쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

배양된 뉴런에서 Filamentous Actin Punta의 정량화의 전반적인 목표는 시냅스 구조의 무결성과 인지성을 연구하는 데 유용한 방법을 소개하는 것입니다. 이 방법은 척추발생, 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 대한 신경 과학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 F-actin puncta 식별 및 정량화에 따라 1차 신경 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제공한다는 것입니다.

달성 목표를 알 수 없는 경우 ratia fundantric structure의 일반적인 무결성을 추정해야 합니다. 우리는 코카인과 같은 남용 약물에 의해 유도 된 뉴런 손상과 tat 및 JP 120과 같은 HIV 독성 단백질을 연구하기 위해 2 밀리리터의 Poly-L lysine 작업 용액 2 밀리리터와 함께 35 밀리미터 유리 바닥 접시를 설정하기 이틀 전에이 방법에 대한 아이디어를 처음 가졌습니다. 그리고 접시를 후드에 밤새 보관하여 살균 상태를 유지하십시오.

다음날 코팅제를 버리고 이중 증류수로 접시를 헹굽니다. 후드 아래에서 접시를 1시간 동안 말리십시오. 그런 다음 각 접시에 2ml의 도금 매체를 옮깁니다.

그리고 접시를 섭씨 37도에서 밤새 배양하고 이산화탄소 5%를 섭취하십시오. 배양 당일, 수확한 뇌를 차가운 HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 핀셋으로 뇌를 고정하고 구부러진 집게를 사용하여 반구를 분리하고 수막을 제거합니다.

전두엽 피질을 분리하고 조각을 멸균 15ml 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브에 2ml의 신선한 HBSS와 20마이크로리터의 트립신 EDTA를 추가하고 실온에서 10-15분 동안 신경 조직을 배양합니다. 몇 분에 한 번씩 부드럽게 소용돌이칩니다.

배양이 끝나면 유리 피펫을 사용하여 오래된 HBSS를 모두 흡인합니다. 그리고 신선한 HBSS로 피질을 두 번 헹굽니다. 두 번째 세척 후 조직을 트립신 억제제에 담그십시오.

잘 섞은 다음 샘플을 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 새 HBSS로 조직을 두 번 씻습니다. 이제 고무 전구가 달린 유리 피펫을 사용하여 뇌 조각을 10-15회 매우 천천히 분쇄합니다.

그런 다음 직경이 감소된 멸균 팁이 장착된 보정된 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 매우 천천히 다시 분쇄합니다. 용액이 균질하면 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양할 수 있도록 사전 코팅된 배양 접시에 적절한 밀도로 세포를 플레이트팅합니다. 24시간 후, 도금 배지를 갓 준비된 완전 성장 혈청이 없는 좁은 기저 배지로 교체합니다.

그리고 세포를 최소 12일에서 14일 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 저밀도 도금은 개별 뉴런을 시각화하는 데 중요합니다. 그리고 뉴런 기저 배지는 세포 배양 내에서 astrocise의 천공을 최소화하는 데 중요합니다.

면역세포화학을 위해 세포를 라벨링하려면 먼저 유리 바닥 세포 배양 접시를 PBS로 두 번 세척합니다. 그런 다음 실온에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다. 그런 다음 PBS 세척을 두 번 합니다.

다음으로, PBS에서 0.1% Triton X 100으로 세포를 5분 동안 투과하고 실온에서 F-actin 특이적 염색으로 표시합니다. 20분 후 PBS로 세포를 두 번 헹구고 10% 정상 염소 혈청으로 비특이적 세포 표면 염색을 차단합니다. 배양이 끝나면 섭씨 4도의 하룻밤 세포에 chicken polyclonal anti-map two 항체를 표시합니다.

다음 날 아침, PBS로 세포를 두 번 헹구고 적절한 2차 항체로 라벨을 붙입니다. 실온에서 2시간 후 PBS로 세포를 다시 헹구고 실온에서 3분 동안 10마이크로리터의 헉스로 라벨을 붙입니다. 그런 다음 PBS로 세포를 마지막으로 두 번 세척하고 100마이크로리터의 퇴색 방지 시약으로 보존합니다.

염색 후 3일 이내에 형광 현미경을 켜고 20 X 대물렌즈를 선택합니다. 다음으로, 현미경 소프트웨어에서 픽셀 이미지 크기를 1600 x 1200으로 설정하고 픽셀당 0.17 미크론 이미지 해상도를 1 X 줌으로 설정합니다. 세포 접시를 현미경 스테이지로 옮깁니다.

그리고 녹색과 적색 형광 채널 아래에 있는 공동 표지된 F-actin map 2 뉴런의 이미지를 획득합니다. 모든 이미지가 얻어졌을 때, 명확하게 정의된 수지상 가지(dendritic arbors)가 있는 녹색, 적색 및 청색 채널의 개별 뉴런에 대한 5개의 이미지를 선택합니다. 그리고 연속 매핑 두 개의 면역형광을 사용하여 두 번째 차수 수지상 분절에서 F-actin이 풍부한 구조를 식별합니다.

선택한 이미지 영역을 가로로 회전합니다. 그리고 영역을 복사하여 새 이미지로 붙여넣습니다. 그런 다음 이미지 배경 형광을 빼고 소프트웨어를 사용하여 밝은 녹색 F-actin puncta의 수를 계산합니다.

훈련된 독립 관찰자를 사용하여 선택한 수지상 세그먼트의 길이를 측정합니다. 그런 다음 puncta 번호와 dendritic segment length 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 관찰자가 선택한 각 세그먼트의 수지상 샤프트에서 평균 염색 강도보다 50% 이상 높은 분홍색 형광 강도를 가진 F-actin 자세 반점을 포함해야 합니다.

마지막으로, 공식에 따라 밀도를 계산하고 데이터를 10미크론의 수상돌림석당 F-actin puncta의 수로 표현합니다. 여기서, 미분 간섭 대비 이미지는 시험관 4일에서 27일째에 태아 쥐의 피질 뉴런 발달에서 관찰되는 형태학적 변화를 보여줍니다. 배양된 쥐의 1차 뉴런이 성숙함에 따라 수상돌기의 길이와 수가 증가하는 것을 주목하십시오.

F-actin의 phalloidin 라벨링은 매우 빠르기 때문에 면역세포화학적 항체 라벨링을 진행하기 전에 시냅토-수지상 네트워크의 무결성을 시각적으로 추정할 수 있습니다. Map2는 손상되지 않은 수상돌기를 염색하여 F-actin puncta가 성상세포와 같은 다른 세포에 국한되지 않고 신경 세포 수상돌기에 위치한다는 것을 확인합니다. 고해상도 이미지에서는 파이 필로포디아(phi filopodia), 척추 돌출부 및 F-액틴 패치를 포함하는 F-액틴이 풍부한 구조를 관찰할 수 있습니다.

HIV 1 tat 유도 시냅토 수지상 손상을 평가하기 위한 이 실험에서 Map2 염색은 HIV 1 tat 치료 후 쥐 피질 뉴런에서 수지상 가지가 더 적고 F-actin이 감소하는 것을 보여주었습니다. 실제로, F-actin puncta는 실험적 치료에 반응하여 증가하거나 감소합니다. 예를 들어, 이 실험에서 배양된 뉴런을 비경쟁적 NMDA 수용체 길항제 메만틴으로 처리했을 때 F-액틴 양성 반점은 밀도가 크게 증가했습니다.

대조적으로, 메스암페타민과 HIV1 탓을 병용한 치료는 F-액틴 반점의 현저한 손실을 초래했다. F-actin Map2 뉴런으로 표시된 석탄의 고해상도 이미지를 획득한 후, 두 명의 훈련된 관찰자가 반점 밀도를 분석하기 위해 두 번째 수상돌기의 세그먼트를 선택하도록 하는 것을 기억하십시오. 개발 후 이 기술은 신경 과학 연구 분야의 연구자들을 위한 길을 열었습니다.

급성 시냅토병증의 모니터링뿐만 아니라 시냅스 회복 및 실험적 신경 복원 과정에 대한 연구도 마찬가지입니다. 이 비디오를 시청한 후에는 신경 수지상 네트워크의 시냅스 무결성을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.