Name: 쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 학습하세요 쥐 대뇌 피질 뉴런에서 F-actin puncta를 정량화하여 시냅스 무결성과 가소성을 평가하는 방법을. 면역세포화학 염색과 형광 현미경을 활용한 이 기술은 신경독성 및 신경보호 약물 효과 연구에 필수적입니다.

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이 작업은 NIH 보조금 DA013137, DA031604 및 HD043680으로 자금을 지원받았습니다. 부분적인 지원은 생물의학-행동과학 분야의 NIH T32 교육 보조금으로 제공되었습니다.

모든 동물 프로토콜을 검토하고 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (보증 번호 : A3049-01)에 의해 승인되었다. 1. 저밀도 배아 신경 문화 <ol><li> 기본 대뇌 피질의 신경 세포 배양을위한 준비 <ol><li> 솔루션 : <ol><li> 10 ml의 보레이트 완충액에 폴리 -L- 리신 5mg을 용해시켜 폴리 -L- 라이신 스톡 용액을 제조 하였다. </li><li> 49 ml의 붕산염 완충액 1 ml의 폴리 - L - 라이신 주식을 희석하여 솔루션을 작동 준비합니다. </li><li> 395 ml의 DH 2 O로 시작하고 모든 재료 (붕사의 1.24 g의 붕산 + 1.9 g)을 추가하여 붕산 완충액, pH가 8.4을 준비합니다. 1 M의 NaOH로 pH를 8.4로 조정합니다. 400 ml의 조정 및 후드 아래에 0.2 μm의 나일론 멤브레인 필터로 필터링 할 수 있습니다. </li><li> 445 ml의 DH 2 O로 시작하는 다른 모든 성분을 추가하여 HBSS 용액의 pH 7.2을 준비합니다 (50 ㎖ 10X HBSS 재고 + 1.2 g HEPES). 1 N 염산, 브리에 의해 7.2의 pH를 조정NG 500 ㎖의 후드 아래에 0.2 ㎛의 나일론 멤브레인 필터로 필터링. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 DMEM / F12 : 도금 매체를 준비합니다. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 필터링. </li><li> 전체 성장 매체를 준비 : 50 ㎖로 Neurobasal 매체에, 보충 교재를 추가 (500 μL 루타 (100X) + 500 μL 포도당 항생제 - 안티 곰팡이 솔루션 (100X의 + 1 ML의 B-27 (50X) + 500 μL) + 100 ㎕의 7.5 % 중탄산 나트륨. 후드 0.2㎛, 나일론 멤브레인 필터로 여과. </li></ol></li><li> 이틀 문화 전 : <ol><li> 2 폴리 - L - 라이신 작업 용액 ㎖의, 그리고 후드 O / N에서 유지와 코트 열두 35mm의 유리 바닥 요리. </li></ol></li><li> 문화 전 어느 날 : <ol><li> DDH 2 O와 빈 코팅 요리에서 에이전트와 린스 요리 후드 아래 시간 동안 건조하도록 허용합니다. </li><li> 10 % 소 태아 혈청 (총 용액의 10 %)와 도금 배지 (DMEM은 / F12를 준비한다. 피펫 2ml의 배지 내로각각의 요리는, 37 O를 C, 5 % CO 2에서 O / N을 품어. 참고 : 배양 할 때 플라스틱 문화 요리를 방지하는 것이 중요하다. 유리 바닥 (반전 현미경) 요리 또는 (직립 현미경) 커버 글라스의 사용은 샤프하고 선명한 이미지를 얻을 수 있습니다. 플라스틱 바닥 접시에 비해 유리 바닥 접시 형광 현미경 동안 원치 않는 색상이나 눈부심을 방지 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li><li> 세포 배양 프로토콜 : <ol><li> HBSS 버퍼 (100 ~ 150 ㎖), 냉장 넣어 100mm 배양 접시, 집게, 가위, 50 ㎖ 튜브 및 후드 UV 빛 아래 15 ml의 튜브. </li><li> 문화 실의 외부 후드 5 % 세보의 치명적인 흡입 임신 쥐를 안락사. </li><li> 70 %의 EtOH 텐트 복부 cavity.Open 태반을 노출 가위를 이용하여 자궁 중간 꼬리로부터 절단하면서 집게를 사용하여 복부의 피부를 소독. </li><li> 8-10 E18 태아를 제거합니다. 놀이터HBSS 솔루션을 포함하는 배양 접시에 8-10 태아를 CE. </li><li> 집게로 태아의 머리 뒤쪽을 잡고, 다음 몸에서 머리를 절단 가위를 사용합니다. HBSS의 5-7 ml를 가득 다른 배양 접시에 넣습니다. 후드에 접시를 전송합니다. </li><li> 차가운 HBSS와 두 개의 추가 100mm 페트리 접시를 입력합니다. </li><li> 껍질 옆으로 두개골, 그리고 HBSS로 가득 찬 새로운 배양 접시에 머리를 특종. </li><li> 다음에 차가운 HBSS로 새로운 배양 접시에 두뇌를 전송, 뇌에서 날카로운 곡선 집게, 별도의 소뇌와 뇌간을 사용합니다. </li><li> 곡선 집게와 반구를 분리, 고정 핀셋을 사용합니다. 수막을 제거; 표시 15 ML의 원심 분리기 튜브에 정면 피질 및 전송 조각을 격리 할 것. </li><li> 신선한 2 ml의 HBSS로 15 ML 튜브를 입력하고 각 15 ML 튜브에 20 μL 트립신 EDTA (0.5 % 트립신 및 5.3 mM의 EDTA.와 10 배 농축 혼합물)를 추가합니다. </li><li> RT에서 10 ~ 15 분을 품어. 부드럽게 관에게 몇 분마다 소용돌이, 정착 허용하지 않습니다. </li><li> AF터 10 ~ 15 분 사용 유리 피펫 오래된 HBSS를 제거하고 새로운 HBSS로 두 번 씻어합니다. </li><li> (2 ml의 HBSS 1 ㎎ / ㎖, 2 mg을 트립신 억제제) 트립신 억제제에 빠져, 잘 혼합하고 5 분 앉아 보자. 신선한 HBSS로 두 번 씻으십시오. </li><li> 다시 보정 피펫 매우 균질해질 때까지 서서히 감소 팁 직경 멸균 팁을 사용 bubbles.Triturate을 피하기 위해 매우 천천히 씹다 뇌 피스 고무 전구 10-15 번 유리 피펫을 사용. </li><li> 전송 원하는 농도에서 세포를 해리에 코팅 된 배양 접시 (50 셀 / mm2 인) 준비된 사전. 37 O C, 5 % CO2에서 O / N을 품어. </li><li> 24 시간 후, 갓 만든 완전한 성장 혈청 무료로 Neurobasal 매체 DMEM / F12 매체를 교체합니다. </li><li> 실험 전에 적어도 12~14일 대해 5 % CO 2 / 95 %의 실내 공기의 가습 인큐베이터에서 항상 세포를 유지한다. 신선한 배지로 Neurobasal 이전 매체의 약 50 %를 교체하는 모든 5-6일 세포를 보완. </li></ol></li></ol> 2. 형광 라벨링 및 면역 세포 화학 주 : 일차 대뇌 피질 세포 배양의 면역 라벨 1 ㎖가 작동 부피 유리 바닥 35mm 세포 배양 접시에서 행했다. <ol><li> 인산염 완충 식염수 산도 7.4 (PBS)로 두 번 유리 바닥 접시를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 15 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 세포를 수정. </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻으 5 분 동안 PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100 Permeabilize 하시려면. </li><li> F - 굴지 특정 얼룩 실온에서 20 분 동안 세포 치료, AlexaFluor 488 Phalloidin의 (1시 40분, 1 ml의 PBS에서 Phalloidin의 25 μL). </li><li> PBS로 두 번 세포를 씻어 1 ~ 2 시간 동안 실온에서 10 % 정상 염소 혈청으로 차단합니다. </li><li> 2 % 정상 염소 혈청과 함께 PBS에서 4 O ℃에서 O / N을 부화 : 닭 항 MAP2 클론 항체 (2500 1) 희석 </li><li> 배양 한 다음, 두 번 PBS에 헹군다. </li><li> 이차 항체 (알렉사 R 희석ED 594 - 복합 염소 항 - 닭 IgG를 (1 : 500) 2 % 정상 염소 혈청와 실온에서 2 시간 동안 품어. </li><li> PBS로 헹구고 10 μL / Hoescht 염료의 요리를 추가합니다. </li><li> RT에서 3 분을 품어 PBS로 2 회 씻는다. 참고 : 3 단계 (F - 굴지 puncta의 계산) 이제 표지 세포가 준비. </li><li> coverslipping 제로 antifade 시약 100 ㎕로 세포 샘플을 보존 및 장기 저장을 위해 어둠 속에서 4 ℃로 유지한다. 참고 : Phalloidin의이 antifade coverslipping 시약으로 보존 할 수 일주 형광까지의 어둠 속에서 4 ℃에서 PBS에서 상대적으로 안정적이다. Phalloidin의 확장 된 스토리지 밖으로 확산 시작할 수 있기 때문에, 최적의 이미지는 염색 후 1-3일를 얻을 수있다. </li></ol> 3. F - 굴지 puncta의 카운팅 <ol><li> 형광 현미경의 전원을 켜고 20 × 목표로 전환합니다. 오픈 현미경 소프트웨어, 1280 × 960 화소의 화상 사이즈에 프로그램을 설정하고, 0.11 배 줌에 7 μm의 / 픽셀 이미지 해상도. </li><li> 빨강, 녹색 (495 ㎚) / (613 ㎚) 형광 채널에서 공동 표지 F - 굴지 / MAP2 뉴런의 이미지를 획득. </li><li> 5 그린 (F - 굴지) / 레드 (MAP2) immunolabeled / 블루 (Hoescht) 명확하게 정의 된 수지상 아버 개별 신경 세포의 형광 이미지를 선택합니다. </li><li> 연속 MAP2의 면역와 두 번째 순서 수지상 세그먼트 (길이 범위 25 ~ 75 μm의)에서 F - 굴지 풍부한 구조를 확인합니다. </li><li> 수평 수준으로 이미지의 선택 영역을 돌립니다. 새로운 이미지로 복사 및 붙여 넣기. </li><li> 각 접시에 대한 일관성을 조정하여, 이미지의 배경을 뺀다. </li><li> 밝은 녹색 F - 굴지 puncta의 카운트 수동으로 훈련 된 독립적 인 관찰자에 의해 선택 수지상 세그먼트의 길이를 추적. 스프레드 시트 파일에 데이터를 보냅니다. </li><li> MAP2는 수상 돌기 레이블의 길이 (L)에 의해 총 F - 굴지 라벨 puncta에 (N)을 나누어 밀도를 계산합니다. F-교류의 수와 같은 고속 데​​이터수상 돌기의 10 μm의 당 주석 puncta의 참고 puncta의 수지상 샤프트 염색의 평균 강도보다 최소한 50 %의 피크 강도 F 액틴 형광 (크기 ≤1.5 것이 μm의) 각각의 선택된 수지상 세그먼트에 포함되었다. </li></ol>

<ol><li>Heller, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemical+anatomy+of+cortical+inhibitory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The biochemical anatomy of cortical inhibitory synapses.</a> PLoS One. 7, e39572(2012).</li>
<li>Craig, A. M., Blackstone, C. D., Huganir, R. L., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+clustering+of+glutamate+and+gamma-aminobutyric+acid+receptors+opposite+terminals+releasing+the+corresponding+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Selective clustering of glutamate and gamma-aminobutyric acid receptors opposite terminals releasing the corresponding neurotransmitters.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 91, 12373-12377 (1994).</li>
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<li>Rao, A., Craig, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+the+actin+cytoskeleton+and+the+postsynaptic+density+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Signaling between the actin cytoskeleton and the postsynaptic density of dendritic spines.</a> Hippocampus. 10 (5), 527-541 (2000).</li>
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</ol>

저자 중 누구도 선언할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜에서는, 우리는 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 쥐의 대뇌 피질의 신경 세포를 배양 설명합니다. 다음으로, 우리는 수지상 변화를 감지 할 Phalloidin의 및 MAP2 염색을 사용합니다. 그 후, 우리는 F - 굴지 puncta의 변화를 정량화하는 전문 소프트웨어를 사용했다. F - 굴지 puncta의 개별 신경 세포의 전체 신경 네트워크가 명확하게 볼 수 있어야 변화를 확인하려면,이 하나의 신경 세포에서 적절한 번째 순서 수지상 세그먼트를 선택할 수 있습니다. 저밀도 도금 개별 뉴런을 시각화뿐 아니라 아교 세포의 존재를 최소화하기 위해 모두 중요하다. 성상 세포는 F - 굴지을 포함하고 신경 세포 마커없이, F - 굴지 긍정적 인 puncta의 분석을 혼동 할 수있다. 저밀도 문화로 Neurobasal 배지의 사용은 세포 배양에서 성상 세포의 증식을 감소 시키는데 도움이된다. 그러나, F-액틴 단백...

본 연구의 주된 목적은 신경 돌기 네트워크 시냅스 무결성 측정 (추정)의 신뢰성있는 방법을 개발하는 것이다. 여기에서 우리는 Phalloidin의 염색 전문 (NIS-요소) 소프트웨어를 사용하여 후속 분석을 수상 돌기의 면역 세포 화학 (ICC) 검출의 조합을 사용하여 기본 쥐 배양 된 신경 세포의 F - 굴지 puncta의 정량화를 설명합니다. 레이블 phallotoxins는 크고 작은 필라멘트 (F-액틴)에 대한 유사한 친 화성을 ​​가지고 있지만, 일부 액틴 항체 1과는 달리, 단량체 구형 액틴 (G-액틴)에 결합하지 않는다. Phalloidin의의 결합 특이성 따라서 세포 이미징 동안 최소한의 배경을 제공 무시할 수있다. Phalloidin의는 일반적으로 Phalloidin의에 의해 F - 굴지의 훨씬 더 강렬한 라벨을 허용 형광 현미경에 대한 세포 단백질을 라벨 사용되는 항체보다 훨씬 작다. 따라서, 뉴런에서 F - 굴지 현지화의 상세한 이미지가 될 수 있습니다레이블 Phalloidin의 사용을 통해 얻을. Phalloidin의 신경 세포 수상 돌기의 (F - 굴지) 염색 성숙 쪽이 아닌 가시 시냅스 2 미숙 한 쪽을 포함하여 수지상 구조의 다양한 표현 이산 &quot;핫스팟&quot;또는 밝은 &quot;puncta에&quot;를 생성합니다. 미성숙 등뼈 얇은 filopodia 패치 형태의 일부 형태를 포함하고 spinogenesis 3의 개시를 나타낼 수있다. 미성숙 가시 및 비 - 가시 패치 PSD95 4 부족하다. 뿐만 아니라 등뼈의 후속 변경뿐만 아니라 추가 수지상 구조에 F - 굴지의 납 생산의 변화, 따라서 synaptodendritic 무결성 5-7을 조사하기위한 중요한 도구 Phalloidin의 제작. 일반적으로, Phalloidin의 양성 (F - 굴지) puncta의의 수는 활성 시냅스 사이의 균형 (흥분성과 억제), 굴지 역학과 시냅스 안정성 (8)을 반영한다. 특정 t을 연구하는 중요하지만치료의 대상이 알려지지 않은 경우에 시냅스 (즉, 흥분성 등뼈)의 씨네마 스테이션 먼저 수지상 구조의 다양한 일반 무결성을 추정 할 필요가있다. F - 굴지는 억제 시냅스, synaptopathy을 나타낼 수 F - 굴지 puncta에의 변경 번호를 포함 돌기 쪽과 다른 구조의 주요 구성 요소이기 때문에. 이 synaptopathy는보다 구체적인 변경에 대한 추가 조사를 할 수있다. 여러 시냅스 유형 / 구조를 검출하기위한 우리의 정량화 방법은 다양한 실험적인 치료 다음과 같은 돌기 시냅스 변화 (증가 및 감소)의 전체 추정치를 산출한다.

<table><tbody><tr><td>35mm 유리 바닥 접시 No. 1.5 커버 글라스</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>Sigma</td><td>B0252</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>100X</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>VWR</td><td>101174Y</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H4641</td><td>10X</td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>항생제-항진균제 솔루션</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>아이리스 집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 집게</td><td>세계 정밀 기기</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 펜치</td><td>월드 정밀 기기</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488 Phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Life Technologies</td><td>26050-070</td><td></td></tr><tr><td>Chicken polyclonal anti-MAP2</td><td>abcam</td><td>Ab92434</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11042</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue 라이브 셀 염색 ReadyProbes 시약 Hoescht 33342</td><td>Life Technologies</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 소프트웨어 패키지</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E 반전 형광 컴퓨터 제어 현미경&nbsp;</td><td>니콘 인스트루먼트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Nalgene 나일론 멤브레인 필터</td><td>Fishersci</td><td>151-4020</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (f - 굴지) puncta의 정량

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

(F 액틴) 필라멘트 액틴 단백질 spinogenesis 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을한다. 수지상 F - 굴지 풍부한 구조의 변화는 시냅스 통합 및 연결에 변경을 제안한다. 여기에서 우리는 F - 굴지 puncta에, 이후의 정량화 기법에 대한 기본 쥐의 대뇌 피질의 뉴런, Phalloidin의 얼룩을 배양하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 먼저, E18 쥐 배아 전두엽는, 저밀도 세포 배양에 적어도 12~14일 체외에서 배양 신경 세포 해리된다. 실험 치료 후, 대뇌 피질의 신경 세포가 AlexaFluor 488 Phalloidin의 염색하고 미세 소관 - 관련 단백질 2 (수지상 F - 굴지 puncta의 레이블을) (MAP2을, 신경 세포와 수지상 무결성을 검증하기 위해). 마지막으로, 전문 소프트웨어 분석하고 무작위로 선택된 신경 세포의 수상 돌기를 정량화하는 데 사용됩니다. F는 액틴 풍부한 구조하는 두 번째 순서 수지상 가지 (길이 범위 25 ~ 75 &amp;에 식별# 181; 연속 MAP2의 면역와 m). 여기에 제시된 프로토콜은 실험 치료 이후 수지상 시냅스 구조의 변화를 조사하기위한 유용한 방법이 될 것입니다.

본 발명의 방법에서, 우리는 첫 번째 문화 쥐 우리가 개별 뉴런의 수상 돌기를 식별 할 수 있습니다 35mm의 유리 바닥 요리 낮은 밀도에서 대뇌 피질의 뉴런. 도 1에있어서, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지 일 4, 6, 10, 시험관 내에서 14, 21 및 27에서 태아 래트 피질 뉴런 개발 형태 변화를 나타낸다. 길이와 수상 돌기의 수는 배양 된 쥐 주 신경 세포의 성숙에 따라 증가합니다. 뉴런은 단지 14 일 숙성 한 후 실험에 사용된다. 수상 및 시냅스 변화를 감지하기 위해, 우리는 수상 돌기의 MAP2 항체 검출을 Phalloidin의 F - 굴지 라벨을 결합한다. F 액틴의 Phalloidin의 라벨링 (20-30 분)이 매우 빠르게되기 때문에 시각적 ICC 항체 표지 (도 2를</st...

필라멘트 액틴(F-actin)은 척추 발생, 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을 합니다. 따라서 F-actin puncta의 정량화는 시냅스 구조의 무결성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 저밀도 1차 피질 신경 세포 배양에서 Phalloidin으로 표지된 F-actin puncta를 정량화하는 절차를 설명합니다.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

배양된 뉴런에서 필라멘트성 액틴 펑타(Filamentous Actin Punta)를 정량화하는 이 실험의 전체적인 목적은 시냅스 구조의 무결성과 인지 능력을 연구하기 위한 유용한 방법을 소개하는 것입니다. 이 방법은 스파인 형성(spinogenesis), 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성과 관련된 신경과학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 F-actin 펑타의 식별 및 정량화에 이어 일차 뉴런 배양을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다는 점입니다.성취 목표가 불분명할 때는 ratia fundantric 구조의 전반적인 무결성을 추정하는 것이 필요합니다. 저희는 처음에 코카인과 같은 약물 남용이나 tat 및 JP 120과 같은 HIV 독성 단백질로 인해 유도된 뉴런 손상을 연구하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 배양을 설정하기 이틀 전, 12개의 35 millimeter 글라스 바닥 디쉬에 2 milliliters의 Poly-L lysine 작업 용액을 코팅하십시오. 그리고 멸균 상태를 유지하기 위해 디쉬를 후드 안에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오.다음 날, 코팅제를 버리고 접시를 2중 증류수로 헹굽니다. 후드 아래에서 접시를 1시간 동안 건조시킵니다. 그 후, 각 접시에 도말 배지 2 mL를 옮깁니다.디쉬를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 당일, 적출한 뇌를 차가운 HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그 다음 핀셋으로 뇌를 고정한 상태에서, 곡선 포셉을 사용하여 뇌반구를 분리하고 뇌막을 제거합니다.전두엽 피질을 분리하여 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브에 옮깁니다. 튜브에 신선한 HBSS 2 milliliters와 trypsin EDTA 20 microliters를 첨가하고, 신경 조직을 상온에서 10 내지 15분 동안 배양합니다. 이때 수 분마다 부드럽게 소용돌이치듯 섞어줍니다.배양 종료 후, 유리 피펫을 사용하여 기존의 HBSS를 모두 흡입하여 제거합니다. 그리고 신선한 HBSS로 피질을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 조직을 트립신 억제제에 담급니다.잘 섞은 후, 상온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 그다음 신선한 HBSS로 조직을 2회 세척합니다. 이제 고무 벌브가 달린 유리 피펫을 사용하여 뇌 조직 조각을 10~15회 매우 천천히 파이펫팅(triturate)합니다.그 후, 직경이 작은 멸균 팁이 장착된 교정된 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 매우 천천히 다시 분쇄합니다. 용액이 균질해지면, 적절한 밀도로 세포를 미리 코팅된 배양 접시에 분주하고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 24시간 후, 분주 배지를 새로 준비한 완전 성장 무혈청 협소 기초 배지로 교체합니다.그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 최소 12~14일 동안 배양합니다. 개별 뉴런을 시각화하기 위해서는 저밀도 플레이팅이 중요합니다. 또한, 세포 배양물 내 성상교세포의 증식을 최소화하는 데 있어 뉴런 기초 배지가 매우 중요합니다.면역세포화학 염색을 위해 세포를 표지하려면, 먼저 유리 바닥 세포 배양 접시를 PBS로 2회 세척합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드로 상온에서 15분 동안 세포를 고정합니다. 이어서 PBS로 2회 세척합니다.다음으로, 0.1% Triton X 100이 포함된 PBS로 5분 동안 세포를 투과화하고, 상온에서 F-actin 특이적 염색 시약으로 라벨링합니다. 20분 후, PBS로 세포를 두 번 헹구고 10% normal goat serum를 사용하여 비특이적인 세포 표면 염색을 차단합니다. 배양 종료 후, 4°C에서 하룻밤 동안 chicken polyclonal anti-map two 항체로 세포를 라벨링합니다.다음 날 아침, PBS로 세포를 2회 세척하고 적절한 2차 항체로 염색합니다. 실온에서 2시간 후, 세포를 다시 PBS로 세척하고 실온에서 10 µL의 huxs로 3분간 염색합니다. 그 다음 PBS로 세포를 마지막으로 2회 더 세척하고 100 µL의 anti-fade 시약으로 보존합니다.염색 후 3일 이내에 형광 현미경을 켜고 20 X 대상을 선택합니다. 다음으로, 현미경 소프트웨어에서 픽셀 이미지 크기를 1600 by 1200으로 설정하고, 픽셀당 0.17 micron의 이미지 해상도를 1 X 줌으로 설정합니다. 세포가 담긴 디쉬를 현미경 스테이지 위로 옮깁니다.녹색 및 적색 형광 채널에서 F-actin과 map 2가 공동 표지된 뉴런의 이미지를 획득하십시오. 모든 이미지가 확보되면, 수지상 돌기 분지가 명확하게 정의된 녹색, 적색, 청색 채널의 개별 뉴런 이미지 5장을 선택하십시오. 그리고 continuous map 2 면역형광 염색을 이용하여 2차 수지상 분절 내의 F-actin 풍부 구조를 식별하십시오.선택한 이미지 영역을 수평으로 회전시키십시오. 그리고 해당 영역을 복사하여 새 이미지로 붙여넣으십시오. 그 다음, 이미지의 배경 형광을 감산하고 소프트웨어를 사용하여 밝은 녹색 F-actin puncta의 수를 측정하십시오.훈련된 독립 관찰자를 통해 선택된 수지상 돌기 분절의 길이를 측정합니다. 그런 다음 puncta 수와 수지상 돌기 분절 길이 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 관찰자가 각 선택된 분절의 수지상 돌기 축 내 평균 염색 강도보다 적어도 50% 이상 높은 분홍색 형광 강도를 가진 F-actin posture puncta를 포함하도록 확인하십시오.마지막으로, 공식에 따라 밀도를 계산하며, 데이터는 수상돌기 10 µm당 F-actin 점의 수로 표기합니다. 여기서 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 영상은 in vitro에서 4일에서 27일 동안 배양된 태아 쥐의 피질 뉴런에서 관찰되는 형태학적 변화를 보여줍니다. 배양된 쥐 일차 뉴런이 성숙함에 따라 수상돌기의 길이와 수가 증가하는 것에 유의하십시오.F-actin의 phalloidin 표지는 매우 빠르게 진행되므로, 면역세포화학적 항체 표지를 진행하기 전에 시냅스-수지상 돌기 네트워크의 무결성을 시각적으로 추정하는 것이 가능합니다. Map2는 손상되지 않은 수지상 돌기를 염색하며, 이를 통해 F-actin 점들이 성상교세포와 같은 다른 세포가 아니라 신경세포의 수지상 돌기에 위치함을 확인해 줍니다. 고해상도 이미지에서는 phi filopodia, 스파인 돌출물 및 F-actin 패치를 포함하는 F-actin 풍부 구조를 관찰할 수 있습니다.HIV-1 Tat 유도 시냅스-수지상 돌기 손상을 평가하는 본 실험에서, Map2 염색 결과 HIV-1 Tat 처리 후 쥐의 피질 뉴런에서 수지상 돌기 분지가 감소하고 F-actin이 줄어든 것이 확인되었습니다. 실제로 F-actin puncta는 실험적 처리에 반응하여 증가하거나 감소합니다. 예를 들어, 본 실험에서 배양된 뉴런에 비경쟁적 NMDA 수용체 길항제인 memantine을 처리했을 때, F-actin 양성 puncta의 밀도가 유의미하게 증가했습니다.대조적으로, methamphetamine와 HIV1 tat을 병용 처리했을 때 F-actin puncta의 유의미한 소실이 나타났다. co-labeled F-actin Map2 뉴런의 고해상도 이미지를 획득한 후, 숙련된 관찰자 두 명이 puncta 밀도 분석을 위해 2차 수지상 돌기 분절을 선택하도록 한다. 이 기술은 개발 이후 신경과학 연구 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어주었다.급성 시냅스 병증의 모니터링뿐만 아니라 시냅스 회복 및 실험적 신경 복원 과정의 연구를 위해서도 활용됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 신경 수지상 돌기 네트워크의 시냅스 무결성을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

quantification-filamentous-actin-f-actin-puncta-rat-cortical

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

의 연결을 성장 원뿔의 가시 끝이 시각화하고 F - 굴지 수치 방법을 설명합니다. 유리 coverslips에 culturing의 뉴런 후, 세포는 사포닌 함유 솔루션 permeabilized 있습니다. 그런 다음, rhodamine - 굴지 포함된 사포닌 버퍼와 짧은 부화는 무료 굴지 가시 종료에 형광 굴지 통합되어 있습니다.

Permeabilized의 연결을 성장 콘스에서 Rhodamine - 굴지와 F - 굴지 이던가 엔드 레이블

이 비디오는 현미경 검사를 위해 쥐 피질 뉴런을 형광 염색하는 절차를 보여줍니다. F-액틴 및 수지상 단백질을 표적으로 하여 구조적 무결성을 분석하고 신경 기능과 건강을 연구하는 데 중요한 F-액틴 밀도를 계산합니다.

쥐 피질 뉴런에서 Filamentous Actin Puncta의 정량화

우리는 동적 세포 돌출부의 길이에 따른 상대 단백질 농도의 반자동 추적을위한 소프트웨어 솔루션을 제시합니다.

동적 세포 돌출부에서 소프트웨어를 이용한 단백질 농도 추적을위한 그래픽 사용자 인터페이스

초기 endosome 함수 F 말라 합에 따라 달라 집니다. 여기, 우리가 설명 체 외에 현미경 기반 분석 결과 nucleation와 테스트 튜브에서 초기 endosomal 막에 F 걸의 중 합을 재구성 하는 따라서 반응의 복잡 한 시리즈가 생화학 및 유전 의무가 렌더링 조작입니다.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

우리는 신경 화학적 및 행동 적 이상을 뒷받침 할 수있는 뉴런과 수지상 척추의 잠재적 인 형태 학적 변화를 평가하는 데 중요한 피라미드 뉴런에 라벨을 지정하고 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

뇌 슬라이스와 기본 세포 배양에서 피라미드 뉴런의 탄도 라벨링

우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

본 프로토콜은 배양된 래트 해마 뉴런 및 3D 구조화된 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축색 초기 분절의 막주기적 골격의 액틴 고리 및 기타 성분을 시각화하고 측정하는 방법을 기술한다.

3D 구조화 조명 현미경(3D-SIM)을 사용하여 축삭 초기 세그먼트의 멤브레인 주기적 골격의 특성 측정

학습하세요 쥐 대뇌 피질 뉴런에서 F-actin puncta를 정량화하여 시냅스 무결성과 가소성을 평가하는 방법을. 면역세포화학 염색과 형광 현미경을 활용한 이 기술은 신경독성 및 신경보호 약물 효과 연구에 필수적입니다.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

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