마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후

이 기술의 전반적인 목적은 신생 마우스로부터 성별 특이적 해마 성상교세포 농축 배양물을 준비하는 것입니다. 이는 세포 배양 환경에서 생체 내 저산소성 허혈을 모방하기 위해 산소 및 포도당 결핍 후 재산소화를 거친 성상교세포의 성별 특이적 역할을 연구하기 위한 도구로 사용됩니다. 이 방법은 발달 중인 암수 뇌에서 저산소성 허혈 발생 후 해마 성상교세포의 성별 특이적 역할과 관련된 주요 기전 및 중개 연구 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 작은 가위를 사용하여 신생 마우스 새끼의 머리 피부를 후방에서 전방으로 중앙 절개하여 두개골을 노출시킨 후 뇌를 적출하십시오.

목부터 코까지 두개골 정중선을 조심스럽게 절개합니다. 멸균된 평평한 팁의 포셉을 사용하여 두개골을 벗겨냅니다. 곡선형 포셉을 사용하여 뇌간을 제거하고 남은 뇌를 해부 접시에 옮깁니다.

곡선 핀셋을 사용하여 뇌를 뒤집어 복측 표면이 위를 향하게 한 다음, 날카롭고 멸균된 수술용 칼로 양쪽 반구를 분리합니다. 평평한 곡선 핀셋으로 대뇌 반구를 젖히고, 튀어나온 중뇌와 시상 조직을 조심스럽게 제거하여 내측 측두엽에 있는 작은 해마 모양의 구조물인 해마를 노출시킵니다. 양측의 해마 엽을 제거하고, 미세 핀셋으로 당겨 엽 표면에서 뇌막과 섬유아세포를 조심스럽게 제거합니다.

단일 마우스로부터 얻은 양쪽 해마 엽을 약 5 milliliters의 HBSS가 채워진 두 번째 배양 접시로 옮기고 얼음에 둡니다. 날카롭고 멸균된 수술용 칼날을 사용하여 엽을 약 4회 정도 잘게 다집니다. 1 milliliter 멸균 피펫을 사용하여 HBSS와 조직을 50 milliliter 멸균 원심분리 튜브로 옮긴 후, 300 times G에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 0.25% trypsin 3 milliliters를 첨가하고 혼합한 후, 조직을 37 °C에서 20분 동안 가볍게 흔들어주며 배양합니다. 배양 후, 튜브를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 후, 멸균된 유리 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입한 다음, 미리 데워둔 astrocyte plating medium 10 milliliters를 첨가합니다. 화염 처리된 유리 피펫을 사용하여 20~30회 트리투레이션(triturate)합니다. 300 times G에서 5분간 다시 원심분리한 후, 상층액을 흡입하고 astrocyte plating media 2 milliliters를 첨가합니다.

세포 현탁액을 70 micron 메쉬 필터에 걸러 새로운 50 milliliter 원심분리관에 옮깁니다. 3 milliliters의 astrocyte 도말 배지가 들어 있는 코팅된 멸균 T-25 배양 플라스크에 전체 세포 현탁액을 넣습니다. 플라스크를 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 degrees Celsius로 배양합니다.

다음 날, 광학 현미경으로 성상교세포의 합류(confluence) 진행 정도를 관찰하고, 배지를 흡입하여 제거한 후 2 milliliters의 신선한 성상교세포 도말 배지로 교체합니다. 배양 11일(in vitro)경, 배지를 흡입하여 제거하고 2 milliliters의 0.25%trypsin을 첨가하여 합류된 성상교세포를 수확합니다. 플라스크를 조심스럽게 몇 번 회전시킨 후, 멸균된 유리 피펫을 사용하여 trypsin을 흡입합니다.

0.25% trypsin 2 milliliters를 추가로 넣고 플라스크를 실온에서 4-5분 동안 그대로 둡니다. trypsin을 제거한 후, 플라스크를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 10분 동안 넣습니다. 배양 후, astrocyte plating medium 5 milliliters를 추가하고 플라스크를 3~4회 두드려 astrocyte 층을 분리합니다.

플라스크 바닥을 따라 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 완전히 분리시킨 후, 성상교세포를 15 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 튜브를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 다음, 신선한 성상교세포 플레이팅 배지 1 milliliter를 첨가합니다.

세포 현탁액 10 µL를 헤모사이토미터에 넣고, 10배 대물렌즈가 장착된 도립 위상차 현미경을 사용하여 중앙의 큰 격자 영역 내 세포 수를 측정합니다. 성상교세포 도말 배지 2 mL당 세포 수가 약 1 × 10⁵개가 되도록 세포를 희석합니다. 24-웰 배양 접시의 웰 안에 놓인 poly-D-lysine 코팅 유리 커버슬립 위에 세포 현탁액 2 mL를 피펫으로 분주합니다.

5% 이산화탄소 배양기에서 37°C로 배양합니다. 산소 및 포도당 결핍을 시작하려면, 부착성 성상교세포가 포함된 커버슬립에서 배지를 흡입하고 1 mL의 등장성 OGD 용액으로 한 번 헹굽니다. 웰에 0.2 mL의 OGD 용액을 추가하고 저산소 배양기에 넣습니다.

저산소증의 처음 30분 동안은 50 rpm으로 설정된 오비탈 쉐이커로 부드럽게 혼합합니다. 재산소화를 위해 OGD 용액을 2 milliliters의 성상교세포 플레이팅 배지로 교체하고, 5% carbon dioxide와 대기 중 공기가 포함된 37 degrees Celsius에서 5시간 동안 배양합니다. 이 면역형광 이미지는 일차 마우스 해마 성상교세포 배양의 순도를 보여줍니다.

성상교세포 배양물에 면역염색을 실시하여 뉴런 수상돌기 마커인 MAP2를 적색으로, 미세아교세포 마커인 IBA1을 녹색으로 나타내었다. 핵은 DAPI로 염색하여 청색으로 나타난다. 화살표는 미세아교세포 오염을 나타낸다.

정상 산소 조건에서 배양된 해마 성상교세포의 대표적인 면역형광 이미지로, GFAP 면역반응성은 빨간색으로, HIF1-alpha 표시는 초록색으로 나타납니다. 마찬가지로, 핵은 파란색으로 보이는 DAPI로 염색되었습니다. 화살표는 낮은 HIF1-alpha 발현을 나타냅니다.

2시간의 산소 및 포도당 결핍과 5시간의 재산소화 후, HIF1-alpha 핵 발현의 증가를 나타내는 화살표 표시와 같이 배양된 해마 성상교세포에서 HIF1-alpha 발현이 증가했습니다. 수컷 마우스 유래의 해마 성상교세포 배양물에서 산소 및 포도당 결핍과 재산소화 이후 GFAP 발현과 S100b 발현이 상향 조절되었습니다. S100b와 GFAP의 상향 조절은 암컷 마우스에서 얻은 성상교세포에서도 관찰되었습니다.

이 절차 이후에 quantitative PCR, western blotting, siRNA 및 면역조직화학 염색과 같은 다른 방법들을 수행하여, in vitro 허혈 이후 특정 유전자 및 단백질 발현의 성별 특이적 변화와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 본 기술의 개발은 신경과학 분야의 연구자들이 배양된 성상교세포를 연구함으로써 해마에서 뇌졸중의 영향과 결과를 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.