May 10th, 2016
결정질 셀룰로오스는 식물 세포벽의 중요한 구성 성분입니다. 그러나 세포 분해능에서 정량화하는 것은 기술적으로 어렵습니다. 여기에서는 시공간 해상도에서 세포벽 구성에 대한 정보를 얻기 위해 편광 기술과 뿌리 단면을 사용하는 방법을 보고합니다.
이 해부학적 단면 준비의 전반적인 목표는 세포 해상도에서 상대 결정 및 셀룰로오스 축적을 정량화하여 일차 애기장대 뿌리의 서로 다른 조직을 직접 비교할 수 있도록 하는 것입니다. 이 방법은 주어진 세포 유형의 세포 구성이 전체 장기 성장에 어떻게 영향을 미치는지와 같은 식물 생리학 및 발달 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 애기장대 종자를 살균 한 후 0.8 % 식물 한천과 0.5XM 배지가 들어있는 플레이트에 멸균 종자를 펴십시오.
파라 필름으로 플레이트를 감싸고 알루미늄 호일로 덮습니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 1-4일 동안 보관하면 균일한 발아를 촉진할 수 있습니다. 그런 다음 플레이트를 Arabidopsis 묘목을 성장시키는 데 적합한 성장 챔버로 옮기고, 한천 배지 위에서 뿌리 성장을 유지하기 위해 플레이트를 수직으로 향하게 하고, 텍스트 프로토콜에 따라 Richardson의 용액을 준비합니다. 사용하기 전에 주사기 구동 0.22 미크론 PVD 필터 장치를 통해 필터링합니다.
다음으로 화학 물질 후드 아래에서 0.5M 나트륨 카코딜레이트 38ml와 글루타르알데히드 2.5ml를 결합하여 50ml의 고정제를 준비합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 Richardson's solution을 고정 용액에 추가하여 최종 고정 용액을 생성합니다. 미리 표시된 플레이트를 사용한 다음 최종 고정 용액 2-3ml를 우물에 넣어 용액이 묘목을 완전히 덮을 수 있도록합니다.
플라스틱 집게를 사용하여 각 우물에 최대 10 개의 묘목을 조심스럽게 옮깁니다. 최소 1박 및 최대 1주일 동안 섭씨 4도의 어둠 속에 보관하기 전에 파라필름을 사용하여 플레이트를 밀봉하십시오. 고정 된 묘목을 탈수시키기 위해 집게를 사용하여 식물을 집어 여기에 나열된 시간 동안 증가하는 에탄올 농도를 포함하는 새로운 표시된 6 개의 우물 플레이트의 우물로 옮깁니다.
작은 유리병에 히스토레신 액화제 1봉지의 내용물과 염기성 수지액 50ml를 섞어 침투매체를 준비합니다. 자석을 삽입하고 교반 플레이트에 용액을 20분 동안 저어줍니다. 6웰 플레이트의 라벨이 부착된 웰에 2-3ml의 침투 매체를 채웁니다.
그런 다음 묘목이 완전히 탈수되면 집게를 사용하여 95% 에탄올 용액에서 침투 매체로 옮기고 배지로 완전히 덮이도록 합니다. 식물 조직으로의 침투를 극대화하기 위해 샘플을 최소 4일 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오. 블록을 준비하려면 각 웰 임베딩 몰드 내부에 샘플 이름이 연필로 표시된 작은 라벨을 놓습니다.
침투 매체 15ml에 경화제 1ml를 첨가하여 매립 매체를 준비합니다. 약 200마이크로리터의 임베딩 매체로 금형에 각 웰의 절반을 채웁니다. 그리고 머리 위 필름 조각을 사용하여 양쪽에 1ml를 추가로 넣어 금형을 덮습니다.
부분 중합이 가능하도록 실온에서 최소 2시간 동안 금형을 배양합니다. 다음으로, 임베딩 매체의 추가 배치를 준비하고 루트 팁이 금형에 배열되는 동안 중합을 피하기 위해 잘 유지하십시오. 작은 접시에 임베딩 배지를 추가하고 배지에 묘목 하나를 놓습니다.
해부 범위 아래에서 메스를 사용하여 각 뿌리 끝을 자른 다음 금형 주변에서 약 2-3mm 떨어진 금형에 매우 조심스럽게 배치하고 전사 섹션의 경우 수직으로, 세로 섹션의 경우 수평으로 배치합니다. 조직을 배열한 후 매립 매체를 사용하여 금형을 완전히 채우고 오버헤드 필름으로 덮습니다. 그런 다음 최소 2시간 동안 실온에서 배양하고 블록을 건조시키기 위해 건조 실리카겔이 있는 건조제에 넣고 실온에서 밤새 그대로 두십시오.
다이아몬드 득점 도구가 장착된 나이프 메이커를 사용하여 유리 도로를 사각형으로 자른 다음 사각형을 대각선으로 잘라 두 개의 나이프를 생산하여 유리 막대에서 유리 나이프를 준비합니다. 두 칼 모두에 날카로운 모서리가 있는지 확인하십시오. 블록을 홀더에 장착합니다.
그런 다음 단일 모서리 산업용 블레이드를 사용하여 뿌리 끝에서 최대 1mm까지 여분의 블록 재료를 제거하여 피라미드 모양을 얻습니다. 모양의 블록을 2-3미크론 너비의 슬라이스로 절단하고 슬라이스를 표시된 유리 슬라이드로 옮깁니다. 그런 다음 조각에 물방울을 추가합니다.
분석된 데이터의 변동성을 최소화하기 위해 너비가 균일한 섹션을 준비하는 것이 중요합니다. 물이 증발할 때까지 낮은 불로 설정된 열 블록에 유리 슬라이드를 놓습니다. 편광 현미경으로 볼 수 있도록 슬라이드를 준비하려면 Richardson의 용액을 원래 용액의 2%로 희석하고 약 1ml를 사용하여 슬라이스를 덮습니다.
그런 다음 샘플을 열 블록에 5초 동안 놓고 증류수를 사용하여 세척합니다. 핫 플레이트의 슬라이드를 건조시킨 후 해부 현미경으로 슬라이스를 관찰하고 마커를 사용하여 슬라이드 뒷면을 표시하여 관심 슬라이스의 위치를 표시합니다. 커버 슬립으로 덮기 전에 100마이크로리터의 장착 매체를 추가하십시오.
텍스트 프로토콜에 따라 이미지를 만들고 분석합니다. 여기에 표시된 것은 Arabidopsis 1차 뿌리의 단면이며, 구성 세포와 비유모 세포, 유모 세포 및 피질을 포함한 조직의 방사형 조직이 있습니다. 이 컨포칼 이미지는 BRI1 돌연변이 배경의 비유모 세포에서 BRI1-GFP 발현을 보여주며, 이는 주변 세포의 단방향 확장과 전체 뿌리 성장을 억제합니다.
여기에서 볼 수 있듯이, 야생형과 비유모 세포에서 BRI1을 발현하는 라인에서 얻은 뿌리의 세로 부분은 전이 영역의 세포와 비교하여 분열 세포에 존재하는 각도의 가변성이 높은 셀룰로오스 미세섬유의 유사한 방향을 나타냈습니다. 이를 통해 여기 단면에서 볼 수 있듯이 두 유전적 배경의 해당 분열 및 신장 세포에서 셀룰로오스 내 결정의 상대적 축적을 비교할 수 있으며 비유모 세포에서 BRI1 발현과 셀룰로오스에서 결정의 높은 국소 축적 사이의 상관관계를 밝힐 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 사용하는 비디오에서는 임베딩 절차 중에 방향이 좋은 루트를 얻는 것이 어렵기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
따라서 단면화를 위해 여러 블록을 준비해야 합니다. 일단 마스터하면 단일 블록 섹션을 2-3시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 셀룰로오스 내 결정의 축적은 세로 단면에 의해 결정되는 바와 같이 셀룰로오스 미세섬유의 방향이 유사한 경우 세포 간에 비슷하다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 비디오를 시청한 후에는 애기장대 묘목을 수정하는 방법과 블록에 삽입하는 방법, 세로 및 가로 뿌리 단면을 준비하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 또한 편광 현미경을 사용하여 얻을 수 있는 데이터에 대한 좋은 통찰력을 가져야 합니다.
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이 연구는 편광광 기술을 사용하여 식물 세포벽의 결정성 셀룰로오스를 세포 수준에서 정량화하는 방법을 제시합니다. 이 접근법을 통해 아라비도프시스 주근의 세포벽 구성을 상세히 분석할 수 있습니다.
High-resolution quantification of crystalline cellulose in Arabidopsis roots enables precise mapping of cell wall modifications at cellular resolution, supporting mechanistic de-risking in plant-based bioproduct pipelines. This approach provides actionable insights into tissue-specific cell wall architecture, informing early discovery and target validation for traits affecting growth and mechanical properties. The method enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in plant biotechnology R&D.
This polarized light-based quantification method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant biotechnology, bridging early mechanistic studies and translational validation.