Name: 마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후 인 체외 허혈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 배우세요 신생아 마우스 해마 성상세포를 성별에 따라 분리 배양하여 산소-포도당 결핍과 재산소화로 허혈성 뇌손상을 모델링하는 방법을. 이 기술은 성별 특이적 세포 반응 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NCATS UL1 TR0000427 및 KL2 TR000428(Cengiz P)의 임상 및 중개 과학 상 프로그램, NIH/NCATS의 UW ICTR 및 Waisman Center(Cengiz P)의 자금 및 Waisman Center(Cengiz P)의 자금 UL1TR000427, NINDS(Cengiz P) 및 NIH P30 HD03352(Waisman Center)의 K08 NS088563-01A1, NIH/NINDS 1K08NS078113(Ferrazzano P). GFAP 녹아웃 마우스를 제공해 주신 Albee Messing 박사님께 감사드립니다.

참고 :이 연구는 국립 보건 연구소의 실험 동물의 관리를위한 가이드의 추천 및 사용에 따라 실시 하였다. 동물 프로토콜은 위스콘신 - 매디슨, 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었다. 여기에 제시되는 기본 성상 세포 배양 프로토콜은 장 Y (19) 등. 그리고 젠 기스 20 쪽 등에 의해 제시된 프로토콜에서 채택된다. 일부의 수정. 1. 해마 해부 및 성상 세포 문화 <ol><li> 2 mL의 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 각 가득 얼음에 수술 가위, 부드러운 미세 집게, 플랫 팁 집게, 종이 수건, 쓰레기 봉투, 70 % 에탄올, 2 해부 요리 (3.5 cm 직경)를 포함하여 필요한 모든 시약 및 재료를 준비합니다 . 있는지 확인 수술 장비의이다 (오토 클레이브) 이전 절차와 성상 세포 배지 도금 (다른 모든 재료를 사용하여 멸균 : DMEM + 5 % 말 혈청 +1 % 사전 멸균 등의 페니실린 - 스트렙토 마이신, 말 혈청, HBSS, 0.25 % 트립신, 커버 글라스, 페트리 접시, 50분의 15 ML의 튜브, T25 플라스크 등). </li><li> 부드럽게 유지하고 70 % 에탄올로 머리와 마우스 강아지의 목 스프레이 날카로운 멸균 가위를 사용하여 목을 벨 [그림 1 (1)]. </li><li> 뇌 [그림 1 (2-3)] 노출 두피를 따라 작은 가위로 머리를 전방에 후방에서 중간 선 절개를 수행합니다. </li><li> 작은 가위로 코 목에서 조심스럽게 두개골을 잘라. 그런 두개골베이스에서 두개골을 분리하는 소뇌에 두개골 후각 전구에 앞쪽과 열등를 잘라. </li><li> 두개골의 바닥에 작은 절개를 확인하고 중간 선을 따라 절단. 두개골을 벗겨 멸균 평면 팁 집게를 사용합니다. 곡선 집게의 도움으로 뇌 줄기를 제거합니다. 두개골에서 뇌를 제거하고 첫 해부 접시에 배치 [그림 1 (4-9)] (2)1. </li><li> 곡선 집게를 사용하면, 뇌의 복부면이 위를 향하도록 뇌를 반전하고 날카로운 멸균 수술 블레이드 [그림 1 (10, 11)]와 두 반구를 분리 </li><li> 껍질 다시 대뇌 반구 조심스럽게 해마, 내측 측두엽 [그림 1 (12 ~ 14)]에있는 작은, 해마 모양의 구조를 나타 내기 위해 멸균 평면 곡선 집게로 돌출 중뇌와 시상 조직을 제거합니다. </li><li> 모두 해마 로브 [그림 1 (15, 16)]를 제거하고주의 깊게 미세 집게로 잡아 당겨 로브에서 수막을 해부하다. 이 단계는 수막 세포와 섬유 아세포에 의해 최종 성상 세포 문화의 오염을 방지 할 수 있습니다. </li><li> HBSS로 채워진 두 번째 접시에 준비된 해마 로브를 전송하고 얼음 [그림 1 (17, 18)]에 반환. 하마의 준비를위한 - 한 번의 마우스에서 풀을 모두 해마 로브 (P2 P0)campal의 성상 세포 배양. 이 성상 세포 적절한 밀도를 제공한다. 날카로운 멸균 수술 블레이드 (약 4 시간)을 사용하여 해마 로브를 말하다. </li><li> 대기음 HBSS 15 mL의 멸균 원뿔 튜브로 전송하고 부드러운 흔들림과 함께 20 분 동안 37 ° C에서 조직을 품어, 혼합, 접시에서 1 mL를 피펫에 부착 된 멸균 팁을 사용하고 0.25 % 트립신의 3 mL를 넣고. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 대기음 상등액을 조심스럽게 진공 라인에 연결된 멸균 유리 피펫을 사용. (- 30 ~ 20 배) 조직 조각 균질화 될 때까지 화재 광택 유리 피펫을 사용하여 매체와 씹다 도금 10 ML의 성상 세포를 추가합니다. </li><li> 5 분 300 XG에 원심 분리기 튜브. 기음 뜨는 및 신선한 데워진 성상 세포 도금 미디어의 2 mL를 넣어. 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 70 μm의 메쉬 필터 (셀 스트레이너)를 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 3 mL를 함유하는 폴리 D 라이신 / 라미닌 코팅 멸균 T25 플라스크 배양 접시 전체 세포 현탁액성상 미디어 도금 후, 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 플라스크를 배양한다. </li><li> 기념일에 기음 전체 미디어 내가 N-시험 관내 (DIV) 1, DIV 3 DIV 7, 신선한 성상 세포 도금 미디어의 2 mL로 교체합니다. 성상 세포 도금 미디어를 교체하는 동안 광학 현미경마다 진행 및 성상 세포 합류를 관찰한다. 참고 : DIV 1에서 모든 가능한 성상 세포는 배양 플라스크의 표면과 신경 세포가 뜨는에 떠있다 포함 죽었거나 죽어가는 세포에 부착된다. DIV 3에서, 부착 된 세포는 성상 세포 층을 형성하도록 분할하는 시작한다. 지지 기대 조건이없는 경우, 배양은 신경 세포의 성장이 거의없는 상태이다. 90 % 합류 몇 미세 아교 세포뿐만 아니라 희소 돌기 아교 세포 전구체 셀 성상 층의 상부에 존재 - DIV 7에서 성상 세포 층은 80이다. </li><li> 린스, 플라스크에서 도금 매체를 대기음 신선한 데워진 성상 세포 도금 배지 2 ㎖를 추가성상 세포가 합류하고 배양을 서브 할 준비가되면 차, DIV (11)에 다시 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 플라스크를 몇 번 회전 흡인 트립신은 멸균 유리 피펫을 사용하여, 0.25 % 트립신의 2 ML을 추가합니다. </li><li> 0.25 % 트립신 2 mL를 넣고 플라스크 4의 조직 문화 후드에 앉아 보자 - RT에서 5 분. </li><li> 트립신을 제거하고 10 분 동안 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ° C로 플라스크를 유지한다. 5 ㎖ 중간 도금 성상 세포를 데워진 추가하고 당신의 손의 손바닥에 플라스크를 터치하여 성상 세포 층을 분리 - 완전한 분리를 달성하고 15 ML 원뿔 튜브의 성상 세포를 수집하기 위해 부드러운 저작하여 (3 ~ 4 회). </li><li> 원심 분리기 튜브는 5 분 300 XG에, 뜨는을 대기음, 1 mL의 신선한 성상 세포 도금 매체를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 혈구에 세포 현탁액 10 μL를 추가하고 역 위상차 현미경 (10X 대물 렌즈)를 사용하여 대형 중앙 리딩 된 영역 (1 ㎜ × 2)의 세포 수를 계산. 도난tiply 104 mL로하여 당 세포의 수를 추정한다. 하나 T25 플라스크 ~ 1 × 106 총 해리 세포를 얻을 것입니다. 씨 ~ 1 × 24 웰 배양 접시의 우물에서 12mm 직경 폴리 - D - 라이신 예비 코팅 유리 커버 슬립 2 ML의 성상 세포 도금 배지에서 5 세포. </li><li> 5 % CO 2 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션. 14 (2 절) - DIV 12 OGD / REOX을 수행합니다. </li><li> 미세 아교 세포없는 해마 문화가 원하는 경우 DIV (11)까지 5 MM의 L - 류신 메틸 에스테르 (LME) 하이드로 클로라이드와 DIV 3에서 성상 세포 배양을 취급합니다. LME 배양 한 후, (1 시간 동안 300 rpm으로)을 흔들어에 따라 문화 미세 아교 세포를 오염 제거합니다. 주 : LME는 미세 아교 세포 (22) 증식 제거하는 방법으로 광범위하게 사용 된 소교 세포 독성 제입니다. </li></ol> 2. OGD / REOX 치료 <ol><li> 대기음 부착 성상 세포 배양을 포함하는 커버 슬립의 미디어 (DIV 12-14)와 린스 3 회부드럽게 커버 슬립을 (MM에) 포함 1 mL의 등장 OGD 용액 (pH를 7.4)와 몇 번 잡고 24 웰 배양 접시 돌려 : 0 포도당을, 21의 NaHCO3, 120 염화나트륨, 5.36의 KCl, 0.33 나 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.27 염화칼슘 2, 0.81 황산. </li><li> CO 2 커버 슬립 커버 및 94 % N 2, 1 % O 2를 함유하는 저산소 배양기에서 2 시간 동안 배양하고, 5 % 웰에 0.2 ㎖의 OGD 용액을 추가한다. 부드럽게 가스 교환을 촉진하기 저산소증의 처음 30 분 동안 진탕 기 (50 RPM)로 혼합한다. </li><li> 5.5 mM의 포도당을 첨가 제외한 OGD 용액을 동일한 완충액에서 5 % CO 2 및 대기압에서 2 시간 동안 정상 산소의 대조군 세포를 인큐베이션. </li><li> 및 REOX, 흡인 OGD 솔루션의 매체를 도금 성상 세포의 2 mL를 넣어. 5 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO 2 대기에서 인큐베이션. </li></ol> 3. 면역 세포 화학 염색법 &lt;/ P&gt; <ol><li> 진공 라인에 연결된 멸균 유리 피펫을 사용하여 배양 배지를 흡인하고 신속 0.1 M 트리스 완충액 (TBS) 1ml를 추가하여 커버 슬립을 한번 씻어 (154 mM의 염화나트륨, 16 mM의 후, Trizma 자료, 84 mM 트리스 - 염산, pH 7.4의) 잘합니다. 대기음 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 중 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 2 mL를 넣고. 실온에서 15 분 동안 품어. </li><li> 대기음 및 0.1 M TBS의 1 mL를 넣고는, 다음 2 분 동안 흔들 통에 넣습니다. 3 번 반복합니다. 용액 (10 % 염소 혈청, 0.1 M TBS에서 10 ㎎ / ㎖ BSA, 0.025 % 트리톤 X-100)를 차단 한 ML을 추가하고 흔들 통에 37 ° C에서 30 분 동안 품어. </li><li> 대기음이 솔루션을 차단하고 기본 마우스 단일 클론 항 GFAP 항체 추가 60 분 : 안티 - HIF1α (200 1) 또는 토끼 폴리 클로 날 (1 0.2 mL의 : 차단 솔루션에 500 희석)와 토끼 다 클론 항 S100B (500 1) 흔들 통에 37 ° C에서. </li><li> 마우스 월 : 대안 적으로, 일부 성상은 토끼 다 클론 안티 IBA1 (200 1)와 인큐베이션oclonal 방지 MAP2 문화의 순도에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 대기음 차 항체 0.1 M TBS 1 ㎖를 추가하고 2 분 후 흡인을위한 흔들 통에 넣어 coverslip에 린스. 두 번 반복합니다. </li><li> 흔들 통에 37 ° C에서 60 분 동안 차단 솔루션에 보조 염소 항 - 토끼 488 - 복합 및 항 - 마우스 568 - 복합 항체의 200 희석 : 1의 0.2 ML을 추가합니다. </li><li> 대기음 차 항체와 2 분 후 흡인을위한 흔들 통에 0.1 M TBS 1 ㎖를 추가하고 장소로 coverslip에 린스. 두 번 반복합니다. </li><li> 슬라이드 건조기에 위치 슬라이드에 배치하여 잘 건조에서 커버 슬립을 제거합니다. VECTASHIELD의 한 방울에 반전하여 새 슬라이드 마운트 커버 슬립은 DAPI (1.5 NG / μL)를 설치 매체를 hardset. </li><li> 하나 20X 건조 또는 60X 오일 목표를 사용하여 공 초점 현미경에 이미지 된 커버. DAPI (405 나노 예 / 450 나노 미터 EM) 및 형광 색소 488에 대한 이미지 (X 512 512)를 취득는 GFAP 항체 태그 (488 나노 예 / 515 nm의여자 이름). 20X 및 60X 그룹 내에서 일정한 획득 매개 변수를 유지합니다. </li></ol> PCR을 사용하여 4 성 결정 <ol><li> 열 강아지 발가락 또는 50 mM의 NaOH를 45 분 동안 95 ° C에서 손가락 스크랩와 1 M 트리스, 산도 6.8의 동일한 볼륨으로 중화. </li><li> Myog 및 SRY 유전자에 대한 프라이머의 5 pmole의, 1 배 반응 완충액, 0.2 mM의 각각의 데 옥시 뉴클레오티드와 8 U Taq 중합 효소 : 다음 혼합물의 19 μL에 추출 된 DNA 용액 1 μL를 추가합니다. </li><li> 프라이머 시퀀스를 사용하여; SRY 5&#39;TCATGAGACTGCCAACCACAG3 &#39;, 5&#39;CATGACCACCACCACCACCAA3&#39;와 Myog 5&#39;TTACGTCCATCGTGGACAGC3 &#39;, 5&#39;TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3&#39;23. </li><li> 1 분 동안 72 ° C에서 15 초 동안 58 ° C에서 15 초, 어닐링 95 ℃에서 3 분 동안 변성 한 후 30 사이클을 95 ° C, 신도 다음 PCR 프로토콜을 수행한다. 이 30 사이클 후, 반응물을 1 분 동안 최종 72 ° C의 신장율로 종결. </li><li> 별도의 PCR 제품은 전기 영동에 티듐 브로마이드 함유의 2 % 아가로 오스 겔상에서와 UV 조명 하에서 가시화. (그림 2A.)주의! 에티 디움 브로마이드는 잠재적 인 발암 물질이며주의 깊게 취급 기관의 규정에 따라 적절하게 폐기해야합니다. </li></ol>

<ol><li>Powell, E. M., Geller, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+astrocyte-mediated+cues+in+neuronal+guidance+and+process+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dissection of astrocyte-mediated cues in neuronal guidance and process extension.</a> Glia. 26, 73-83 (1999).</li>
<li>Koehler, R. C., Roman, R. J., Harder, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+and+the+regulation+of+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Astrocytes and the regulation of cerebral blood flow.</a> Trends in neurosciences. 32, 160-169 (2009).</li>
<li>Seifert, G., Schilling, K., Steinhauser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+a+molecular+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Astrocyte dysfunction in neurological disorders: a molecular perspective.</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 194-206 (2006).</li>
<li>Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%3A+an+overview%3A+structure%2C+regulation%2C+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications.</a> Neurobiology of disease. 16, 1-13 (2004).</li>
<li>Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tripartite+synapses%3A+glia%2C+the+unacknowledged+partner%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neurosciences%22%5BJournal%5D)">Tripartite synapses: glia, the unacknowledged partner.</a> Trends in neurosciences. 22, 208-215 (1999).</li>
<li>Anderson, M. A., Ao, Y., Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+reactive+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+letters%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of reactive astrocytes.</a> Neuroscience letters. 565, 23-29 (2014).</li>
<li>Cengiz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Na%2B%2FH%2B+exchanger+isoform+1+is+neuroprotective+in+neonatal+hypoxic+ischemic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+redox+signaling%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Na+/H+ exchanger isoform 1 is neuroprotective in neonatal hypoxic ischemic brain injury.</a> Antioxidants & redox signaling. 14, 1803-1813 (2011).</li>
<li>Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Neonatal brain injury.</a> The New England journal of medicine. 351, 1985-1995 (2004).</li>
<li>Hill, C. A., Fitch, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+mechanisms+and+outcome+of+neonatal+hypoxia-ischemia+in+rodent+models%3A+implications+for+sex-specific+neuroprotection+in+clinical+neonatal+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Sex differences in mechanisms and outcome of neonatal hypoxia-ischemia in rodent models: implications for sex-specific neuroprotection in clinical neonatal practice.</a> Neurol Res Int. , 1-9 (2012).</li>
<li>Cikla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERalpha+Signaling+Is+Required+for+TrkB-Mediated+Hippocampal+Neuroprotection+in+Female+Neonatal+Mice+after+Hypoxic+Ischemic+Encephalopathy%281%2C2%2C3%29%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">ERalpha Signaling Is Required for TrkB-Mediated Hippocampal Neuroprotection in Female Neonatal Mice after Hypoxic Ischemic Encephalopathy(1,2,3).</a> eNeuro. 3, (2016).</li>
<li>Uluc, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrkB+receptor+agonist+7%2C+8+dihydroxyflavone+triggers+profound+gender-+dependent+neuroprotection+in+mice+after+perinatal+hypoxia+and+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">TrkB receptor agonist 7, 8 dihydroxyflavone triggers profound gender- dependent neuroprotection in mice after perinatal hypoxia and ischemia.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 12, 360-370 (2013).</li>
<li>Cikla, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+microglia+activation+after+hypoxia-ischemia+results+in+age-dependent+improvements+in+neurologic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Suppression of microglia activation after hypoxia-ischemia results in age-dependent improvements in neurologic injury.</a> J Neuroimmunol. 291, 18-27 (2016).</li>
<li>McQuillen, P. S., Ferriero, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+in+the+developing+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurol%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability in the developing central nervous system.</a> Pediatr Neurol. 30, 227-235 (2004).</li>
<li>Morken, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+astrocyte-neuronal+interactions+after+hypoxia-ischemia+in+the+neonatal+brain+in+female+and+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%3B+a+journal+of+cerebral+circulation%22%5BJournal%5D)">Altered astrocyte-neuronal interactions after hypoxia-ischemia in the neonatal brain in female and male rats.</a> Stroke; a journal of cerebral circulation. 45, 2777-2785 (2014).</li>
<li>Chisholm, N. C., Sohrabji, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+response+to+cerebral+ischemia+is+influenced+by+sex+differences+and+impaired+by+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+disease%22%5BJournal%5D)">Astrocytic response to cerebral ischemia is influenced by sex differences and impaired by aging.</a> Neurobiology of disease. 85, 245-253 (2016).</li>
<li>Liu, M., Oyarzabal, E. A., Yang, R., Murphy, S. J., Hurn, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+assessing+sex-specific+and+genotype-specific+response+to+injury+in+astrocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for assessing sex-specific and genotype-specific response to injury in astrocyte culture.</a> Journal of neuroscience methods. 171, 214-217 (2008).</li>
<li>Exploring the biological contributions to human health: does sex matter?. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Journal+of+women%27s+health+%26+gender-based%22">Journal of women's health & gender-based</a>. 10, 433-439 (2001).</li>
<li>Collins, F. S., Tabak, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Policy%3A+NIH+plans+to+enhance+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Policy: NIH plans to enhance reproducibility.</a> Nature. 505, 612-613 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-step+induction+of+functional+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid single-step induction of functional neurons from human pluripotent stem cells.</a> Neuron. 78, 785-798 (2013).</li>
<li>Cengiz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+Na%2B%2FH%2B+exchanger+activation+promotes+gliotransmitter+release+from+reactive+hippocampal+astrocytes+following+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Sustained Na+/H+ exchanger activation promotes gliotransmitter release from reactive hippocampal astrocytes following oxygen-glucose deprivation.</a> PloS one. 9, e84294(2014).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150, 128-137 (2006).</li>
<li>McClive, P. J., Sinclair, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+DNA+extraction+and+PCR-sexing+of+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">Rapid DNA extraction and PCR-sexing of mouse embryos.</a> Molecular reproduction and development. 60, 225-226 (2001).</li>
<li>Wolterink-Donselaar, I. G., Meerding, J. M., Fernandes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+gender+determination+in+newborn+dark+pigmented+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A method for gender determination in newborn dark pigmented mice.</a> Lab Anim (NY). 38, 35-38 (2009).</li>
<li>Uliasz, T. F., Hamby, M. E., Jackman, N. A., Hewett, J. A., Hewett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+primary+astrocyte+cultures+devoid+of+contaminating+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of primary astrocyte cultures devoid of contaminating microglia.</a> Methods Mol Biol. 814, 61-79 (2012).</li>
<li>Raponi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100B+expression+defines+a+state+in+which+GFAP-expressing+cells+lose+their+neural+stem+cell+potential+and+acquire+a+more+mature+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">S100B expression defines a state in which GFAP-expressing cells lose their neural stem cell potential and acquire a more mature developmental stage.</a> Glia. 55, 165-177 (2007).</li>
<li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PloS one. 8, e60282(2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., Dixon, K. J., Turnley, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+differences+in+reactivity+of+mouse+and+rat+astrocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Signals%22%5BJournal%5D)">Species differences in reactivity of mouse and rat astrocytes in vitro.</a> Neuro-Signals. 18, 152-163 (2010).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2013).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4 (26), (2007).</li>
</ol>

저자의 아무도는 경쟁하거나 충돌하는 이해했다.

생리적 및 병리 적 조건에서 아스트로 성 특성의 차이 및 기능을 연구하기 위해, 세포 배양에서 거세 일차 성상의 제조 활용하는 중요한 도구이다. 본 연구에서 우리는 체외 신생아에서 성별화 된 해마 성상 세포의 고농축 균질 인구 (P0-P2) C57BL / 6 (야생형) 또는 K19F (GFAP 널) 마우스 새끼 고효율과 문화에 재현 방법을보고합니다. 이 방법을 설정하면 연구자는 시험관 허혈 후 성별화 된 해마 성상 세포의 생리 학적 및 병리학 적 기능을 이해하는 데 도움이됩니다. 단일 세포 현탁액을 달성하기 위해서는 소화 조직 저작하여 트립신 동안 멸균 및 해마 로브 적절한 소화의 유지를 포함하여이 방법을 설정하는 두 개의 중요한 단계가있다. 에서 차 성상 교세포의 예방오염 점점 배양 과정 전반에 걸쳐 가장 큰 도전 중 하나입니다. 적절한 치료를 채용하지 않은 경우 기술을 수행하는 동안 배양 세포 쓸모 렌더링 할 수있는 오염 물질의 두 가지 일...

성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 증거의 성장 몸은 성상 세포의 역할이 신경 지원을 제공보다 더 있음을 나타냅니다. 사실, 생리 학적 조건에서 아스트로 사이트의 역할은, CNS 혈류량이 조절 현상 축삭 (1)의 이동을 안내하는 시냅스 간질 액 (3)의 pH의 항상성을 유지하고, 혈액 뇌 장벽에 참여 같이 매우 복잡 할 수있다 4 시냅스 전달 (5). 병적 인 조건에서 성상 세포는 성상 세포와 기능 (모욕으로부터의 거리에 대한) 형태, 수, 위치, 지형이 이종 방법 6,7에서 변경 될 수있는 반응 astrogliosis라는 과정을 부상으로 반응한다. 아마 신생아의 이환율과 사망률에 기여 신생아 저산소 성 허혈성 뇌증 다음 볼 Astrogliosis <s&gt; 8입니다. 최근의 임상 및 실험적 연구는 뇌 손상의 정도를 비교하여 수형 신생아는 심한 신경 결과 결과 저산소증 / 허혈 (HI) - 관련 뇌 손상의 영향에 더 민감하다 섹스 의존적으로 나타나고 있음을 나타낸다 비교 뇌 손상 9-11와 여성. 부상의 위치 파악은 임신 기간 및 지속 기간 및 모독의 정도에 따라 다르지만, 해마 용어 신생아 HI 후 CNS에서 가장 흔히 영향 영역 중 하나이며, 해마 astrogliosis가 상향 조절로 확인되었다 증가 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 신생아 HI 7,10,12,13 후 3 일. 성상 세포 기능의 성별 차이는 뇌허혈 14, 15 후 모두 신생아와 성인 설치류에 나타내었다. 또한, 체외 허혈에 남성 성상 세포 감수성이 증가 CEL으로 나타났다문화 (16) 여성 대뇌 피질 성상 세포에 비해 리터의 죽음. 성별 차이에-자궁 시작과 죽음 (17)까지 계속. 지난 10 년간, 세포 배양 및 생체 내 연구 실험 조건에서 남녀 등의 중요성은 의학 및 NIH 연구소의 강조는 생리적, 병리 적 상태 (17, 18)을 볼 성별의 차이에 기초 지식을 추구 할 수 있었다 . 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구는 산소가 / 포도당 박탈 (OGD) 및 재산 소화 (REOX), 유도 다음 GFAP 면역 성상 세포의 역할을 평가하기 위해 신생아 쥐에서 농축 성 별 해마 성상 세포 배양을 준비하기 위해 기술을 제공하도록 설계되었습니다세포 배양 환경에서 HI. 이 기술은 정상 산소 및 허혈성 조건 신생아 암수 해마 성상에 속하는 모든 가설을 테스트하기 위해 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Astrocyte culture media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>말 세럼</td><td>Gibco</td><td>26050-070</td><td>최종 농도: 10%</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>30-002-CI</td><td>최종 농도: 1%</td></tr><tr><td>L-Leucine 메틸 에스테르 염산염</td><td>Aldrich</td><td>L1002-25G</td><td>최종 농도: 5mM</td></tr><tr><td>뇌 조직 소화를 위한 용액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14170-088</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>cellgro</td><td>25-050-CI</td><td>최종 농도: 0.25% </td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% (vol/vol) 에탄올</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine (PDL) 12 mm 라운드 커버슬립&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>세포 배양 등급</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA&nbsp;</td><td>생명 기술</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 멸균 세포 여과기&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 페트리 디쉬</td><td>BD 팔콘</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 팔콘 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 팔콘 튜브</td><td>BD 팔콘</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>펜치, 세밀&nbsp;</td><td>Dumont</td><td>2-1032; 2-1033</td><td># 3c; # 5</td></tr><tr><td>펜치, 플랫 팁</td><td>KLS Martin</td><td>12-120-11</td><td></td></tr><tr><td>13cm 수술용 가위</td><td>Aesculap</td><td>BC-140-R</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>A1RSi&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5805000.017</td><td>5804R</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE 4450-1CE</td><td>MaxQ 4450&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>토끼 단클론</td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Sigma</td><td>M2320</td><td>마우스 단클론</td></tr><tr><td>Anti-HIF1alpha</td><td>abcam</td><td>ab179483</td><td>토끼 단클론</td></tr><tr><td>Anti-S100B</td><td>Sigma</td><td>HPA015768</td><td>Rabbit polyclonal</td></tr><tr><td>Anti-GFAP (칵테일)</td><td>Biolegend</td><td>837602</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit (Rabbit IgG)</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6101</td><td>에는 4개의 시약이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 Alexa-Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11070</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 마우스 Alexa-Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후<em&gt; 인 체외</em&gt; 허혈

Sex Differences in Mouse Hippocampal Astrocytes after In-Vitro Ischemia

저산소증 / 국소 빈혈 (HI) - 관련 뇌 손상 다음 Astrogliosis는 신생아의 증가 이환율과 사망률의 역할을한다. 최근의 임상 연구는 뇌 손상의 정도 섹스 의존적으로 나타난 나타내고, 수형 신생아는 유사한 뇌 손상과 여자에 비해 더 심한 신경 결과 결과 HI 관련된 뇌 손상의 영향에 더 민감하다있다. 분리하고 성별화 된 해마 성상 세포의 매우 풍부한 인구를 유지하기 위해 신뢰할 수있는 방법의 개발은 신생아 HI의 병리 결과에서 성별 차이의 세포 기초를 이해하는 것이 필수적이다. 본 연구에서는 재산 소화 하였다 시험관 허혈, 산소 - 글루코스 부족의 모델을 거치게되는 특정한 성별 해마 성상 세포 배양 물을 생성하는 방법을 설명한다. 이후 반응 astrogliosis는 immunostai에 의해 조사 하였다아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) 및 S100B에 대한 닝. 이 방법은 개별적으로, 신생아 HI 다음 남성과 여성의 해마 성상 세포의 역할을 연구하는 유용한 도구를 제공합니다.

생리 학적 또는 병태 생리 학적 조건에서 거세 성상 세포 기능의 역할을 이해하는 것은 대단히 관내 조건 하에서이 세포를 배양하여 규명되었다. 성별화 된 배양을 수행의 중요한 측면은 이전의 사용에 마우스 강아지의 성별을 결정하는 것입니다. 우리는 유전자 PCR에 의해 시각적 평가 (그림 2) (16)에 의해 마우스의 성별을 결정했다. PCR을 사용하여 성 결정의 방법론은 McClive과 싱클레어에서 수정을 채택, 빠르고 간단하고 매우 재현 방법 23.도 2a는 PCR을 사용하여 성 결정의 대표 결과를 보여줍니다. PCR 생성물은 두 개의 대표 P1 남성과 여성의 꼬리 자르는로부터 추출 된 DNA와 함께 생성 하였다. 반응은 441 bp의과 여성과 특이 남성 특정 밴드를 생성 SRY 및 Myog 유전자 다중 프라이머 쌍을 포함...

성상 세포는 중추 신경계 (CNS)에서 가장 중요한 핵심 선수 중 하나이다. 여기서는 후 시험관 허혈 암수 신생아 새끼의 성상 세포 기능의 기초가되는 메카니즘을 연구하기 위해 거세 해마 성상 세포 배양 프로토콜의 구체적인 방법을보고하고있다.

Astrogliosis following hypoxia/ischemia (HI)-related brain injury plays a role in increased morbidity and mortality in neonates. Recent clinical studies ...

이 기술의 전반적인 목적은 신생 마우스로부터 성별 특이적 해마 성상교세포 농축 배양물을 준비하는 것입니다. 이는 세포 배양 환경에서 생체 내 저산소성 허혈을 모방하기 위해 산소 및 포도당 결핍 후 재산소화를 거친 성상교세포의 성별 특이적 역할을 연구하기 위한 도구로 사용됩니다. 이 방법은 발달 중인 암수 뇌에서 저산소성 허혈 발생 후 해마 성상교세포의 성별 특이적 역할과 관련된 주요 기전 및 중개 연구 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 작은 가위를 사용하여 신생 마우스 새끼의 머리 피부를 후방에서 전방으로 중앙 절개하여 두개골을 노출시킨 후 뇌를 적출하십시오.목부터 코까지 두개골 정중선을 조심스럽게 절개합니다. 멸균된 평평한 팁의 포셉을 사용하여 두개골을 벗겨냅니다. 곡선형 포셉을 사용하여 뇌간을 제거하고 남은 뇌를 해부 접시에 옮깁니다.곡선 핀셋을 사용하여 뇌를 뒤집어 복측 표면이 위를 향하게 한 다음, 날카롭고 멸균된 수술용 칼로 양쪽 반구를 분리합니다. 평평한 곡선 핀셋으로 대뇌 반구를 젖히고, 튀어나온 중뇌와 시상 조직을 조심스럽게 제거하여 내측 측두엽에 있는 작은 해마 모양의 구조물인 해마를 노출시킵니다. 양측의 해마 엽을 제거하고, 미세 핀셋으로 당겨 엽 표면에서 뇌막과 섬유아세포를 조심스럽게 제거합니다.단일 마우스로부터 얻은 양쪽 해마 엽을 약 5 milliliters의 HBSS가 채워진 두 번째 배양 접시로 옮기고 얼음에 둡니다. 날카롭고 멸균된 수술용 칼날을 사용하여 엽을 약 4회 정도 잘게 다집니다. 1 milliliter 멸균 피펫을 사용하여 HBSS와 조직을 50 milliliter 멸균 원심분리 튜브로 옮긴 후, 300 times G에서 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후 상층액을 흡입하여 제거합니다. 0.25% trypsin 3 milliliters를 첨가하고 혼합한 후, 조직을 37 °C에서 20분 동안 가볍게 흔들어주며 배양합니다. 배양 후, 튜브를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다.원심분리 후, 멸균된 유리 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 흡입한 다음, 미리 데워둔 astrocyte plating medium 10 milliliters를 첨가합니다. 화염 처리된 유리 피펫을 사용하여 20~30회 트리투레이션(triturate)합니다. 300 times G에서 5분간 다시 원심분리한 후, 상층액을 흡입하고 astrocyte plating media 2 milliliters를 첨가합니다.세포 현탁액을 70 micron 메쉬 필터에 걸러 새로운 50 milliliter 원심분리관에 옮깁니다. 3 milliliters의 astrocyte 도말 배지가 들어 있는 코팅된 멸균 T-25 배양 플라스크에 전체 세포 현탁액을 넣습니다. 플라스크를 5% carbon dioxide 인큐베이터에서 37 degrees Celsius로 배양합니다.다음 날, 광학 현미경으로 성상교세포의 합류(confluence) 진행 정도를 관찰하고, 배지를 흡입하여 제거한 후 2 milliliters의 신선한 성상교세포 도말 배지로 교체합니다. 배양 11일(in vitro)경, 배지를 흡입하여 제거하고 2 milliliters의 0.25%trypsin을 첨가하여 합류된 성상교세포를 수확합니다. 플라스크를 조심스럽게 몇 번 회전시킨 후, 멸균된 유리 피펫을 사용하여 trypsin을 흡입합니다.0.25% trypsin 2 milliliters를 추가로 넣고 플라스크를 실온에서 4-5분 동안 그대로 둡니다. trypsin을 제거한 후, 플라스크를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 10분 동안 넣습니다. 배양 후, astrocyte plating medium 5 milliliters를 추가하고 플라스크를 3~4회 두드려 astrocyte 층을 분리합니다.플라스크 바닥을 따라 세포 현탁액을 부드럽게 파이펫팅하여 완전히 분리시킨 후, 성상교세포를 15 milliliter 원추형 튜브에 수집합니다. 튜브를 300 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡입하여 제거한 다음, 신선한 성상교세포 플레이팅 배지 1 milliliter를 첨가합니다.세포 현탁액 10 µL를 헤모사이토미터에 넣고, 10배 대물렌즈가 장착된 도립 위상차 현미경을 사용하여 중앙의 큰 격자 영역 내 세포 수를 측정합니다. 성상교세포 도말 배지 2 mL당 세포 수가 약 1 × 10⁵개가 되도록 세포를 희석합니다. 24-웰 배양 접시의 웰 안에 놓인 poly-D-lysine 코팅 유리 커버슬립 위에 세포 현탁액 2 mL를 피펫으로 분주합니다.5% 이산화탄소 배양기에서 37°C로 배양합니다. 산소 및 포도당 결핍을 시작하려면, 부착성 성상교세포가 포함된 커버슬립에서 배지를 흡입하고 1 mL의 등장성 OGD 용액으로 한 번 헹굽니다. 웰에 0.2 mL의 OGD 용액을 추가하고 저산소 배양기에 넣습니다.저산소증의 처음 30분 동안은 50 rpm으로 설정된 오비탈 쉐이커로 부드럽게 혼합합니다. 재산소화를 위해 OGD 용액을 2 milliliters의 성상교세포 플레이팅 배지로 교체하고, 5% carbon dioxide와 대기 중 공기가 포함된 37 degrees Celsius에서 5시간 동안 배양합니다. 이 면역형광 이미지는 일차 마우스 해마 성상교세포 배양의 순도를 보여줍니다.성상교세포 배양물에 면역염색을 실시하여 뉴런 수상돌기 마커인 MAP2를 적색으로, 미세아교세포 마커인 IBA1을 녹색으로 나타내었다. 핵은 DAPI로 염색하여 청색으로 나타난다. 화살표는 미세아교세포 오염을 나타낸다.정상 산소 조건에서 배양된 해마 성상교세포의 대표적인 면역형광 이미지로, GFAP 면역반응성은 빨간색으로, HIF1-alpha 표시는 초록색으로 나타납니다. 마찬가지로, 핵은 파란색으로 보이는 DAPI로 염색되었습니다. 화살표는 낮은 HIF1-alpha 발현을 나타냅니다.2시간의 산소 및 포도당 결핍과 5시간의 재산소화 후, HIF1-alpha 핵 발현의 증가를 나타내는 화살표 표시와 같이 배양된 해마 성상교세포에서 HIF1-alpha 발현이 증가했습니다. 수컷 마우스 유래의 해마 성상교세포 배양물에서 산소 및 포도당 결핍과 재산소화 이후 GFAP 발현과 S100b 발현이 상향 조절되었습니다. S100b와 GFAP의 상향 조절은 암컷 마우스에서 얻은 성상교세포에서도 관찰되었습니다.이 절차 이후에 quantitative PCR, western blotting, siRNA 및 면역조직화학 염색과 같은 다른 방법들을 수행하여, in vitro 허혈 이후 특정 유전자 및 단백질 발현의 성별 특이적 변화와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 얻을 수 있습니다. 본 기술의 개발은 신경과학 분야의 연구자들이 배양된 성상교세포를 연구함으로써 해마에서 뇌졸중의 영향과 결과를 탐구할 수 있는 길을 열어줄 것입니다.

sex-differences-mouse-hippocampal-astrocytes-after-vitro

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

출처: Moye, S. L., et.al.  Lucifer Yellow Iontophoresis를 사용한 성상세포 형태 시각화. J. Vis. Exp. (2019).  이 비디오는 고정된 뇌 절편에서 성상세포 형태를 연구하기 위해 형광 염료 이온 영동을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저전압 전류 하에서 음이온성, 친수성 염료를 세포질로 전달하기 위해 전극으로 성상세포체(astrocyte soma)를 뚫는 방법을 자세히 설명하여 염료가 체세포(soma)와 가지를 확산시키고 표지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 표지된 성상세포를 시각화하여 형태학적 통찰력을 제공합니다.

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

일차 분리된 배아 해마 신경 세포 배양은 뉴런 사멸과 관련된 신호 전달 메커니즘을 조사하는 데 유용합니다. 해마의 분리 및 해리 전에 배아를 성별화하면 남성과 여성을 분리하여 배양을 준비할 수 있으며, 이를 통해 연구자는 성별에 따른 세포 신호를 식별하고 조사할 수 있습니다.

허혈성 세포 사멸 경로를 연구하기 위한 성 계층화된 신경 배양

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에​​ 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.

에서 신경 혈관 리모델링의 분석 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화

우리는 신경 발달 기원인지 적자 특징으로 마우스 모델의 공간 학습 작업에 노출 된 다음 해마 신경 세포 활성화의 프로필을 연구하기 위해 면역 조직 화학 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은인지​​ 결핍을 특징으로 두 유전자 또는 약리학 마우스 모델에 적용될 수있다.

신경 발달 장애의 마우스 모델에서 공간 학습 후 해마 신경 세포 활동의 면역 시각화

우리는 출생 후 하루에 일방적인 경 동맥 폐색을 수행 7-10 CD-1 신생아 hypoxic-허 혈 성 (HI) 모델을 만드는 새끼 마우스와 뇌 손상의 영향을 조사. 우리는 운영 되지 않은 정상 쥐에 비해 이러한 마우스 neurobehavioral 함수 공부.

신생아 Hypoxic-허 혈 성 뇌 손상의 마우스 모델에서 Neurobehavioral 평가

본 원고는 마우스 뇌에서 해마 동맥과 모세 혈관을 분리하는 방법과 압력 myography, 면역 형광, 생화학 및 분자 연구를 위해 그들을 가압하는 방법을 자세히 설명합니다.

Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비

이 프로토콜은 마우스 뇌의 자유 부유 조직 절편을 절편화, 염색 및 이미징하는 방법을 설명하고, 이어서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 영역 중첩 또는 타일링의 분석에 대한 상세한 설명을 설명한다.

성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링

이 프로토콜은 마우스 모델에서 경미한 외상성 뇌 손상을 설명합니다. 특히, 경미한 정중선 폐쇄 두부 손상을 유도하기 위한 단계별 프로토콜 및 동물 모델의 특성화가 충분히 설명된다.

생쥐의 경미한 외상성 뇌 손상에 대한 전자기 제어 폐쇄 머리 모델

이 프로토콜은 피질 허혈성 뇌졸중 후 Neurod1의 바이러스 매개 이소성 발현을 설명합니다. Neurod1은 (1) 뇌졸중 후 아급성기(7일) 동안 야생형 마우스에서 Cre-Flex AAV 시스템을 사용하여 전달되고 (2) 뇌졸중 후 만성기(21일) 동안 조건부 리포터 마우스에서 단일 AAV 벡터를 사용하여 전달됩니다.

허혈성 뇌졸중 후 아급성 및 만성 시기에 형질도입된 세포에서 Neurod1의 이소성 발현을 조사하기 위한 AAV 시스템 및 마우스 모델

여기에서는 신생아 마우스에서 다양한 산소 농도로 통제된 환경에서 투여하여 저산소증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 출생 시 산소 변화에 노출된 마우스 모델은 자폐증과 같은 행동 표현형 변화의 유도에 관여하는 miRNA의 발현을 지속적으로 변화시켰습니다.

저산소증은 마우스에서 자폐증 스펙트럼 장애의 비멘델 유전과 관련된 miRNA 수준을 변경합니다.

배우세요 신생아 마우스 해마 성상세포를 성별에 따라 분리 배양하여 산소-포도당 결핍과 재산소화로 허혈성 뇌손상을 모델링하는 방법을. 이 기술은 성별 특이적 세포 반응 메커니즘을 연구하는 데 활용됩니다.

마우스 해마 성상에서 섹스 차이점 후

더 많은 동영상 탐색