Name: 불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: 배우세요 불멸화된 다능성 귀 전구세포(iMOP)를 내이 세포로 분화시키는 방법을. 이 기술은 청각 재생 및 달팽이관 모세포와 청각 신경원 형성 연구에 필수적인 체외 모델을 제공합니다.

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이 연구는 Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund(K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant(K.Y.K.) 및 Rutgers Faculty Development Grant(K.Y.K.)의 지원을 받았습니다.

1. IMOP 세포의 자기 갱신을 유지 <ol><li> 문화 매체를 iMOP 준비 : DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin 20 NG / ㎖의 bFGF를. 멸균 시약을 사용하여 iMOP 문화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업. <ol><li> 해동 50X B27 보충제와 37 ° C의 물을 욕조에 5 분 동안 필터 멸균 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin 분취. 실온에서 100 μg의 / ㎖의 bFGF 나누어지는을 녹여. 추가 1 ml의 50 배 B27, 100 μg의 / ㎖의 bFGF를 10 μL와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μL. </li></ol></li><li> 배양 iMOP 세포 60mm 조직 배양 접시에 미디어의 3 ㎖를 사용합니다. 미디어의 볼륨을 두 배로 매일 문화에 신선한 매체를 추가합니다. 의 bFGF의 농도가 5 ng를 / ㎖ 이하로 떨어지지 않도록해야합니다. <ol><li> 아래 단계에 나열된 문화 5~7일 후 5 % CO 2 항로 세포와 37 ° C에서 문화 iMOP 세포. (15)로 전송 문화10 ML의 피펫 팁을 사용하여 ML 원뿔. </li></ol></li><li> HBSS의 50 ㎖에 0.5 M EDTA의 pH 8.0의 0.1 ml에 희석하여 HBSS에 1 mM의 EDTA를 확인합니다. 사전 따뜻한 1 mM의 EDTA는 37 ° C의 물을 욕조에 HBSS로했다. </li><li> 중력 침강 또는 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 실온에서. 10 분 - 중력 침강를 들어, 5 37 ° C 배양기에서 문화를 포함하는 15 ML 원뿔을 배치합니다. 그 시간 후, otospheres이 15 ml의 원추형의 바닥에 수집 관찰. 참고 : 과도한 원심력 세포 손상의 원인이 될 수 있습니다. </li><li> 조심스럽게 흡인 세포 펠렛을 방해하지 않고 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 미디어를 보냈다. 펠렛을 셀에 미리 예열 1 mM의 EDTA HBSS 용액 0.5ml를 추가합니다. P1000 피펫을 사용하여 부드럽게 피펫 아래로 2-3 회. 37 ° C에서 원추형 배치 및 단일 세포로 분리를 용이하게하기 &lt;5 분 동안 배양한다. </li><li> 부드럽게 otospheres가 해리되어 있는지 확인 셀 솔루션을 소용돌이 친다. 더 OTO 경우구가 원뿔의 바닥에 침전, 세포를 분해한다. 배양 시간은 다를 수 있습니다. 참고 : EDTA와 장기간 배양 과도한 세포 사망을 초래할 것입니다. </li><li> 37 ° C에서 세포를 제거 EDTA를 중화하고 희석 미디어 2 ㎖를 추가합니다. RT에서 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 세포를 수집한다. 대기음 아웃 2 ml의 흡입 피펫을 사용하여 세포를 씻어 1X PBS 5 mL를 추가 EDTA를 희석. </li><li> 실온에서 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운 및 2 ml의 흡입 피펫을 사용하여 1X PBS를 대기음. 3 번 - 부드럽게 내려 2를 피펫 팅에 의해 iMOP 배양액 0.5 ㎖에 P1000 피펫을 사용하여 세포를 재현 탁. </li><li> 해당 카세트 (28)와 미세 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트. iMOP 세포의 합류 판 ~ 6 X10 6 셀이 포함됩니다. 미디어 (100) 및 계산을위한 카세트에 셀 솔루션의 75 UL을 추가 세포 1을 희석. iMOP의 cultu에서 6cm 접시에 플레이트 1 × 10 6 세포미디어 재 (~ 1 : 10 희석). 통로 iMOPs 모든 5-7일. 참고 : 큰 otospheres을 형성하거나 차별화 조직 배양 접시의 바닥에 부착 세포. 문화가 융합을 통해 경우 세포는 죽을 것이다. </li></ol> 2. 동결 융해 IMOP 세포 <ol><li> 해동 전에 동결 세포에 4 ° C에 대한 해결책을 평형화에 의해 합성 동결 매체를 준비합니다. </li><li> iMOP 세포의 합류 6cm 접시에서 세포를 수집합니다. 15 ML 원뿔로 - (8 × 10 6 세포 ~ 6) 10ml를 피펫 및 전송 세포를 사용합니다. </li><li> 중력 침강 또는 실온에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. otospheres가 작은 경우, 세포가 중력 침강에 의해 해결되지 않습니다. 옵션 : 총 세포 수를 결정하는 단계 1.9을 사용하여 세포를 계산합니다. </li><li> 대기음 뒤에 느슨한 세포 펠렛을 유지하면서 피펫을 흡입 2 ㎖를 사용하여 미디어를 보냈다. </li><li> CE를 재현 탁하는 합성 동결 미디어의 0.25 ML을 추가~ 5 × 5 × 106 3 세포 / ml의 밀도로 LLS. 부드럽게 P1000 피펫으로 세포를 피펫. 팁을 여과 1 mL를 P1000 피펫을 사용하여 극저온 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 알코올 무료 냉​​동 컨테이너에 튜브를 놓고 온도에 도달 할 때까지 -80 ° C ~ 분당 온도 1 ° C를 감소 -80 ℃에서 냉동 컨테이너를 배치합니다. </li><li> 세포를 장기간 저장을 위해, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상에 튜브를 전송. 문화에 대한 세포를 해동, -80 ℃에서 냉동 세포를 포함하는 극저온 유리 병을 평형. </li><li> 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 iMOP 문화 미디어. </li><li> 37 ℃의 수욕 바이알의 저부 소용돌이에 의해 신속하게 냉동 바이알을 해동. 마지막 얼음 결정이 사라지면 해동 세포에 미리 예열 iMOP 문화 미디어의 1 ML을 추가합니다. 전사 15ml의 원뿔형으로 iMOP 세포 배양 배지의 추가적인 4를 가하여 </li><li> 15 ml의 공동 스핀5 분 nical. 200 XG에서 보낸 매체를 대기음. 6cm iMOP 접시에 배양 배지 및 세포 플레이트 2 ㎖의 세포를 재현 탁. 확장을 위해 5 %, 37 ℃에서 이산화탄소를 문화를 품어. </li></ol> 3. 감각 상피에 IMOP 세포를 차별화 <ol><li> DMEM / F12, 1X B27 보충제, 25 μg의 / ㎖ carbenecillin : iMOP 감각 상피 분화 매체의 50 ㎖를 준비합니다. iMOP 감각 상피 분화 매체의 50 mL로한다. 37 ° C의 물을 욕조에 50 ML 원뿔에 DMEM / F12의 49 ml의 워밍업. 해동 50X의 B27 보충제, 5 분 동안 100 mg을 / ㎖ carbenecillin 분취. 37 ° C의 물을 욕조에. 1 ml의 50X B27와 DMEM / F12에 100 ㎎ / ㎖ carbenecillin의 12.5 μl를 추가합니다. </li><li> , 수확, 재현 탁을 해리와 카운트 세포는 1.4-1.9 단계를 반복 </li><li> 일 -3 문화 매체를 iMOP 사용에 6cm 접시에 플레이트 1 × 10 6 세포. 일 0에서 전송 문화는 15 ML 원뿔에 10 ml의 피펫을 사용하여. OTO를 수집중력 침강에 의해 구체로 단계 1.6에서 말했다. 대기음 밖으로 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 미디어를 소비하고, 원뿔 밑면의 otospheres 둡니다. </li><li> 부드럽게 감각 상피 분화 미디어 2 ㎖에 추가 할 수 있습니다. 전송은 큰 구멍 10ml를 피펫을 사용하여 6cm 접시에 otospheres. 참고 : 거친 피펫 팅에서 기계 전단은 otospheres에서 세포를 떼어 놓다 수 있습니다. </li><li> 매일 문화에 신선한 감각 상피 분화 매체의 2 ML을 추가합니다. 필요한 경우, 세포 대체 중력 침강 및 매체에 의해 회수 할 수있다. </li><li> 15 ML 원뿔로 전송하고 otospheres 단계에서 언급 한 바와 같이 보냈다 미디어 피펫을 흡입 2 ml에 사용 1.6.Aspirate 침전물과 방해받지 otospheres을 떠날 수 있도록하여 10 일에 otospheres를 수집합니다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 1X PBS에 4 % 포름 알데히드에서 배양하여 otospheres을 수정합니다. 포름 알데히드 용액을 제거 세척 완충액 (PBS 1X, 0.1 % 트리톤-10을 함유하는 세척 otospheres0)를 차단 완충액에서 배양 하였다 (1X PBS 10 % 정상 염소 혈청에서 1 시간 동안 0.1 % 트리톤 X-100)을 함유. <ol><li> 버퍼를 교체하고 희석 항체와 버퍼를 차단에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 품어. 1X PBS 27 면역 염색에 0.1 % 트리톤 X-100 대상에게 otosphere를 포함 씻을 샘플. P1000 피펫을 사용하여 유리 슬라이드에 미디어를 장착에 1X PBS로 전송 otospheres 및 장소 otospheres. 샘플을 통해 coverslip에 넣고 설치 미디어가 4 ℃에서 건조 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 16 비트 CCD 카메라와 20 배 0.75 공기 중 또는 40X 1.3 NA 오일 침지 목적이 장착 거꾸로 현미경 설정을 사용하여 표면 형광 이미지를 획득. 블루 (377 ± 25 나노 / 447 ± 30 ㎚), 녹색 (475 ± 25 나노 / 540 ± 25 ㎚), 빨간색 (562 ± 20 나노 / 625 : 상기 (여기 및 방출) 파장을 사용하여 다른 색상 채널에서 형광을 수집 ± 20 나노) 및 적외선 (628 ± 20 나노 / 및 692 ± 20㎚). </li></ol> 4. 시금 에듀 설립 <ol><li> 일 -3에서 6cm 접시에 1 × 10 6 iMOP 세포를 접시. 삼일 후에 일 0에, 수확, 해리, 재현 탁하고 단계 1.4-1.9를 반복하여 세포를 계산합니다. </li><li> 플레이트 iMOP 배양 배지에 2.5 × 10 5 세포와 6 잘 접시의 다른 우물의 감각 상피 분화 미디어 5 X10 5 세포. </li><li> 에듀 통합 분석을 사용하여 3 일에 듀 설립하여 S 단계에서 세포의 비율을 결정 <ol><li> 배양 배지에서 1 μM 듀의 최종 농도를 얻기 위해 iMOP 배양 직접 듀 콘텐츠를 추가한다. </li><li> 2 시간 동안 iMOP 문화에 EDU을 품어 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어. 수확, 해리와 수집 세포 단계 1.4-1.9를 반복합니다. 15 분 동안 1X PBS에 4 % 포름 알데히드에 추가합니다. 실온에서 세포를 해결하려면. 실온에서 5 분 200 XG에서 원심 분리하여 수확 세포. 포름 알데히드 용액과 properl 제거Y는 폐기하십시오. </li><li> 라벨 훽스트 (Hoechst)와 세포의 핵 및 제조 업체의 프로토콜에 따라 녹색 형광 염료 아 지드와 에듀를 통합. 참고 : 모든 세척이 1X PBS, 두 번 1X PBS로 3 % BSA, 0.1 % 트윈 20 세척 세포로 이루어집니다. </li><li> 및 antifade 시약을 사용하여 슬라이드에 마운트 세포 샘플을 통해 1.5 커버 유리를 놓습니다. 표면 형광 현미경을 사용하여 표지 된 세포의 형광 이미지를 획득. </li></ol></li></ol> 5. IMOP 유래 신경 세포를 차별화 <ol><li> 로 Neurobasal 미디어, 1X B27 보충제, 2 mM의 L 글루타민 : 신경 세포 분화 매체의 50 mL로한다. 5 분 37 ° C의 물을 욕조에 50 배 B27 200 mM의 L 글루타민의 해동 병. 로 Neurobasal 미디어의 48.5 ml의 1ml를 50X B27 0.5 ml의 200 mM의 L 글루타민을 추가합니다. </li><li> 멸균 10cm 플레이트 라운드 12mm 1.5 커버 글라스를 배치하고 멸균 된 커버를 청소 판에 70 %의 EtOH를 추가로 코트 커브 글라스. </li><li> 부드럽게 코브를 교반rslips은 에탄올에 포함되어 있는지 확인합니다. 실온에서 10 분 동안 접시를 남겨주세요. 나머지 에탄올을 씻어 살균 1X PBS로 된 커버 3 회 씻어. 1X PBS 나머지 씻어 살균 H 2 0 번 커버 슬립을 씻어. </li><li> 피펫을 흡입 2 ㎖의를 사용하여 H 2 0 대기음 된 커버가 건조 할 수 있습니다. 15 분 동안 조직 배양 후드에서 UV 광에 노출 된 커버. 즉시 사용하지 않을 경우 저장소는 무균 환경에서 커버 슬립. </li><li> 24 잘 접시의 각 웰에 한 12mm 라운드 커버 슬립을 놓습니다. 커버 슬립이 잘 바닥에 평평하게 놓여 있는지 확인 부드럽게 판을 흔들어. </li><li> 해동 2 밀리그램 / 1X PBS에서 10 μg의 / ㎖ 폴리 D 라이신 농도 실온에서 폴리 -D- 라이신 원액 mL 및 희석. 10 UG / ㎖ 폴리 D 라이신 0.25 ml의 우물에 추가합니다. 1 시간 동안 37 ° C를 인큐베이터에서 접시를 남겨주세요. </li><li> 멸균 1X PBS로 우물 3 회 반복한다. 실온에서 10 ㎎ / ㎖ 라미닌 원액 및 해동 10 μg의 / M로 희석1X PBS에서 L. 추가 10 μg의 24 멀티 잘 접시의 단일 잘으로 솔루션을 작동 / ㎖ 라미닌 0.25 ml의. 37 ° C 배양기에서 접시를 품어. 2ml의 흡인 피펫을 사용하여 용액을 라미닌 대기음. </li><li> P1000 피펫 1X PBS 1 ml의 추가 및 피펫을 흡입 2 ㎖로 흡입하여 1X PBS를 제거하여 커버 슬립을 1X PBS로 3 회 반복한다. 세포가 도금 될 준비가 될 때까지 잘 마지막 세척에서 1X PBS를 남겨주세요. 해리와 일 -3에서 6cm 접시에 단계 1.4-1.9.Plate 1 × 10 6 세포를 세포를 계산, 수확에 의해 신경 세포의 분화를 시작합니다. </li><li> 일 0, 수확, 해리와 1.4-1.9를 반복하여 세포를 계산합니다. 씨 1 × 10 5 - 잘 24 멀티 잘 접시 당 예열 신경 세포 분화 미디어 0.5 ml의에 × 10 5 iMOP 세포 1.5. 기음과 매일 문화에 미리 예열 신경 세포의 분화 미디어를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 15 분 동안 4 % 포름 알데히드에 iMOP 유래 신경 세포를 고정합니다. 에이t RT 7 일째 제거 포름 알데히드 용액에 세척 완충액으로 iMOP 유래의 신경 세포를 세척 버퍼를 차단에 배양 하였다 (1X PBS 0.1 % 트리톤-100을 포함하는) (1X PBS 10 % 정상 염소 혈청과 0.1 %를 함유 트리톤 X-100) 1 시간 동안. <ol><li> 버퍼를 교체하고 희석 항체와 버퍼를 차단에서 샘플을 품어. 4 ° C에서 품어. 1X PBS 0.1 % 트리톤 X-100 주제 세포를 포함 씻을 샘플은 27 면역 염색합니다. 설치 미디어에 배치하기 전에 1X PBS로 커브 글라스를 씻으십시오. 설치 미디어가 단계 3.8에 나와있는 표면 형광 이미지를 획득하기 전에 4 ℃에서 건조하도록 허용합니다. </li></ol></li></ol>

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Blanchard, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+conversion+of+fibroblasts+into+peripheral+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective conversion of fibroblasts into peripheral sensory neurons.</a> Nat Neurosci. 18 (1), 25-35 (2015).</li>
</ol>

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IMOP 문화 모니터링 신규 iMOP 세포주의 분화를 자기 갱신을 유지 및 촉진시키기위한 프로토콜을 설명하는 추가 도금 포맷 (표 1)을 포함한다. 일상적인 확장과 iMOP 세포의 분화에 도움이되는 몇 가지 중요한 단계가 설명되어 있습니다. 다 능성 줄기 세포 배양과 마찬가지로, iMOP 세포는 이론적으로 불명확 수명을 갖는다. 세포주가 제대로 유지되도록하려면, iMOP 문화가 일상적으로 세포 생존,자가 재생과 분화 가능성에 대해 모니터링된다. 분리 한 후 세포 생존을 확인하려면, 우리는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 일반적으로, 세포의 70 % 이상이 분해 후에 실용적이다. 수행 C-Myc와 및 Sox2이 항체와 면역 염색, iMOP 세포의자가 재생을 모니터링 할 수 있습니다. 증식 배양 조건에서 iMOP 세포는 18 시간 ~의 두 배의 시간이 있습니다. 수행 또는 자체 갱신 마커의 발현의 변화시간을 ublin...

A correction was made to the Authors section in: <a href="http://www.jove.com/video/53692">Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells</a>.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali

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Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

내이의 기관인 달팽이관, 난실, 주머니 및 세 개의 반고리관은 듣고 균형을 잡는 능력을 매개합니다. 달팽이관 내의 유모 세포는 소리를 전기 신호로 변환하여 나선신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로 전달합니다. SGN은 활동 전위를 발사하여 청각 회로를 통해 신경 신호를 전파합니다. 유전적 돌연변이, 이독성 약물 및 큰 소리에 대한 노출은 유모 세포와 SGN 사멸에 기여하여 청력 상실을 초래합니다1-4. 한 번 손실되면 이러한 세포는 대체되지 않습니다. 초기 유모 세포 또는 SGN을 생성하기 위해 iPSC와 ESC를 사용하는 것은 내이 세포 대체 요법에 큰 가능성을 제공합니다5-8. 만능 줄기 세포와 내이 유래 전구 세포는 다양한 성숙 단계에서 유모 세포와 SGN으로 분화할 수 있다는 사실이 쏟아져 나왔습니다. 포유류 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 사용하여 기능성 유모 세포와 SGN9-11을 생성할 수 있습니다. 포유류의 내이에서 유래한 줄기세포와 전구세포는 또한 생체 내 세포 대응 물질12-16의 특성을 가진 유모 세포와 뉴런을 형성하는 것으로 나타났습니다. 
손실된 유모 세포와 SGN을 대체하기 위해 iPSC 또는 ESC 유래 otic 전구 세포를 사용하는 것은 효율적인 분화가 필요합니다. 내이에서 생착된 줄기 유래 전구 세포의 부적절한 분화 또는 지속적인 증식은 내이 기능을 악화시키고 내이에서 기형종 형성과 같은 종양 유발 위험을 초래할 수 있습니다17. 배양 조건을 개발하고 이암 전구 동물의 분화를 이해해야 할 분명한 필요성이 있습니다. 이러한 방법을 개발하는 한 가지 전략은 내이 발달 과정에서 신경감각 전구 세포가 내린 세포 운명 결정을 요약하는 것입니다. 이의 증식을 방지하고 귀 전구 세포를 유모 세포 또는 SGN으로 유도하는 프로토콜은 대체 요법의 안전성과 효능을 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 
발달 과정에서 내이는 능형체 5와 6 사이의 제한된 영역에서 표면 외배엽이 두꺼워지는 것으로 시작하여 이판(otic placode)이 됩니다. 이파리(otic placode)가 이파리(otic cup)를 형성하기 위해 침입할 때, 이파리의 앞쪽 영역에 있는 세포들의 집합체는 내이(內耳)의 유모 세포와 뉴런의 전구체를 포함하는 신경-감각-관능 도메인(neural-sensory-competent domain, NSD)을 발생시킨다18. 내이가 발달하는 마우스, 닭 및 제브라피시의 운명 매핑 연구는 지지 세포와 이소 뉴런19-22를 둘러싼 감각 유모 세포를 생성하는 신경 감각 전구 세포의 여러 집단을 제안합니다. 높은 이동성 그룹 전사 인자인 Sox2는 감각 세포 사양화와 관련이 있으며 내이 전구 세포에 대한 마커로 사용됩니다23,24. 내이에서 Sox2 발현 수준을 감소시키는 저형성 돌연변이는 달팽이관의 유모 세포, 지지 세포 및 SGN의 손실을 초래합니다25,26. 
세포 운명 결정을 받는 귀 전구 세포를 연구하기 위해, 달팽이관 전구 세포를 발현하는 Sox2의 불멸화 다분화능 전구 세포주(iMOP) 세포주를 운명 제한으로 설정했습니다. iMOP 세포는 원래 배아 E12.5-13.5 달팽이관에서 유래했으며 c-Myc 레트로바이러스에 감염되었습니다27. iMOP 세포는 이구(otosphere)로 알려진 군락을 형성하는 세포로 지속적으로 증식할 수 있으며, 유모 세포로 분화하여 세포와 SGN을 지지할 수 있습니다27. iMOP 세포가 뚜렷한 이염 계통으로 분화하는 능력을 이해하면 이러한 연구 결과를 적용하여 iPSC 또는 ESC 유래 유모 세포 및 SGN을 효율적으로 생성할 수 있습니다.효율적인 분화 프로토콜은 기존 치료법에 적합하지 않은 내이 질환의 세포 대체 요법을 위한 새로운 길을 열 것입니다. 체외 세포 배양을 통해 이세포 생성에 있어 중요한 문제는 세포가 분화를 진행하고 있는지 확인하는 데 도움이 되는 분화 마커를 갖는 것입니다. Cdkn1b(p27KIP)는 내이 발달에서 분화를 위한 초기 표지자로 광범위하게 사용되어 왔지만, iMOP 세포에서 Cdkn1b의 발현과 이것이 분화와 어떤 상관관계가 있는지는 다루어지지 않았습니다. 이 연구에서는 현재 배양 조건과 Cdkn1b 발현이 iMOP 분화의 다른 마커와 어떤 상관관계가 있는지 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>CoolCell LX 무알코올 세포 동결 용기</td><td>BioCision</td><td>BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알 (2 ml)&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430654</td><td></td></tr><tr><td>1.5 두께 유리 커버 슬립 (원형 12mm)</td> <td>전자 현미경 과학</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-082</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (PBS) pH 7.4</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)</td><td>Life Technologies</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>B27 보충제 (50X) Serum Free</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1 ml 분취액</td></tr><tr><td>L-Glutamine(200 mM)으로 저장&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>5 ml 분취수로 저장</td></tr><tr><td>Natural Mouse Laminin</td><td>Life Technologies</td><td>23017-015</td><td>1 mg/ml 분주액으로 저장</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10337</td><td></td></tr><tr><td>Synth-A-Freeze 냉동 보존 미디어</td><td>Life Technologies</td><td>A12542-01</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>47743-736</td><td>10 mg/ml 100 &micro로 저장; l 부분 표본</td></tr><tr><td>Moxi Z Mini 자동 세포 카운터</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXZ001</td><td></td></tr><tr><td>Moxi Z 카세트 타입 S</td><td>Orflo&nbsp;</td><td>MXC002</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 섬유아세포 성장 인자, 염기성(bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td>H20에서 0.1% BSA에 재현탁하고 20mg/ml 분취량으로 저장</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P7886</td><td>1X PBS에 재현탁하고 10mg/ml 100 &micro로 저장; l 분취량</td></tr><tr><td>카르베니실린, 디소듐 솔</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP2648-1</td><td>10 mM Hepes pH 7.4에 재현탁 및 100 mg/ml로 분취</td></tr> 5 <tr><td>ml 피펫 개별 포장 페이퍼백 (200/케이스)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 피펫 개별 포장 페이퍼백 (200/케이스)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 처리된 Biolite 24-웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130188</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 처리된 Biolite 6-웰 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 처리된 6cm 접시</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130181&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Millex 멸균 주사기 PVDF 필터 기공 크기: 0.22 & m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 필터 피펫 팁 0.1 - 10 &mu; l 길쭉한 필터 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 필터 피펫 팁 1 - 20 &mu; l 필터 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 필터 피펫 팁 1 - 200 &mu; 엘&nbsp; 필터 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne 필터 피펫 팁 101 - 1000 &mu; l 필터 팁</td><td>USA Scientific</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브 20봉지(500개 튜브)</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔형 튜브 멸균 25개 튜브(500개 튜브) 20봉지USA</td> <td>Scientific</td><td>1500-1211</td><td></td></tr></tbody></table>

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

세포 대체 요법을 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 또는 배아 줄기 세포(ESC)를 사용하는 것은 큰 가능성이 있습니다. 낮은 수율과 분화된 세포의 이질적인 집단을 포함한 몇 가지 한계가 줄기세포 치료의 진행을 방해합니다. 내이 세포 대체 요법을 위한 많은 수의 기능성 유모 세포와 나선 신경절 뉴런(SGN)의 효율적인 분화를 촉진하기 위해 운명적으로 제한된 불멸의 다능성 귀 전구세포(iMOP) 세포주를 생성했습니다. 단일 iMOP 세포의 해리 배양에서 시작하여 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 철회에 의한 세포주기 종료 및 분화를 촉진하는 프로토콜이 설명되었습니다. bFGF 철회 후 증식 세포의 현저한 감소는 EdU 세포 증식 분석을 사용하여 확인되었습니다. 증식의 감소와 동시에 성공적인 분화는 분자 마커의 발현과 형태학적 변화를 초래했습니다. iMOP 유래 이권에서 Cdkn1b(p27KIP) 및 Cdh1(E-cadherin)의 면역염색은 내이 감각 상피로 감별을 위한 지표로 사용되었으며, Cdkn1b 및 Tubb3(신경 세포 β-튜불린)의 면역 염색은 iMOP 유래 뉴런을 식별하는 데 사용되었습니다. iMOP 세포의 사용은 내이 신경감각 전구 세포가 내리는 세포 운명 결정을 이해하는 데 중요한 도구를 제공하며, 많은 수의 iPSC 또는 ESC 유래 유모 세포 및 SGN을 생성하기 위한 프로토콜을 개발하는 데 도움이 됩니다. 이러한 방법은 대체 요법을 위한 이세포 생성 노력을 가속화할 것입니다.

IMOP 세포에서 bFGF의 탈퇴 감소 확산 iMOP 세포의 증식능을 감소시키고 iMOP 세포의 분화를 개시하기 위해,는 bFGF를 배양으로부터 회수 하였다. 성장 인자 철수 증식을 감소 함을 확인하려면, 에듀 통합은 증식 분석으로 사용 하였다. (bFGF를하지 않고) iMOP 문화 미디어 (bFGF를 함유) 및 감각 상피 미디어에서 배양 otospheres 배양 otospheres에서 에듀를 통합 세포의 비율을 비교 하​​였다. Otosphere 문화 수확 및 고정 염기 아날로그 에듀와 펄스했다. 통합 에듀 뉴클레오티드는 형광 Alexafluor 488 지드는 클릭 - 화학을 이용하여 표시 하였다. 의 bFGF의 부재 하에서 성장 otospheres에서 세포의 bFGF (도 1A-F)와 함께 배양 ...

불멸의 다능 난이전구세포(iMOP) 세포와 이암 분화를 유지하기 위한 현재 프로토콜에 대해 설명합니다. 감각 상피(sensory epithelia)와 나선형 신경절 뉴런(spiral ganglion neuron, SGN)으로의 분화를 나타내는 배양 조건과 분자 마커가 강조되어 있습니다.

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

이 절차의 전반적인 목표는 불멸화된 다능성 귀 전구 세포를 내이 세포 유형으로 분화하는 것입니다. 따라서 이 방법은 이삭 전구 세포가 달팽이관 유모 세포 또는 청각 뉴런이 될 수 있는 방법과 같은 청각 재생의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 중요한 것은 이 기술이 생체 내 포유류 동물 모델 시스템과 병행하여 사용할 수 있는 체외 세포 시스템을 제공한다는 것입니다.오늘 제 연구실의 박사후 연구원인 Azadeh Jadali와 연구실의 두 대학원생인 Zhichao Song과 Alejandra Laureano가 절차를 시연할 예정입니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양 배지를 준비한 후 이 액체 3ml를 사용하여 10의 1 곱에서 6번째 불멸의 다능 전구 또는 IMOP 세포를 60mm 조직 배양 접시에 플레이트합니다. 섭씨 37도에서 5-7일 동안 세포를 5%의 이산화탄소로 배양합니다.격일로 신선한 배지를 추가하여 배양액의 액체 부피를 두 배로 늘리십시오. 세포를 계대에 넣으려면 먼저 배양 접시에서 15ml 원추형 튜브로 세포를 옮깁니다. 그런 다음 튜브를 섭씨 37도에서 5분에서 10분 동안 놓습니다.이 기간 동안 이구권을 형성하는 군체가 중력 침전을 통해 원뿔의 바닥에 모일 것으로 예상됩니다. 다음으로, 팔레트를 방해하지 않도록 주의하면서 상층액을 흡입합니다. 0.5 ml의 미리 예열된 1 millimolar EDTA 강화 평형 염 용액 또는 HBSS를 첨가한 다음 2-3회 위아래로 피펫팅하여 이구를 재현탁합니다.이구를 단일 세포로 쉽게 해리하려면 원뿔형을 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣으십시오. 용액을 주기적으로 소용돌이치고 튜브 바닥에 침전물로 이구가 관찰되지 않으면 실온으로 옮깁니다. EDTA를 중화하기 위해 세포에 2ml의 배양 배지를 첨가합니다.그리고 실온에서 200g으로 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 희석된 EDTA 용액을 흡인하고 1x PBS 5ml로 세포를 세척합니다. 동일한 설정을 사용하여 셀을 회전시킨 후 1x PBS를 흡인합니다.다음으로, 원뿔형에 0.5 밀리리터의 배양 배지를 첨가하십시오. 그리고 셀 팔레트를 다시 일시중단합니다. 계수를 위해 IMOP 세포를 배양 배지에서 1-100 개로 희석하십시오.그런 다음 이 용액 75마이크로리터를 미세유체 입자 계수기에 위치한 카세트에 추가하고 세포 수를 결정합니다. 그 후, 앞서 설명한 대로 60mm 조직 배양 접시에 10번

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 작은 분자 기반 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)에 마우스 배아 줄기 세포의 차별 화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 차별화 후 30 일에 의해 고효율 Olig2 + NG2 + OPCs를 생성합니다. 우리는 또한 행동 잠재력을 불 수있다 "급상승"OPCs를 생성하는 방법을 설명합니다.

Oligodendrocyte 엽 성의 전구 물질로 배아 줄기 세포의 분화

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해...

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

이 비디오는 인간 배아 줄기 세포(hESCs)가 영양 세포나 중간 단계를 사용하지 않고 신경 전구 세포로 직접 분화되는 과정을 보여줍니다. 뼈 형태 유전 단백질(BMP)의 선택적 억제와 성장 인자-베타 또는 TGF-β 신호 전달 경로의 변형은 hESC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시킵니다.

인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 생성한 후 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 과정을 보여줍니다. 이러한 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 생성하는 과정은 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환의 연구와 치료를 개선할 수 있는 수많은 길을 열어줍니다.

인간 배아 줄기 세포를 희소돌기아교세포로 분화

이 비디오는 인간 유도 뉴런(iN)과 유도 희소돌기아교세포 전구세포(iOPC)의 공동 배양 확립을 보여줍니다. iNm은 공동 배양에서 iOPC와 혼합된 다음 두 iNm이 뉴런으로, iOPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 것을 지원하기 위해 배양됩니다. 뉴런은 다른 뉴런 및 희소돌기아교세포와 시냅스 연결을 형성하는 반면, 희소돌기아교세포는 뉴런의 축삭돌기 주위에 수초를 발달시킵니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용을 모델링하는 공동 배양 방법

이 동영상은 불멸화된 다능 이암 전구세포(iMOP) 세포가 감각 상피 세포로 분화되는 과정을 보여줍니다. iMOP 세포 배양, 이구 형성, 분화 유도, 형광 현미경을 통해 세포 구성 요소 및 분화 마커를 시각화하여 성공적인 세포 분화를 확인하는 단계를 간략하게 설명합니다.

이(Otic progenitor) 세포를 감각 상피 세포(sensory epithelial cell)로 분화한 후 면역염색(immunostaining)

이 비디오는 불멸화된 다능 이염 전구세포(iMOP)가 나선형 신경절 뉴런(SGN)으로 분화되고 면역형광 기반 분화를 확인하는 방법을 보여줍니다. iMOP는 SGN으로 분화하기 위해 신경 분화 배지에서 배양 기질로 코팅된 커버슬립에 도금됩니다. 분화된 세포는 신경 분화 마커에 특이적인 항체로 표지되고 현미경으로 분석되어 분화를 확인합니다.

불멸화된 다능성 귀 전구세포를 나선형 신경절 뉴런으로 분화시키고 분화 평가

최근 몇 년 동안 체외 배양 방법에서 사용하는 생식 세포의 형성은 체세포 줄기 세포의 여러 가지 유형을 사용하여 증명되었습니다. 이 문서에서는 시각적으로 초기 난 모세포 - 유사 세포로 신생아 마우스 유래 줄기 세포의 분화를 발표 할 예정이다.

세균과 같은 세포로 신생아 마우스 피부 유래 줄기 세포의 분화<em&gt; 체외</em

이 프로토콜은 센다이 바이러스 감염에 의해 신경 줄기 세포를 유도하는 말초 혈액 단핵 세포의 재프로그래밍을 제시, 도파민성 뉴런으로 iNC의 분화, 일방적으로 병변에 DA 전구체의 이식 파킨슨병 마우스 모델, PD 치료를 위한 iNSC 유래 DA 전구체의 안전성 및 효능에 대한 평가.

말초 단핵 세포에서 유도 된 신경 줄기 세포의 생성 및 이식 연구에 대 한 도파민성 신경 전구체로 분화

신경 퇴행의 뉴런-아교 세포 상호 작용은 부적절한 도구와 방법으로 인해 잘 이해되지 않습니다. 여기에서는 인간 만능 줄기 세포에서 유도 뉴런, 희소돌기아교세포 전구세포 및 희소돌기아교세포를 얻기 위한 최적화된 프로토콜을 설명하고 알츠하이머병에서 세포 유형 특이적 기여를 이해하는 데 있어 이러한 방법의 가치에 대한 예를 제공합니다.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

이 프로토콜은 유도만능줄기세포(iPSC)에서 인간 파골세포의 분화를 제시하고 파골세포 및 파골세포 전구체의 특성 분석 방법을 설명합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파골세포의 분화 및 특성화

배우세요 불멸화된 다능성 귀 전구세포(iMOP)를 내이 세포로 분화시키는 방법을. 이 기술은 청각 재생 및 달팽이관 모세포와 청각 신경원 형성 연구에 필수적인 체외 모델을 제공합니다.

불멸화 된 다 능성 귀의 전구 세포의 분화를 초기화

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