Name: 관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 절지동물 단백질 표시 기술을 이용한 분산 및 이동 연구 방법을 ELISA로 검출하는 과정입니다. 이 기법은 생태학 연구에서 곤충 이동 패턴과 침입종 확산을 효율적으로 분석할 수 있게 합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

자금은 농업 및 식품 연구 이니셔티브 경쟁 그랜트 아니에 의해, 부분적으로, USDA CRIS 5347-22620-021-00D에 의해 제공되었다. 식량 농업의 USDA 국립 연구소에서 2011-67009-30141. 우리는 요한나 Nassif의 기술 지원을 감사하고 있습니다. 우리는 또한 그림 3에서 사용 된 사진의 일부를 제공하기 위해 폴 베이커, 데이비드 호튼, 디에고 니에 토와 프랜시스 Sivakoff 감사합니다.

1. 내부 마크, 보존 및 검색 절차 <ol><li> 내부 마킹 절차 <ol><li> 인공 다이어트 또는 필드에서 사육 실험실 식민지에서 (n은 100 개인 ≈) 관심의 곤충을 수집하고 두 깨끗한 사육 용기로 나눕니다. </li><li> 컨테이너 중 하나에 정규 20 ㎖ 다이어트 패킷 (표시되지 않은 음성 대조군 처리)를 놓습니다. , 1.0 ㎎ / ㎖ 닭의 IgG / IGY 용액 1.0 mL를 제 20 ㎖ 인공 다이어트 패킷을 보완 철저하게 혼합, 다른 용기에 넣습니다. 주 : 관심 곤충 인공식이가 없으면 마크 또는 이들이 보통 (예를 들어, 녹색 콩 나방 달걀, 물, 설탕, 꿀)에 유지되어 어떠한 다이어트에 배치 될 수있다. </li><li> 곤충은 24 시간 동안 그들의 먹이 활동을 재개하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 내부 마크 보존 절차 <ol><li> 각 컨테이너에서 다이어트 패킷을 제거하고 승 곤충을 공급다른 음식 소스 i 번째 실험 (예를 들어, 녹색 콩)의 기간 동안을 유지합니다. </li><li> 하루 (또는 임의의 시간 간격으로) 각각의 처리에서 곤충의 코호트 (N = 20)를 수집하고 -20 ℃에서 즉시 동결. </li></ol></li><li> 샌드위치 ELISA 절차 <ol><li> 1 희석 토끼 방지 닭 ​​IGY 차 항체의 50 μl를 추가 트리스 500 깨끗한 ELISA 마이크로 플레이트의 각 웰에 식염수 (TBS)을 버퍼 및 RT (주에서 1 시간의 최소 품어 : 마이크로도 배양 할 수 O / N) 4 ° C에서. </li><li> 판에서 항체를 취소하고 30 분 동안 1.0 % 무 지방 분유 용액 300 μL 잘 각을 차단합니다. </li><li> 이전 배양 단계 기다리는 동안, TBS의 1.0 ㎖로 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 냉동 곤충을 배치합니다. </li><li> 완전히 균질화 될 때까지 깨끗한 유봉 각 곤충을 갈기 및 ELISA의 개별 아니라 각 샘플의 100 μl를 추가플레이트. 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다. </li><li> 각 ELISA 플레이트의 첫 번째 열에 우물 100 (TBS 계란 흰자) 음 (TBS 만 해당)과 긍정적 인 ㎕의 컨트롤을 추가합니다. 또한, 각 플레이트 (그림 1)의 마지막 열에서 8 우물에 부정적인 곤충 컨트롤 (표시되지 않은 곤충)의 100 μl를 추가합니다. 제어 샘플을 1 시간 동안 실온에서 품어하도록 허용합니다. 그림 1에서 제공하는 템플릿은 우리가 우리의 표준화 된 분석에 사용하는 템플릿입니다 있습니다. 웰에서 샘플의 위치는 연구자의 판단에 달려있다. </li><li> 각 웰을 인산염 완충 식염수 (PBS) -tween로 3 회 세척 한 후 토끼 방지 닭의 IgG / IGY 고추 냉이 퍼 옥시 다제 1 희석과 결합의 50 μl를 추가 : 10,000 1 % 우유 솔루션을하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 기판의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 후, 웰을 읽어650 nm의 파장에서 설정된 마이크로 플레이트 분광 광도계. </li></ol></li></ol><img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53693/53693fig1.jpg" /> 도 1의 전형적인 96에 사용 표준화 웰 명칭을 나타내는 개략도 웰 ELISA 마이크로. 각 판은 양의 단백질 제어 (POS Ctrl 키)에게 잘 전용 트리스 완충 염수 음성 대조군 전용 7 웰 (TBS)를 포함하고, 표시되지 않은 (음) 곤충 컨트롤 전용 탈환 곤충 (샘플 1 ... 80), 8 우물에 전념 80 개인 우물 (NEG Ctrl 키 1 ... 8). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53693/53693fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 2. 외부 표시, 보존 및 검색 절차 <ol><li> 외부 마킹 절차 <ol><li> 관심의 곤충 수집 (N 100 ≈2.5 cm 직경 구멍 실험실 콜로니로부터 두 1.0 L를 플라스틱 용기로 필드와 장소에서 개인) 각 용기의 측에서 펀칭. </li><li> 의료 분무기를 사용하여 DH 2 O (음성 대조군 처리)의 1.0 ml의 첫 번째 컨테이너에 곤충 스프레이. 의료 분무기를 사용하여 닭고기 달걀 흰자의 5.0 % 용액 1.0 mL로 두 번째 용기에 곤충 스프레이. </li><li> 표준 실험실 공기 콘센트에 분무기의 호스를 연결 한 다음 컨테이너의 2.5 cm의 구멍에 분무기의 입에 삽입합니다. 분무기가 증기를 생성 할 때까지, 점차적으로 공기 배출구를 켭니다. </li><li> 달걀 흰자위 용액 (약. 2-5 분) 분배 될 때까지 (마킹) 살포를 계속합니다. </li><li> 분무기를 제거하고, 플라스틱 용기의 구멍에 코르크 장소. 솔루션이 완전히 건조 될 때까지 곤충은 실온에서 방치한다. </li></ol></li><li> 외부 마크 보존 절차<ol><li> 마크에 더 이상 노출을 방지하기 위해 별도의 깨끗한 사육 용기에 건조 곤충의 각 처리를 놓습니다. </li><li> 연구 기간 동안 곤충을 유지하기 위해 깨끗한 용기에 음식과 물을 추가합니다. </li><li> 매일 각각의 치료에서 곤충의 코호트를 (N = 20) 수집 및 -20 ° C에서 즉시 동결. </li></ol></li><li> 간접 ELISA 절차 <ol><li> 개별적으로 1.6 ml의 마이크로 원심 튜브에 얼어 붙은 곤충을 놓고 TBS의 1.0 ml를 추가합니다. </li><li> 120 rpm으로 궤도 흔드는 세트에 1 시간 동안 샘플을 만끽 해보세요. </li><li> 단계 1.3.5에 설명 된대로 부정과 긍정적 인 컨트롤을 추가합니다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이, 침지 한 후, 새로운 96 웰 ELISA 플레이트에 80 지정된 샘플 웰 중 하나에 각 시료로부터 100 ㎕의 분취 액을 피펫 샘플을 실온에서 1 시간 동안 배양 허용 (주 :. 마이크로도 될 수있다 배양 O / N 4 ° C에서). </li><li> 와 우물 세 번 씻어PBS-Tween 및 다음도 1 %를 각각 소 혈청 알부민 (BSA-PBS)을 함유하는 인산염 완충 식염수 300 μl를 추가한다. </li><li> 실온에서 30 분 후 PBS-트윈 (tween)로 두 번 씻는다. </li><li> 물론 각 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 8,000 실온에서 1 시간 동안 품어 : 1 희석 토끼 반 달걀 알부민 차 항체의 50 μl를 추가합니다. </li><li> PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척 한 후 1 희석 고추 냉이 과산화 효소와 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 50 μL 추가 : 실온에서 1 시간 동안 PBS-BSA-실 웨트 (0.05 %)에서 2,000. </li><li> PBS-트윈 (tween)와 각 웰을 세 번 세척하고 각 웰에 TMB 기판의 50 μl를 추가합니다. </li><li> 10 분 후, 650 nm 파장으로 설정 마이크로 플레이트 분광 광도계로 웰을 판독. </li></ol></li></ol> 3. 데이터 분석 <ol><li> 아프로 풀링 음성 대조군에 기초한 표준 편차를 각각 ELISA 플레이트 상에 8 대조군 곤충의 평균 흡광도 값을 계산하고 계산M 주어진 연구 (12)의 ELISA 플레이트의 모든. </li><li> ELISA 양성 임계 값을 획득하기 위해 각 ELISA 플레이트에 대해 얻어진 평균 여섯 배 풀링 표준 편차를 추가한다. 이 값 이상 흡광도 값을 산출 상관 곤충 시료 단백질 마크의 존재에 대한 긍정적 인 것으로 간주된다. </li></ol>

이 책에서 상표명 또는 상업적 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공하는 목적으로 만이며, 미국 농무부에 의해 추천이나 보증을 의미하지는 않습니다. USDA는 평등 한 기회를 제공하는 고용 기관입니다.

절지 동물 단백질 immunomarking 절차는 먼저 세기 전 (9)의 4 분의 1 정도를 설명했다. 이후 절차는 내부 및 외부 투여의 IgG / IgYs를 사용 절지 동물의 다양한 분산 패턴을 연구하기 위해 적용되어왔다. 이 단백질은 지금까지 테스트 곤충 종의 다양한에 대한 확고한 마커를 입증했다. 그러나, 전술 한 바와 같이, IgG의 / IgYs를 사용하는 주요 한계는 이들이 매우 비싸다는 것이다. 따라서, IgG의 / IgYs는 MRR 및 곤충의 큰 배치는 작은 공간에 표시 할 수 있습니다 또는 마크가 다이어트 또는 미끼에 통합 될 수 자기 표시 유형 연구에만 유용하다. 여기, 우리는 내부 마크가 닭의 IgG / IGY 풍부 인공 다이어트 곤충의 슈팅이 골대를 공급하여 관리 할 수​​있는 방법의 간단한 데모를 제공했다. 차례대로, IgG에 / IGY는 샌드위치 ELISA를 이용하여 검출 하였다. 이 시스템은 이미 사용을 연구자들에게 특히 유리할 수있다자연스럽게 계란에서 발견 된 IgG의 / IGY를...

자연에서 절지 동물 해충, 천적 (기생 포식자), 및 수분 매개자의 움직임을 추적하는 것은 생태계 서비스를 개선하는 방법에 대한 이해에 필수적이다. 분산 연구의 대부분의 유형에 대한 핵심 요소는 관심의 절지 동물 (들) 태그를 신뢰할 수있는 방법을 가지고있다. 다양한 재료 (예를 들면, 도료, 염료, 착색 먼지, 태그, 희귀 원소, 단백질) 동작, 및 다른 생태 상호 1,2- 먹이, 그 집단의 동력학, 분산 능력을 평가하는 절지 동물을 표시하는 데 사용되어왔다. 주어진 분산 연구에 사용 마커의 적절성의 연구가 진행되고 유형에 의존 할 것이다. (1) 마크 릴리스 탈환 (MRR), (2) 마크 캡처, (3) 자기 마크 캡처 : 절지 동물을 표시하기위한 세 가지 범주화가 있습니다. 마크 릴리스 탈환 조사의 경우, 조사는 일반적으로 laborato에 집합 절지 동물을 표시RY 및 필드 중앙 지점에서 릴리스 그들을. 절지 동물은 다음 다른 수집 장치 (예를 들어, 스위프 그물, 진공, 접착 트랩) 3,4,5를 사용하여 다양한 공간과 시간 간격에서 다시 캡처됩니다. 특정 마크가 기본 개인 해제 구별 할 탈환 표본은 다음 검사합니다. 마크 캡처 연구, 연구자는 일반적으로 필드 사용하는 스프레이 장비 (예를 들어, 배낭 분무기, 붐과 노즐 스프레이)에서 직접 표를 적용한다. 마크 캡처 연구를위한 최적의 마커는 저렴하고 쉽게 절지 동물의 서식지에 적용됩니다. 자기 마크 캡처 연구, 연구자는 보통 절지 동물 미끼 6,7 또는 둥지 입구 8 마크를 적용합니다. 차례로, 절지 동물은 둥지를 빠져 나갈 때까지 마크에 대해 &quot;칫솔질&quot;에 의해 외부에 표시된 미끼 또는 삼키려에 의해 내부적으로 자체를 표시합니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 마커의 많은 유형이 우리를왔다ED는 절지 동물 종의 다양한 태그를. 그러나 거의 이러한 분산 연구 범주의 세 가지 유용하다. 단백질 immunomarking 절차의 개발은 곤충 마킹 돌파구이었다. Immunomarking은 절지 동물에 단백질 라벨을두고 내부적 또는 외부 적으로, 이는 차례로, 항 - 단백질 특정 효소 면역 분석법 (ELISA)에 의해 검출된다. 사용 된 최초의 단백질 마커는 토끼 면역 글로불린 (IgG를) 닭의 IgG / IGY 9,10했다. 그들은 MRR과 자기 마크 캡처 연구 (설명 참조)에 매우 효과적 마크 입증했다. 불행하게도, IgG의 / IGY 단백질은 비용이 많이 드는 때문에 마크 캡처 연구 및 자체 마크 캡처 연구의 대부분의 유형에 대한 실질적인 없습니다. 그 후, 2 세대 단백질 검출 ELISA를 닭 달걀 흰자 (알부민), 우유 (카제인)과 두유 (트립신 억제제 단백질)에 포함 된 단백질을 위해 개발되었다. 각각의 분석은, 매우 민감한 특정, 가장중요한 것은, 훨씬 적은 비용의 IgG / IGY 단백질 (11)보다 단백질을 사용합니다. 이 단백질은 MRR, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 연구 (토론 참조)에 대한 효과가 입증하고있다. 이 글에서, 우리는 기술과 단백질 마크 실험실 보존 연구를 수행하는 방법을 보여줍니다. 이러한 연구는 전계 분산 연구의 모든 유형에 필요한 조사의 첫 단계이다. 연구자가 표시 전에 필드 분산 연구에 착수을 대상 절지 동물 종에 유지됩니다 얼마나 알고 구체적으로는 중요하다. 여기, 우리가 설명하고 내부 및 외부 MRR 곤충, 마크 캡처, 자기 마크 캡처 형 현장 연구를 표시하는 방법을 보여줍니다. 우리는 간접적 샌드위치 ELISA를 함께 표시의 존재를 검출하는 방법을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>식품 저장 용기 (곤충 사육 용)</td> <td>Rubbermaid / Tupperware</td><td>다양한 크기</td><td>다양한 제조업체 및 공급 업체. 메쉬 패브릭이 창에 접착되어 있습니다</td></tr><tr><td>소량 분무기(마이크로 미스트)</td><td>Teleflex-Hudson RCI</td><td>1881</td><td>온라인 및 의료 용품점에서 구입할 수 있습니다. 다른 브랜드도 작동합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 1.6ml w/cap</td><td>Continental Lab Products</td><td>4445.X</td><td>유사한 유형이 모두 작동합니다. 우리는 뚜껑을 쉽게 열 수 있는 브랜드를 선호합니다.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브용 스티로폼 보관 상자(5x20 그리드)</td><td>RPI Corp.</td><td>145746</td><td>이 디자인은 튜브를 붐비지 않기 때문에 좋습니다.</td></tr><tr><td>디스펜서, 리피터</td><td>Eppendorf</td><td>4982000322</td><td>이와 유사한 모든 것이 디스펜싱 속도를 높이는 데 도움이 됩니다.</td></tr><tr><td>유봉, 플라스틱 일회용 티슈 그라인더, 1.5ml</td><td>Kimble Chase</td><td>749521-1500</td><td>다양한 공급업체에서 사용할 수 있습니다. 유봉은 재사용을 위해 세척하고 오토클레이브할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>BD Falcon ELISA 플레이트, 96-웰(평평한 바닥)</td><td>BD</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>Ovation 피펫, 수동(20-200 &마이크로; l)</td> <td>VistaLab</td><td>1057-0200 또는 1070-0200</td><td>유사한 유형이 작동합니다. 이 모델은 인체공학적입니다.</td></tr><tr><td>저장소, 멸균 시약</td><td>VistaLab</td><td>4054-1000</td><td>비슷한 것이 작동합니다.</td></tr><tr><td>전동 피펫, 8채널(50-1,200 & 마이크로; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td>하나의 전자 모델을 선택해야 한다면 이 크기가 가장 유용합니다.</td></tr><tr><td>전동 피펫, 8채널(10-300 &마이크로; l) (Biohit eLine)</td><td>Sartorius</td><td>730361</td><td>비슷한 것이 작동합니다.</td></tr><tr><td>매니폴드, 멀티웰 플레이트 와셔(8-위치, 직선)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z369802&nbsp;</td><td>이와 유사한 모든 것이 수동 플레이트 세척에 적용됩니다.</td></tr><tr><td>흡광도 감지 기능이 있는 마이크로플레이트 리더</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 250</td><td>이와 유사한 모든 것이 작동합니다.</td></tr><tr><td>닭 IgG/IgY</td><td>미국 생물학</td><td>I1903-15R</td><td>다른 출처에서도 구할 수</td></tr> 있습니다: <tr><td>달걀 흰자</td><td>식료품점</td><td>" 올 화이트", " 에그 비터", etc.</td>5ml<td>와 95ml dH2O를 5% 용액에 혼합</td></tr><tr><td>Tris(Trizma Base)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>2.42g/L로</td></tr><tr><td>TBS 염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>29.22g/L로 TBS 및 8.0&nbsp; g&#8288;/&#8288; L PBS</td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성(Na2HPO4))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td>PBS</td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH<>sub2PO4)의</td> <td>경우 Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>0.2g/L PBS</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td> PBS Tween 20<td>의 경우 0.2g/L</td></tr><tr><td>, EIA 등급</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>염이 용해된 후 PBS에 L당 0.5ml를 첨가합니다.</td></tr><tr><td>1% BSA가 함유된 PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3688</td><td>Mix 1 패킷, 토끼에서 생산된 1 L dH2O</td></tr><tr><td>Anti-Chicken IgY(IgG) (전체 분자) 항체 (1:500)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6409</td><td>Mix 100 &micro; 50 ml TBS</td></tr><tr><td>분유, 분유 또는 신선한 우유 (1 %)</td> <td>식료품 점</td><td></td> 믹스 10 g 10 g 1 % 용액 안티 닭 IgY (IgG) (전체 분자) -과산화 효소 항체 1 <td>% 용액 용 1 L dH2O</td></tr><tr><td>토끼 (1 : 10,000)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>A9046</td><td>믹스 100 &micro; </td></tr><tr><td>l 토끼 (1 : 8,000)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>C6534</td><td>묽게 125 &micro에서 생성 된 1 % 우유 안티 닭 계란 알부민 항체의 1 L; l 1 L PBS-BSA</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 IgG 과산화 효소 접합체 (1 : 2,000)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A6154</td>에서 <td>1 L PBS-BSA에 0.5 ml를 희석한 다음 1.3&nbsp; ml Silwet</td></tr><tr><td>Vac-In-Stuff (Silwet L-77) 실리콘-폴리에테르 공중합체</td><td>Lehle Seeds</td><td>VIS-01</td><td>마지막 성분으로 추가</td></tr><tr><td>TMB Microwell One Component Peroxidase Substrate</td><td>SurModics</td><td>TMBW-1000-01</td><td></td></tr></tbody></table>

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

모니터링 절지 동물의 움직임은 종종 더 나은 관련된 인구 역학, 분산 패턴, 기주 식물의 환경 설정 및 기타 생태 학적 상호 작용을 이해하는 것이 필요합니다. 절지 동물은 일반적으로 고유의 마크를 태그에 의해 자연에서 추적 한 다음 다시 수집 그들의 분산 기능을 결정하기 위해 시간과 공간을 통해들을 수 있습니다. 이러한 착색 도료 또는 먼지 등의 실제 물리적 태그 외에, 단백질의 다양한 유형에 대한 생태 학적 연구 절지 마킹하는 데 매우 효과적인 것으로 입증되었다. 단백질은 내부 및 / 또는 외부로 투여 할 수있다. 단백질이어서 특이 단백질 효소 면역 분석법 (ELISA)과 수복 절지 검출 될 수있다. 여기에서 우리는 외부와 내부에 단백질과 절지 동물에 태그를위한 프로토콜을 설명합니다. 간단한 두 실험 예는 증명되어 국소 적으로 단백질이 풍부한 규정 식 및 (2)의 외부 단백질 마크를 제공하여 곤충에게 소개 (1) 내부 단백질 마크의료용 분무기를 사용하여 곤충 pplied. 우리는 다음과 샌드위치 곤충 단백질 마크를 검출하는데 사용될 간접 ELISA 방법을 단계별로 설명 관한 것이다. 이 데모에서는, 마크 릴리스 탈환, 마크 캡처, 연구의 자기 마크 캡처 유형의 절지 동물의 수집 및 단백질 마커 검출의 다양한 측면은 immunomarking 절차가되었습니다 다양한 방법과 함께 설명되어 있습니다 연구 목적의 다양한 적합하도록.

내부 표시 : 내부 마크 보존 시험의 결과는도 2a에 도시되어있다. 계산 된 ELISA 위험 임계 값은 0.054이었다. 전체 (전 4 샘플 날짜가 결합), 단백질없이 처리 된 곤충은 지속적으로 낮은 ELISA 값 (X = 0.038 ± 0.002, N = 80)을 수득 하였다. 반대로, 모든 곤충 단백질 농축 다이어트 일관 강한 ELISA 값 (X = 0.475 ± 0.221, N = 80)을 수득 공급. 외부 표시 : ...

단백질은 분산 연구를 위해 절지동물을 표시하는 데 자주 사용됩니다. 절지동물에 내부 및 외부 단백질 표시를 관리하는 방법이 입증됩니다. 간접 또는 샌드위치 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통한 단백질 마크 검출 기술도 설명되어 있습니다.

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

이 데모의 전반적인 목표는 분산 또는 이동 연구를 위해 곤충에 단백질을 표시하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 데모에는 샌드위치 또는 간접 효소 결합 면역 흡착 분석법으로 표시를 감지하는 방법에 대한 방법이 포함되어 있습니다. 이 방법은 곤충 분산 연구 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.곤충 이동 패턴, 곤충 숙주 식물 선호도 및 침입 종의 확산을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 감지 방법이 간단하고 저렴하다는 것입니다. 높은 처리량에 적합하며 동물은 자연 서식지에서 쉽게 직접 표시할 수 있습니다.일반적으로 이 방법을 처음 접하는 사람들은 대부분의 현장 연구자들이 이 간단한 기술에 대한 경험이 없기 때문에 실제보다 더 어려워 보이기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법에 대한 아이디어는 1989 년에 처음 떠올랐습니다. 우리는 인공 사료로 큰 눈을 가진 포식자를 키우고 있었습니다.우리는 이 벌레들이 부자연스러운 식단으로 오랫동안 사육된 후 Lygus 벌레 해충에 효과적인 포식자가 되지 않을 것을 우려했습니다. 다른 말로 하면, 그들은 길들여질 것입니다. 우리는 밭에 방류된 후 원래 품종과 구별할 수 있는 안전하고 효과적이며 저렴한 방법이 필요했습니다.현재 마킹 방법 중 어느 것도 이러한 기준에 부합하지 않습니다. 이전에 ELISA 절차를 사용하여 Lygus 특정 단백질 잔해에 대한 포식자 내장 함량 분석을 수행한 경험을 통해 실험실에서 사육된 포식자에 외부 단백질 표시를 적용해야겠다는 아이디어를 얻었습니다. 차례로, 우리는 Lygus 유해와 외래 단백질 유골에 대해 수집된 밭에서 큰눈박이벌레를 분석할 수 있었습니다.시작하려면 실험실 식민지 또는 현장에서 관심 곤충 약 100마리를 수집하고 두 개의 깨끗한 사육 용기로 나눕니다. 한 용기에 일반 20ml 다이어트 패킷을 넣어 음성 대조군 역할을 합니다. 다른 방법은 다이어트 팩에 닭고기 IgG-IgY 밀리그램을 묶는 것입니다.용액 1ml를 넣고 잘 섞습니다. 필요한 경우 패킷 대신 곤충이 일반적으로 먹이는 것을 사용하십시오. 이 다이어트 패킷으로 사육된 지 24시간이 지나면 두 그룹의 곤충 모두에게 표시가 없는 정상적인 음식을 공급하십시오.원하는 시간 간격으로 각 코호트에서 20마리의 개별 곤충을 수집합니다. 실험에 필요한 모든 코호트가 수집될 때까지 섭씨 영하 20도에서 동결합니다. ELISA를 위한 96웰 플레이트를 준비하기 위해 각 웰에 500분의 1로 희석된 토끼 항닭 IgY 1차 항체 50마이크로리터를 Tris-Buffered Saline 또는 TBS에 추가합니다.적재된 플레이트를 실온에서 최소 한 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 나중에 우물을 비우고 각 우물에 300마이크로리터의 블록 용액을 추가합니다. 이것은 1% 무지방 분유 용액입니다.플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 블록 배양 중에 개별 냉동 곤충을 1ml의 TBS가 적재된 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 깨끗한 유봉으로 각 곤충을 철저히 균질화하십시오.플레이트가 준비되면 각 웰에 100마이크로리터의 균질화된 곤충 샘플 하나를 로드합니다. 각 96웰 플레이트에는 80개의 시편이 수용됩니다. 컨트롤을 위해 플레이트의 첫 번째 열과 마지막 열을 비워 두십시오.첫 번째 열에서 TBS의 100마이크로리터 부분 표본 7개를 단독으로 로드하고 난백자 양성 대조군이 있는 100마이크로리터의 TBS를 1웰에 로드합니다. 마지막 열에서 8개의 표시되지 않은 곤충 제제 100마이크로리터를 로드합니다. 샘플을 실온에서 최소 한 시간 동안 배양합니다.배양 후 Phosphate Buffered Saline Tween 또는 PBS-Tween으로 웰을 조심스럽게 세 번 세척합니다. 우리의 경험을 통해 우리는 대부분의 오류가 세척 단계에서 발생한다는 것을 배웠습니다. 튀는 것은 위양성 반응의 높은 발생으로 이어질 수 있으므로 주의하십시오.세척 후에, 양고추냉이 peroxidase에 활용된 토끼 반대로 닭 IgG-IgY의 50 마이크로리터를 추가하고, 10에 묽게 한 것, 1% 우유 해결책에서 000를 추가하십시오. 용액이 실온에서 최소 1시간 동안 웰에서 배양되도록 합니다. 나중에 이전과 같이 PBS-Tween으로 플레이트를 세 번 씻어냅니다.그런 다음 웰에 50마이크로리터의 TMB 기질을 로드합니다. 즉시 색상이 변하기 시작할 수 있습니다. 플레이트를 10분 동안 배양한 후 마이크로플레이트 분광 광도계로 판독합니다.650나노미터에서 플레이트를 읽고 값을 기록합니다. 곤충을 외부에 표시하려면 접근 구멍이 있는 1리터 플라스틱 병을 준비하고 곤충 100마리를 두 병으로 나눕니다. 그런 다음 한 용기에 곤충에게 1ml의 증류수를 뿌려 네거티브 컨트롤 역할을 합니다.그런 다음 의료용 분무기를 공기 배출구에 부착하고 분무기가 증기를 생성하도록 공기 흐름을 조정합니다. 다른 곤충에게 5% 닭 달걀 흰자 용액 1ml를 뿌립니다. 분무 과정을 완료하는 데 2분에서 5분 정도 걸립니다.그런 다음 구멍을 코르크 마개로 막고 용액을 실온에서 완전히 건조시킵니다. 건조되면 곤충을 표준 식단과 함께 일반 사육 용기로 다시 옮기고 평소와 같이 유지하십시오. 나중에 테스트를 위해 미리 결정된 시간 간격으로 곤충을 수집합니다.외부 마크 유지를 확인하려면 ELISA 분석과 동일한 절차를 사용하여 내부 마크 유지를 테스트하되 약간의 수정을 가합니다. 곤충을 TBS가 있는 마이크로 원심분리기 튜브로 옮긴 후 균질화하는 대신 120RPM의 궤도 셰이커에 한 시간 동안 담가둡니다. 곤충을 담근 후 용액 100마이크로리터를 플레이트 웰에 피펫으로 넣고 플레이트를 최소 한 시간 동안 배양합니다.곤충 샘플을 씻어낸 후 각 웰에 1% BSA가 포함된 PBS 300마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 30분 후 PBS-Tween으로 웰을 두 번 세척합니다. 그런 다음 각 웰에 PBS-BSA 실루엣에서 8,000분의 1로 희석된 토끼 항난자 알부민 1차 항체 50마이크로리터를 추가합니다.적어도 한 시간 동안 플레이트를 배양하고 이전과 같이 우물을 씻어냅니다. 그런 다음 각 웰에 양고추냉이 과산화효소에 접합된 염소 항토끼 IgG 50마이크로리터를 첨가하고 PBS-BSA 실루엣으로 2,000분의 1을 희석합니다. 플레이트를 실온에서 최소 한 시간 동안 배양한 다음 앞에서 설명한 대로 프로토콜을 진행합니다.내부 마크의 유지는 4개의 시점에서 테스트되었습니다. 전반적으로, 단백질 없이 처리한 곤충은 일관되게 낮은 ELISA 값을 산출했습니다. 반면, 단백질이 풍부한 식단을 먹인 모든 곤충은 일관되게 강력한 ELISA 값을 산출했습니다.외부 마크도 4개의 시점에서 테스트되었습니다. 달걀 흰자로 국소적으로 표시된 곤충은 일관되게 강력한 값을 산출했습니다. 예상대로, 물을 뿌린 네거티브 대조군은 매우 낮은 ELISA 값을 기록했습니다.이 비디오를 시청한 후에는 곤충을 표시하는 방법을 잘 이해하고 곤충의 흔적이 있는지 분석해야 합니다. 이 기술을 한 번 익히면 제대로 수행한다면 4시간 30분 안에 끝낼 수 있습니다. 하루 동안 1,000개가 훨씬 넘는 검체가 있는 16개의 분석 플레이트를 처리할 수 있습니다.이 절차를 시도하는 동안 분석이 매우 민감하다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 모든 표면, 용기 및 장비에 단백질 오염이 없어야 합니다. 개발 후 이 기술은 연구자들이 농업, 도시, 숲 및 기타 자연 서식지에서 곤충의 지역 및 지역 전체 분산 패턴을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.우리는 여기에서 소규모의 예를 보여주었지만, 이 기술은 상업용 스프레이 장비를 사용하여 자연 서식지에서 곤충에 직접 태그를 붙이기 위해 훨씬 더 큰 규모로 사용되었습니다. 우리는 공동 작업자의 창의적인 응용 프로그램에 놀랐습니다.

administering-detecting-protein-marks-on-arthropods-for-dispersal

Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이 프로토콜은 clonal 세포 라인 선택과 자신의 동족 GPCRs에 합성 arthropod neuropeptides의 구조 - 활동 관계를 분석하기 위해 칼슘 bioluminescence 분석에 대한 지침을 제공합니다. 이 분석은 합성 아날로그 설계 및 펩타이드 / 약물 리드 발견 수용체 deorphanization 및 구조 - 활동 관계 연구에 사용될 수 있습니다.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

성인 배꼽 orangeworm의 electrophysiological 응답 (측정하여 빠르게 화면 호스트 식물의 휘발성 물질에 대한...

호스트 식물 휘발성 물질에 대한 선별 도구로 Electroantennographic Bioassay

이 동영상은 근접 결찰 분석법(PLA)을 사용하여 초파리 신경근 접합부(NMJ)에서 단백질-단백질 상호 작용의 시각화를 보여줍니다. 체벽을 분리한 후 상호 작용하는 단백질을 1차 항체 및 PLA 접합 2차 항체로 조사합니다. 상호 작용하는 단백질의 근접성은 커넥터 올리고뉴클레오티드와 프로브의 결찰을 용이하게 하여 원형 DNA를 형성한 다음 롤링 서클 증폭에 의해 증폭됩니다. 형광 프로브는 증폭된 DNA에 결합하여 NMJ에서 단백질-단백질 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

Detection of Protein-Protein Interactions in Drosophila larvae using a Proximity Ligation Assay(근접 결찰 분석을 사용한 초파리 유충의 단백질-단백질 상호작용 검출)

이 프로토콜은 근접 내고 분석은 초파리 애벌레 신경 근육 접합부에서 현장 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출 할 수있는 방법을 보여줍니다. 이 기술, 디스크 크고 후진타오 - 리 타이 샤오는 시냅스 지역에서 복잡한, 이전에 공동 면역 통해 식별 관계를 형성하기 위해 표시됩니다.

검출 현장에서 단백질 - 단백질 복합체 초파리 애벌레 신경 근육 접합부

정확 하 게 초파리 조직에서 성적 증명서 또는 단백질을 감지 하는 능력은 그들의 풍부 및 지역화 프로세스와 관련 된 개발을 공부 하 고 중요 합니다. 여기에 번데기 날개를 해 부하는 간단한 프로시저의 설명이 이다. 이 날개는 몇 가지 기법 (immunohistochemistry, PCR 분석 결과, 등)에서 샘플으로 사용할 수 있습니다.

번데기 날개 초파리 Immunodetections 또는 PCR 분석 실험에 적합의 해 부를 신속 하 고 효율적인 방법

이 프로토콜 기존의 컴퓨터를 사용 하 여 기존의 웹 카메라 비디오에서 곤충 안테나 및 코 위치의 프레임별으로 추적을 위한 새로운 소프트웨어, SwarmSight, 사용 하기 위한 단계를 설명 합니다. 무료, 오픈-소스 소프트웨어 프레임 약 120 배를 인간 보다 더 빨리 처리 하 고 이상의 인간의 정확도에서 수행 합니다.

SwarmSight: 곤충 안테나와 일반적인 준비와 기존 하드웨어를 사용 하 여 코 확장 반사의 실시간 추적

우리는 잎과 가지의 끝을 가방에 밀봉하고, 포장 된 물질을 잘라 내고 동결하고, 이전에 냉동 된 물질을 물로 헹구어 기판에서 절지동물을 분리하여 정량화하여 잎 주거 절지동물을 정량화하는 방법을 설명합니다.

단풍 주거 절지동물을 정량화하는 방법

본 프로토콜은 인공 매체를 사용하여 피어싱 빨아 먹는 곤충으로부터 충분한 타액을 수집하는 방법을 설명합니다. 이것은 곤충 타액을 수집하고 곤충 먹이 기법과 벡터 매개 바이러스 전송에 타액 기능을 연구하기위한 편리한 방법입니다.

라오델파엑스 스트리아텔루스 타액 컬렉션을 위한 2층 멤브레인 샌드위치 방법

우리는 후속 분석을 위해 작은 절지동물에서 정량화 가능한 혈림프를 효율적으로 수집하는 방법을 설명합니다.

작은 절지동물에서 체림프를 수집하기 위한 정확하고 정량화 가능한 방법

AC-DC 전기 침투를 사용하여 사람의 손에 있는 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동을 연구하기 위한 절차가 설명되어 있습니다.

인간의 손에 Culex tarsalis 모기의 프로빙 및 섭취 행동 연구를 위한 AC-DC 전기 침투 검사

이 글에서는 시약을 경제적으로 사용하고 소수의 상상 디스크를 쉽게 다룰 수 있는 효율적인 상상 디스크 해부 및 항체 염색 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila melanogaster의 눈-더듬이 및 날개 상상 디스크의 소규모 해부 및 항체 염색

배우세요 절지동물 단백질 표시 기술을 이용한 분산 및 이동 연구 방법을 ELISA로 검출하는 과정입니다. 이 기법은 생태학 연구에서 곤충 이동 패턴과 침입종 확산을 효율적으로 분석할 수 있게 합니다.

관리 및 분산 연구를위한 절지 동물에 단백질 마크를 검출

더 많은 동영상 탐색