불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

이 절차의 전반적인 목표는 불멸화된 다능성 귀 전구 세포를 내이 세포 유형으로 분화하는 것입니다. 따라서 이 방법은 이삭 전구 세포가 달팽이관 유모 세포 또는 청각 뉴런이 될 수 있는 방법과 같은 청각 재생의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요한 것은 이 기술이 생체 내 포유류 동물 모델 시스템과 병행하여 사용할 수 있는 체외 세포 시스템을 제공한다는 것입니다.

오늘 제 연구실의 박사후 연구원인 Azadeh Jadali와 연구실의 두 대학원생인 Zhichao Song과 Alejandra Laureano가 절차를 시연할 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양 배지를 준비한 후 이 액체 3ml를 사용하여 10의 1 곱에서 6번째 불멸의 다능 전구 또는 IMOP 세포를 60mm 조직 배양 접시에 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 5-7일 동안 세포를 5%의 이산화탄소로 배양합니다.

격일로 신선한 배지를 추가하여 배양액의 액체 부피를 두 배로 늘리십시오. 세포를 계대에 넣으려면 먼저 배양 접시에서 15ml 원추형 튜브로 세포를 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도에서 5분에서 10분 동안 놓습니다.

이 기간 동안 이구권을 형성하는 군체가 중력 침전을 통해 원뿔의 바닥에 모일 것으로 예상됩니다. 다음으로, 팔레트를 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 흡입합니다. 0.5 ml의 미리 예열된 1 millimolar EDTA 강화 평형 염 용액 또는 HBSS를 첨가한 다음 2-3회 위아래로 피펫팅하여 이구를 재현탁합니다.

이구를 단일 세포로 쉽게 해리하려면 원뿔형을 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣으십시오. 용액을 주기적으로 소용돌이치고 튜브 바닥에 침전물로 이구가 관찰되지 않으면 실온으로 옮깁니다. EDTA를 중화하기 위해 세포에 2ml의 배양 배지를 첨가합니다.

그리고 실온에서 200g으로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 희석된 EDTA 용액을 흡인하고 1x PBS 5ml로 세포를 세척합니다. 동일한 설정을 사용하여 셀을 회전시킨 후 1x PBS를 흡인합니다.

다음으로, 원뿔형에 0.5 밀리리터의 배양 배지를 첨가하십시오. 그리고 셀 팔레트를 다시 일시중단합니다. 계수를 위해 IMOP 세포를 배양 배지에서 1-100 개로 희석하십시오.

그런 다음 이 용액 75마이크로리터를 미세유체 입자 계수기에 위치한 카세트에 추가하고 세포 수를 결정합니다. 그 후, 앞서 설명한 대로 60mm 조직 배양 접시에 10번째에서 6번째 IMOP 세포를 1번 플레이트하고 5-7일마다 이 통과 절차를 반복합니다. 도금 후 3일 후, 중력 침전을 사용하여 앞서 보여준 것처럼 이구를 수집합니다.

상등액 흡입을 진행합니다. 그리고 2 밀리리터의 감각 상피 분화 배지에 세포를 부드럽게 재현 탁엽시킵니다. 그런 다음 10ml 크기의 큰 기공 피펫을 사용하여 이구를 새로운 60mm 접시로 옮깁니다.

10일 동안 이구를 구별합니다. 격일로 2ml의 신선한 분화 배지를 배양에 추가합니다. 그 후, 중력 침전을 통해 이구를 다시 수확합니다.

그리고 사용한 매체를 흡인합니다. 다음으로, 실온에서 15분 동안 1x PBS에 4% 파라포름알데히드로 이구를 고정합니다. 그런 다음 포름알데히드 용액을 제거하고 0.1% Triton x100을 함유한 1x PBS로 세포를 세척합니다.

10%의 염소 혈청과 0.1%의 트리톤 x100을 보충한 1x PBS로 이구를 차단하여 진행합니다. 1시간 후, 차단 버퍼를 Cdkn1b 또는 CDH1 항체의 적절한 희석액을 함유한 버퍼로 교체합니다. 그런 다음 1차 항체의 세포를 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다.

그리고 다음 날에는 다른 곳에서 설명한 대로 형광 표지된 2차 항체인 Phalloidin 및 Hoechst를 사용하여 면역 염색을 계속합니다. 이미징을 준비하려면 유리 슬라이드에 장착 매체를 놓습니다. 그런 다음 염색된 이구를 배지에 도입합니다.

다음으로, 샘플 위에 커버 슬립을 놓습니다. 장착 매체를 섭씨 4도에서 밤새 건조시킨 후 슬라이드를 16비트 CCD 카메라가 장착된 도립 현미경의 스테이지에 놓습니다. 20x 0.75 air objective를 사용하여 청색, 녹색, 적색 및 적외선 채널에서 데이터를 수집하여 epifluorescence 이미지를 획득합니다.

먼저 원형 유리 커버 슬립을 멸균 100mm 플레이트에 넣고 70% 에탄올에 담가 청소합니다. 커버 슬립을 부드럽게 저어 덮여 있는지 확인하고 접시를 실온에 10분 동안 그대로 두십시오. 다음으로, 멸균 1x PBS에서 커버 슬립을 세 번 헹구고 멸균 물로 한 번 헹굽니다.

그런 다음 조직 배양 후드에서 15분 동안 자외선에 노출시켜 덮개를 건조시킵니다. 즉시 사용하려면 24웰 플레이트의 각 웰에 멸균 커버 슬립 하나를 넣으십시오. 그리고 접시를 부드럽게 흔들어 모든 커버 슬립이 평평하게 놓이도록 합니다.

그런 다음 각 웰에 폴리 D 라이신 10마이크로감이 포함된 1x PBS 0.25밀리리터를 추가하여 커버 슬립을 코팅합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양한 후 폴리 D 라이신 용액을 제거하고 멸균 1x PBS로 웰을 세 번 세척합니다. 마지막 세척의 액체가 흡인되면 0.25개의 웰 각각에 10마이크로리터 라미닌을 포함하는 1x PBS 10ml를 24개의 웰 각각에 주입합니다.

섭씨 37도에서 밤새 플레이트를 배양한 후 라미닌 용액을 흡인한 다음 1x PBS 1밀리리터로 각 웰을 세 번 세척하되 세포가 플레이트링될 준비가 될 때까지 웰에서 마지막 세척의 PBS를 그대로 둡니다. 신경 세포 분화를 시작하려면 앞서 설명한 대로 해리된 이권에서 세포를 세십시오. 그런 다음 예열된 신경 분화 배지에 다시 현탁시킵니다.

1과 1 포인트 사이에서 10에서 5 번째 IMOP 셀을 코팅된 커버 슬립이 포함된 플레이트의 각 웰에 파딩하여 진행합니다. 접시를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 배양합니다. 격일로 신경 분화 배지를 교체합니다.

7일 후, 배지를 흡인하고 각 웰에 4%의 포름알데히드를 첨가하여 커버 슬립에 부착해야 하는 세포를 고정합니다. 그리고 실온에서 15분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 포름알데히드를 제거하고 0.1% Triton x100을 함유한 1x PBS에서 세포를 한 번 세척합니다.

다음으로 세척 버퍼를 제거합니다. 그리고 각 웰에 10%의 정상 염소 혈청을 함유하는 1x PBS와 0.1%의 Triton x100으로 구성된 블로킹 버퍼를 첨가합니다. 세포를 실온에서 1시간 동안 그대로 두십시오.

그런 다음 액체를 제거하고 Cdkn1b 또는 Tubb3 항체의 적절한 희석을 포함하는 차단 버퍼로 교체하십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 배양 후 1%의 Triton x100이 함유된 1x PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 그런 다음 앞서 설명한 대로 면역염색을 진행합니다.

염색이 완료된 후 웰에 1x PBS를 추가하여 최종 세척을 수행합니다. 분석을 위해 준비하려면 24웰 플레이트에서 염색된 세포가 부착된 커버 슬립을 제거합니다. 그리고 유리 슬라이드의 장착 매체에 놓습니다.

장착 매체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 건조시킨 후 앞에서 설명한 대로 에피 형광 이미지를 획득합니다. 상피 분화 배지에서 10일 동안 배양된 이구는 미분화 세포에 비해 Cdkn1b 발현, 순환 의존성 키나아제 억제제 및 내이 분화 마커가 증가함을 보여줍니다. 여기에서 Hoechst 염색은 세포핵을 기록했습니다.

이 세포는 또한 액틴 필라멘트와 상피의 특징인 세포-세포 접착 영역에서 형태학적 변화를 나타냅니다. Phalloidin의 출현 및 세포 주변부에서 Cdh1 표지로 표시됩니다. 이구는 또한 뉴런을 형성하도록 지시될 수 있습니다.

이 명시야 이미지는 신경 분화 배지에서 7일 후에 IMOP 세포가 신경돌기를 나타내는 것을 보여줍니다. 신경 세포 마커 Tubb3로 이러한 세포를 면역염색하면 세포의 분화를 확인할 수 있습니다. 또한 Cdkn1b를 견고하게 표현합니다.

이는 이중 Tubb3, Cdkn1b 신호가 IMOP 세포의 신경 분화 지표로 사용될 수 있음을 시사합니다. Cdkn1b 형광 분화 및 미분화 세포도 Hoechst 신호에 대한 비율을 측정하여 정규화하여 정량적 결과를 제공했습니다. 이 데이터의 히스토그램은 다음과 같습니다.

정규화된 Cdkn1b의 미리 결정된 임계값을 초과하는 미분화 및 분화된 IMOP 셀의 백분율이 이러한 그래프에 표시됩니다. 두 분화된 집단 모두 미분화 대조군에 비해 Cdkn1b를 발현하는 세포의 비율이 크게 증가한 것으로 나타나 면역형광에 의해 제안된 분화를 확인시켜줍니다. 일단 숙달되면 IMOP 세포의 일상적인 배양 및 분화는 적절하게 수행될 경우 30분 이내에 완료될 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 IMOP 세포의 분화를 시작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 비디오를 시청해 주셔서 감사합니다. 그리고 당신의 실험에 행운을 빕니다.