어&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>17-4724</td><td></td></tr><tr><td>PE 접합 쥐 IgG2b, &kappa; (클론 : eB149 / 10H5) 동종 제어&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>12-4031-82</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5-conjugated rat IgG2b, &kappa; (클론: RTK4530) 아이소타입 컨트롤</td><td>Biolegend</td><td>400632</td><td></td></tr><tr><td>Pacific Blue-conjugated mouse anti-mouse granzyme B (클론: GB11)&nbsp;</td><td>바이오레전</td><td>드 515403</td><td></td></tr><tr><td>퍼시픽 블루 활용 마우스 IgG1, &kappa; (클론: MOPC-21) 이소타입 제어&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>400151</td><td></td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm</td><td>BD</td><td>554714</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-103</td><td>원뿔형 바닥&nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 폴리프로필렌 원심분리기 튜브</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-108</td><td>원뿔형 바닥</td></tr><tr><td>12 mm x 75 mm 라운드-바닥 폴리프로필렌 FACS 튜브&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>14-956-1B</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria 특별 주문 연구 제품 플로우 사이토미터/세포 분류기</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>650033</tr><tr><td>클래스 II 생물 안전 캐비닛</td><td>The Baker Company</td><td>SG603</td><td>모델: SterilGARD III Advance</td></tr></tbody></table>

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

우리 연구소는 최근 자연 살해 (NK) 세포가 암 세포가 β - 갈 락토 - 결합 렉틴 galectin의 발현에 결함이 렌더링되는 경우 두개 내 생착 후 CNS-1 악성 신경 교종 곧 동소 이식 마우스 GL26과 쥐를 박멸 할 수 있음을 보여 주었다 -1 (GAL-1). 최근의 연구는 지금 GR-1 + /는 CD11b + 골수 세포의 인구는이 효과에 중요한 것을 알 수있다. 더 NK와 골수 세포가 우리가 단리 교종 함침 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)의 분석을위한 광범위한 프로토콜을 개발했다 GAL-1 결핍 종양 거부를 부여하기 위해 협력하는 메커니즘을 이해하기. 이 방법의 종양 미세 환경 내로 침투 PBMC를 비교하여 여기에서 설명된다 shRNA를 녹다운 통해 GAL-1 결핍 렌더링하는 것과 GL26 교종을 GAL-1 발현. 프로토콜에 대한 설명으로 시작하는 방법 문화와 GL26 가전을 준비동계 C57BL / 6J 마우스의 뇌에 접종에 대한 재편. 그러므로 초기 뇌 종양 미세 환경에서 신경 교종 함침 된 PBMC의 분리 및 유세포 분석에 관련된 단계를 설명한다. 상기 방법은 뇌에 면역 침윤 시간에 데이터를 필요로하는 생체 내 실험 디자인에 적용 할 수있다. 교종 함침 된 PBMC는 독립적 인 실험 내내 시점 유사한 종양에서 관찰 유사한 세포 수와 24 시간 후 종양 생착 자마자 두개 내 종양으로부터 분리 될 수있어서, 민감하고 재현성이다. 실험자들은 단일 분석 될 샘플의 수에 따라 약 4-6 시간에 신경 교종 함침 된 PBMC의 세포 계측 분석을 흐르게 뇌 적출에서 방법을 수행 할 수있다. 대안 교종 모델 및 / 또는 셀 특정 검출 항체는 또한 몇몇 다른 immun의 침윤을 평가 experimentalists &#39;판단에 사용될 수있다전체적인 절차 변경 없이도 관심 E 세포 유형.

다음 게이팅 전략은 일반적인 실험에 사용되는 : FSC-SSC-대 → SSC-H 대 SSC-W → FSC-H FSC-W → CD45 대 대 카운트 → GR-1 대 CD11b를 → 카운트 대 NK1.1. 게이트는 GzmB 표현 (도 5a)에 기초하여 층화 GR-1 + / + CD11b를 골수 NK1.1 + 세포 및 NK 세포에 배치. NK1.1 + NK 세포 및 GR-1 + / CD11b를 SSC-A는 NK 세포의 작은 림프 크기 및 골수 세포의 비교적 큰 크기를 확인 대 FSC-A 상 실험에서 + 골수 세포 (식별 해당 셀을 백 게이트 그림 5B). 원 데이터 파일 (예., FCS 파일) 등으로서 시판 Flowjo 유세포 데이터 분석 소프트웨어에 의해 분석된다. <p class="jove_conte...

초기 뇌 종양 미세 환경에 진입 면역 세포의 수와 활성 상태에서 시간에 따른 양적 데이터를 산출 교종 함침 말초 혈액 단핵 세포의 분리 및 유세포 분석을위한 간단한 방법이 여기에서 제시 하였다.

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...

이 절차의 전반적인 목표는 초기 뇌종양 미세환경에 침투한 말초 혈액 단핵 세포의 수를 특성화하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 말초 면역 세포가 뇌종양 미세환경으로 이동하는 데 중요한 요인을 식별함으로써 뇌종양 면역학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 이 CNS에 진입한 백혈구의 수와 활성화 상태에 대한 시간 의존적 정량적 데이터를 산출한다는 것입니다.마취된 마우스를 정위 프레임에 삽입한 후 메스 블레이드를 사용하여 전두골에서 후두골까지 두개골을 2cm 정도 정중선으로 절개합니다. 그런 다음 Collibra 견인기를 사용하여 절개 부위의 피부를 수축시킵니다. 그런 다음 33 게이지 바늘이 장착된 마이크로리터 주사기를 bma 바로 위로 내립니다.종양 이식을 위한 대상 부위에 도달하도록 바늘의 위치를 조정합니다. 그런 다음 26게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 투베르쿨린 주사기를 사용하여 골막을 부드럽게 절제하여 이 위치를 표시합니다. 드릴링하는 동안 아래에 있는 경막에 도달할 때까지 0.8mm 드릴 비트로 대상 부위의 두개골에 구멍을 뚫습니다.과도한 열과 힘을 피하기 위해 두개골 표면에서 드릴 비트를 빠르게 제거한 다음 간헐적인 압력을 가합니다. 다음으로, 바늘이 막히지 않도록 0.9ml 원추형 폴리프로필렌 마이크로 튜브에 1.7% 염화나트륨이 함유된 마이크로리터 주사기를 세척합니다. 종양 세포가 들어 있는 0.6ml 원뿔형 폴리프로필렌 마이크로 튜브를 여러 번 부드럽게 두드려 세포를 완전히 현탁시킵니다.그런 다음 2마이크로리터의 세포를 마이크로리터 주사기로 끌어당기고 주사기에 기포가 유입되지 않도록 합니다. 70% 이소프로필 알코올 준비 패드에 1마이크로리터의 세포를 분배하여 주사기에 정확히 1마이크로리터의 종양 세포를 남깁니다. 그런 다음 경막에 닿을 때까지 바늘을 아래로 내립니다.그런 다음 바늘을 뇌 속으로 3.5mm 내린 다음 바늘을 천천히 부드럽게 0.5mm 후퇴시킵니다. 1-2분 동안 주사기 플런저를 눌러 세포를 전달합니다. 심부 마취된 마우스에서 트랜스 카디알 관류를 수행합니다.뭉툭한 바늘을 심장의 좌심실에 삽입한다. 작은 해부 가위를 사용하여 오른쪽 심방을 잘라 피를 흘리고, 간과 폐가 혈액 부족으로 완전히 희어질 때까지 몇 분 동안 티로 용액으로 마우스 순환계를 관류합니다. 총 양의 혈액이 우심방으로 계속 빠져나가지 않도록 합니다.좌심실에서 20게이지 알루미늄 허브 무딘 바늘을 제거하기 전에. 바늘을 제거한 후 압출 폴리스티렌 폼 블록에서 마우스의 핀을 풀고 마우스의 복부 쪽을 아래로 돌립니다. 큰 해부 가위를 사용하여 머리를 몸의 나머지 부분과 분리하십시오.그런 다음 두개골을 노출시키기 위해 후두골에서 주둥이까지 작동하는 작은 해부 가위를 사용하여 정중선의 두피를 자릅니다. 그런 다음 두개골 양쪽의 피부를 수축시키고 두개골을 단단히 잡습니다. 한 쌍의 뼈 URS를 사용하여 후두골에서 시작하여 두개골을 조심스럽게 뚫고 앞으로 나아가 뇌의 등쪽 및 측면 표면을 완전히 노출시킵니다.두개골에 손상을 입히지 않고 쥐의 뇌를 채취하여 두개골을 채취하는 것은 처음에는 어려울 수 있습니다. 이 기술에 대한 경험이 없는 사람들은 적절한 실험을 실행하기 전에 여러 번 시도하고 싶을 수 있습니다. 두개골 뼈가 제거되면 마우스의 복부 쪽을 위로 돌립니다.두개골에서 뇌를 분리하기 위해 뇌 기저부의 뇌 신경을 잘라냅니다. 이 절차에서는 깨끗한 한쪽 면도날을 사용하여 뇌의 중심을 시상으로 잘라 종양이 있는 뇌 영역을 분리합니다. 두 반구를 절개하려면 동측 반구 내측을 아래로 돌려 소뇌에서 관상동맥 절개를 하고 후각구를 절개하여 종양 보형물을 포함하는 표적 조직을 분리합니다.다음으로, 1ml의 DPBS가 들어 있는 라벨이 부착된 유리 다운 티슈 그라인더에 대상 조직을 넣습니다. 플런저를 끝까지 누르고 7번 비틀어 조직을 파괴합니다. 그런 다음 플런저를 들어 올려 액체가 티슈 그라인더 바닥으로 다시 가라앉을 수 있도록 합니다.이 단계를 세 번 반복합니다. 그러나 다음 두 번 반복하는 동안 플런저를 네 번, 마지막 반복 동안 세 번만 비틀십시오. 뇌 조직을 과도하게 자극하지 않기 위해.그런 다음 플런저 측면에 1밀리리터 부피의 얼음처럼 차가운 DPBS를 3개 바르고 잔여 뇌 물질을 조직 그라인더로 헹굽니다. 그런 다음 위아래로 피펫팅하여 TRID 뇌 물질을 현탁시키고 얼음 위에 표시된 15ml 원심분리기 튜브에 넣습니다. 다운 티슈 그라인더의 측면을 얼음처럼 차가운 DPBS 1ml로 추가로 헹구고 동일한 15ml 원심분리기 튜브에 추가합니다.모든 샘플이 처리될 때까지 TRID 뇌 물질이 들어 있는 모든 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 15ml 원심분리기 튜브에 있는 TRID 뇌 물질을 섭씨 4도에서 20분 동안 740배 G로 회전시킵니다. 다음으로, 상층액을 제거하고 펠릿화된 뇌 물질을 미리 준비된 콜라겐 분해 효소와 DNA 1 소화 효소의 혼합물 1ml에 다시 현탁시킵니다.15ml 원심분리기 튜브를 시험관 랙에 넣고 랙을 37도 셀 CS 수조에 15분 동안 놓습니다. 그런 다음 조직 분해를 용이하게 하기 위해 튜브를 튕겨 배양 기간 동안 샘플을 두 번 부드럽게 교반합니다. 그런 다음 각 튜브에 6ml의 바이콜드 DPBS를 첨가하여 소화 효소를 희석합니다.이를 위아래로 파이프하여 멸균 70미크론 나일론 메쉬 필터를 통해 총 부피를 얼음 위의 새로 표시된 15밀리리터 원심분리기 튜브에 다시 부유시키고 필터링합니다. 그 후, 뇌 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 20분 동안 740배 G로 회전시켜 단일 세포 펠릿을 얻습니다. 원심분리기에서 15ml 튜브를 제거하고 얼음 위에 놓습니다.그런 다음 다음 단계를 준비하기 위해 원심분리기의 온도 설정을 약 섭씨 21도로 높입니다. 다음으로, Cell snat을 완전히 제거하고 P 1000 마이크로 피펫을 사용하여 1ml의 70% 밀도 원심분리 배지에 세포 펠릿을 초기에 재현탁합니다. 그런 다음 각 튜브에 70% 밀도 원심분리 매체 4밀리리터를 추가로 추가합니다.캡을 단단히 씌우고 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 세포 현탁액을 균질화한 다음 70% 밀도로 재현탁하는 뇌 세포가 포함된 15ml 원심분리기 튜브를 옮깁니다. 얼음에서 시험관 랙으로 원심분리 매체를 한 번에 하나씩 실온에서 추출합니다. 2밀리리터의 37% 밀도 원심분리 매체 용액을 5밀리리터의 70% 밀도 원심분리 매체에 조심스럽게 오버레이하여 두 밀도 원심분리 매체 층 사이에 깨끗한 계면을 형성합니다.그런 다음 두 레이어 사이의 계면 위치를 미세한 팁 마커로 표시하여 원심분리 후 구분이 명확하지 않을 때 쉽게 식별할 수 있도록 합니다. 15ml 원심분리기 튜브를 740배 G로 실온에서 20분 동안 쉬지 않고 회전시킵니다. 나중에 밀도 원심분리 매체 층 간의 계면이 중단되는 것을 방지하려면 P 200 마이크로 피펫을 튜브에 도입하여 두 밀도 원심분리 매체 층 사이의 계면에 축적된 pbmc를 수집합니다.PBMC 밴드 수준에서 지질층을 한 번 조심스럽게 우회하고 70% 밀도 원심분리 매체 층의 표면에서 200마이크로리터를 천천히 추출하고 얼음 위에 각각 표시된 폴리프로필렌 팩스 튜브로 옮깁니다. 이 단계를 한 번 반복하면 샘플당 총 400마이크로리터의 부피를 얻을 수 있습니다. 두 밀도 원심분리 매체 층 사이에 깨끗한 계면을 형성하는 실험자의 능력은 p BMC의 재현 가능한 분리에 매우 중요합니다.37% 밀도의 원심분리 매체를 천천히 붓고 튜브를 벤치 상판에서 20-30도 각도로 기울여야 합니다. 이 그림은 5단계에서 보여준 GR 1개의 양성 CD 11 B 양성 골수성 세포와 NK 1.1에 배치된 일반적인 실험 게이트에 대한 게이팅 전략을 보여줍니다. 6단계에서 나타난 양성 자연살해세포(positive natural killer cell)는 각각 5단계 프라임(prime)과 6프라임(prime)에서 GZMB 발현을 기반으로 층화됩니다.이 그림에서 FSCA와 비교하여 GR 1개의 양성 CD 11 B 양성 골수성 세포와 NK 1.1 양성 자연살해세포를 FSCA에 대조하여 비교하면 상대적으로 큰 크기의 골수성 집단에 비해 자연살해세포의 림프구 크기가 더 작다는 것을 보여주며, 따라서 이 두 pbmc 하위 집단의 정체를 추가로 확인할 수 있습니다. 여기의 데이터는 GL 26 sital one I 신경교종 세포가 syngen에 생착하는 것을 보여줍니다. XC 57 black six J 마우스 뇌는 GL 26 sit GAL one I 곡선을 따라 각 데이터 포인트와 관련하여 표시되는 CD 45 양성 PBMC 숫자의 동원을 빠르게 유도하며, 이는 대조군 위의 PBMC 침윤 종양의 접힘 유도를 나타냅니다.GGL 26은 종양 이식 후 지정된 시간에 NT 종양 또는 HPI를 시연에 사용된 특정 항체 칵테일에 기초하여 GR 1개의 양성 CD 11 B 양성 골수성 세포 및 NK 1.1 양성 자연 살해 세포가 종양 생착 후 48시간 이내에 GAL 1개의 결핍 종양 미세환경에 특이적으로 진입하는 것으로 나타났습니다. 그러나 골수성 세포에 침투하는 신경교종의 총 수는 자연살해세포의 수보다 훨씬 많았다. 일단 숙달되면 방법론은 두뇌 수확에서 흐름에 이르기까지 요약됩니다.세포 분석은 한 명의 실험자에 의해 약 6시간 내에 수행될 수 있습니다. pbmc 상보적 실험에 침투하는 신경교종의 총 수를 공정하게 비교하기 위해 각 PBMC 샘플의 전체 부피를 유세포분석기로 분석하는 것이 필수적입니다. 이러한 면역조직화학적 분석은 면역세포 침투에 대한 공간 데이터를 획득하고 이러한 절차를 사용하여 평가된 것과 일치하는 시점에서 전체 종양 크기 및 미세해부학을 측정할 수 있도록 하기 위해 수행될 수 있습니다.이 기술은 전체 절차에 큰 변경 없이 혈장 DNA를 인코딩하는 종양유전자를 사용하여 새로 생성된 모델을 포함하여 다양한 뇌종양 모델의 연구에 적용될 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스의 뇌에 정위 및 이식을 위한 신경교종 세포 현탁액을 준비하는 방법, 풍부한 종양, 뇌를 가진 마우스를 transi하는 방법, 말초 혈액 단핵 세포에 침투하는 신경교종을 미터법으로 분리하고 유동시키는 방법, 신경교종을 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

isolation-flow-cytometric-analysis-glioma-infiltrating-peripheral

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

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쥐의 뇌에서 종양 침투 면역 세포 분리

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간질 흐름이 있는 침습적 신경교종 미세환경의 광중합 가능한 히알루론산-콜라겐 모델

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Mini-Stroke Murine Model에서 신경면역 상호작용의 분리 및 유세포 분석 평가

배우세요 교종 침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석 방법을 통해 뇌종양 미세환경에서 면역 세포의 수와 활성화 상태를 시간 의존적으로 정량화하는 기술입니다. 이 방법은 뇌종양 면역학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

분리 및 신경 교종-침투 말초 혈액 단핵 세포의 유세포 분석

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