쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

배양된 뉴런에서 필라멘트성 액틴 펑타(Filamentous Actin Punta)를 정량화하는 이 실험의 전체적인 목적은 시냅스 구조의 무결성과 인지 능력을 연구하기 위한 유용한 방법을 소개하는 것입니다. 이 방법은 스파인 형성(spinogenesis), 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성과 관련된 신경과학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 F-actin 펑타의 식별 및 정량화에 이어 일차 뉴런 배양을 위한 상세한 프로토콜을 제공한다는 점입니다.

성취 목표가 불분명할 때는 ratia fundantric 구조의 전반적인 무결성을 추정하는 것이 필요합니다. 저희는 처음에 코카인과 같은 약물 남용이나 tat 및 JP 120과 같은 HIV 독성 단백질로 인해 유도된 뉴런 손상을 연구하던 중 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다. 배양을 설정하기 이틀 전, 12개의 35 millimeter 글라스 바닥 디쉬에 2 milliliters의 Poly-L lysine 작업 용액을 코팅하십시오. 그리고 멸균 상태를 유지하기 위해 디쉬를 후드 안에 넣고 하룻밤 동안 보관하십시오.

다음 날, 코팅제를 버리고 접시를 2중 증류수로 헹굽니다. 후드 아래에서 접시를 1시간 동안 건조시킵니다. 그 후, 각 접시에 도말 배지 2 mL를 옮깁니다.

디쉬를 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 하룻밤 동안 배양합니다. 배양 당일, 적출한 뇌를 차가운 HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다. 그 다음 핀셋으로 뇌를 고정한 상태에서, 곡선 포셉을 사용하여 뇌반구를 분리하고 뇌막을 제거합니다.

전두엽 피질을 분리하여 멸균된 15 milliliter 원심 분리 튜브에 옮깁니다. 튜브에 신선한 HBSS 2 milliliters와 trypsin EDTA 20 microliters를 첨가하고, 신경 조직을 상온에서 10 내지 15분 동안 배양합니다. 이때 수 분마다 부드럽게 소용돌이치듯 섞어줍니다.

배양 종료 후, 유리 피펫을 사용하여 기존의 HBSS를 모두 흡입하여 제거합니다. 그리고 신선한 HBSS로 피질을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후, 조직을 트립신 억제제에 담급니다.

잘 섞은 후, 상온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 그다음 신선한 HBSS로 조직을 2회 세척합니다. 이제 고무 벌브가 달린 유리 피펫을 사용하여 뇌 조직 조각을 10~15회 매우 천천히 파이펫팅(triturate)합니다.

그 후, 직경이 작은 멸균 팁이 장착된 교정된 피펫을 사용하여 조직 슬러리를 매우 천천히 다시 분쇄합니다. 용액이 균질해지면, 적절한 밀도로 세포를 미리 코팅된 배양 접시에 분주하고 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. 24시간 후, 분주 배지를 새로 준비한 완전 성장 무혈청 협소 기초 배지로 교체합니다.

그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 옮겨 최소 12~14일 동안 배양합니다. 개별 뉴런을 시각화하기 위해서는 저밀도 플레이팅이 중요합니다. 또한, 세포 배양물 내 성상교세포의 증식을 최소화하는 데 있어 뉴런 기초 배지가 매우 중요합니다.

면역세포화학 염색을 위해 세포를 표지하려면, 먼저 유리 바닥 세포 배양 접시를 PBS로 2회 세척합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드로 상온에서 15분 동안 세포를 고정합니다. 이어서 PBS로 2회 세척합니다.

다음으로, 0.1% Triton X 100이 포함된 PBS로 5분 동안 세포를 투과화하고, 상온에서 F-actin 특이적 염색 시약으로 라벨링합니다. 20분 후, PBS로 세포를 두 번 헹구고 10% normal goat serum를 사용하여 비특이적인 세포 표면 염색을 차단합니다. 배양 종료 후, 4°C에서 하룻밤 동안 chicken polyclonal anti-map two 항체로 세포를 라벨링합니다.

다음 날 아침, PBS로 세포를 2회 세척하고 적절한 2차 항체로 염색합니다. 실온에서 2시간 후, 세포를 다시 PBS로 세척하고 실온에서 10 µL의 huxs로 3분간 염색합니다. 그 다음 PBS로 세포를 마지막으로 2회 더 세척하고 100 µL의 anti-fade 시약으로 보존합니다.

염색 후 3일 이내에 형광 현미경을 켜고 20 X 대상을 선택합니다. 다음으로, 현미경 소프트웨어에서 픽셀 이미지 크기를 1600 by 1200으로 설정하고, 픽셀당 0.17 micron의 이미지 해상도를 1 X 줌으로 설정합니다. 세포가 담긴 디쉬를 현미경 스테이지 위로 옮깁니다.

녹색 및 적색 형광 채널에서 F-actin과 map 2가 공동 표지된 뉴런의 이미지를 획득하십시오. 모든 이미지가 확보되면, 수지상 돌기 분지가 명확하게 정의된 녹색, 적색, 청색 채널의 개별 뉴런 이미지 5장을 선택하십시오. 그리고 continuous map 2 면역형광 염색을 이용하여 2차 수지상 분절 내의 F-actin 풍부 구조를 식별하십시오.

선택한 이미지 영역을 수평으로 회전시키십시오. 그리고 해당 영역을 복사하여 새 이미지로 붙여넣으십시오. 그 다음, 이미지의 배경 형광을 감산하고 소프트웨어를 사용하여 밝은 녹색 F-actin puncta의 수를 측정하십시오.

훈련된 독립 관찰자를 통해 선택된 수지상 돌기 분절의 길이를 측정합니다. 그런 다음 puncta 수와 수지상 돌기 분절 길이 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 관찰자가 각 선택된 분절의 수지상 돌기 축 내 평균 염색 강도보다 적어도 50% 이상 높은 분홍색 형광 강도를 가진 F-actin posture puncta를 포함하도록 확인하십시오.

마지막으로, 공식에 따라 밀도를 계산하며, 데이터는 수상돌기 10 µm당 F-actin 점의 수로 표기합니다. 여기서 미분 간섭 대비(differential interference contrast) 영상은 in vitro에서 4일에서 27일 동안 배양된 태아 쥐의 피질 뉴런에서 관찰되는 형태학적 변화를 보여줍니다. 배양된 쥐 일차 뉴런이 성숙함에 따라 수상돌기의 길이와 수가 증가하는 것에 유의하십시오.

F-actin의 phalloidin 표지는 매우 빠르게 진행되므로, 면역세포화학적 항체 표지를 진행하기 전에 시냅스-수지상 돌기 네트워크의 무결성을 시각적으로 추정하는 것이 가능합니다. Map2는 손상되지 않은 수지상 돌기를 염색하며, 이를 통해 F-actin 점들이 성상교세포와 같은 다른 세포가 아니라 신경세포의 수지상 돌기에 위치함을 확인해 줍니다. 고해상도 이미지에서는 phi filopodia, 스파인 돌출물 및 F-actin 패치를 포함하는 F-actin 풍부 구조를 관찰할 수 있습니다.

HIV-1 Tat 유도 시냅스-수지상 돌기 손상을 평가하는 본 실험에서, Map2 염색 결과 HIV-1 Tat 처리 후 쥐의 피질 뉴런에서 수지상 돌기 분지가 감소하고 F-actin이 줄어든 것이 확인되었습니다. 실제로 F-actin puncta는 실험적 처리에 반응하여 증가하거나 감소합니다. 예를 들어, 본 실험에서 배양된 뉴런에 비경쟁적 NMDA 수용체 길항제인 memantine을 처리했을 때, F-actin 양성 puncta의 밀도가 유의미하게 증가했습니다.

대조적으로, methamphetamine와 HIV1 tat을 병용 처리했을 때 F-actin puncta의 유의미한 소실이 나타났다. co-labeled F-actin Map2 뉴런의 고해상도 이미지를 획득한 후, 숙련된 관찰자 두 명이 puncta 밀도 분석을 위해 2차 수지상 돌기 분절을 선택하도록 한다. 이 기술은 개발 이후 신경과학 연구 분야의 연구자들에게 새로운 길을 열어주었다.

급성 시냅스 병증의 모니터링뿐만 아니라 시냅스 회복 및 실험적 신경 복원 과정의 연구를 위해서도 활용됩니다. 이 영상을 시청한 후에는 신경 수지상 돌기 네트워크의 시냅스 무결성을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 개발하는 법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.