SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

이 절차의 전반적인 목표는 System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface와 ToF(Time-of-Flight) 2차 이온 질량 분석기를 사용하여 수용액에서 흡착된 단백질 박막을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 생체 분자 및 생체 계면에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 고체 표면에서 흡착된 단백질의 특성화.

이 기술의 주요 장점은 생체 분자가 액체 환경에서 분자 매핑과 함께 현장에서 시작될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 고체-액체 계면에서 생체 분자에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만 단일 암세포, 약물 상호 작용 및 생물막 부착에 대한 조사와 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 5 밀리리터 주사기에 2 밀리리터의 70 % 에탄올 용액을 추출합니다.

주사기를 SALVI 장치의 입구 끝에 연결하고 10분 동안 1ml의 액체를 천천히 주입합니다. 주입이 끝나면 주사기를 제거하고 폴리에테르-에테르-케톤 유니온을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. SALVI 마이크로 채널을 70% 에탄올 용액으로 채워진 상태로 실온에서 4시간 동안 유지합니다.

그런 다음 두 번째 주사기에 멸균 탈이온수를 채웁니다. SALVI의 입구에 연결하고 10분 동안 장치에 탈이온수를 천천히 주입합니다. 주사기를 제거하고 장치의 입구와 출구를 함께 다시 연결하십시오.

단백질 필름을 고정시키려면 먼저 2밀리리터의 피브로넥틴 용액을 주사기에 주입합니다. 주사기를 SALVI 장치의 입구에 연결하고 10분 동안 1ml의 액체를 천천히 주입합니다. 그런 다음 주사기를 제거하고 주입구와 출구를 다시 연결하십시오.

실온에서 12시간 동안 청정 배양 접시에 설정을 배양합니다. 배양 후 10분 동안 1ml의 멸균 탈이온수를 천천히 주입한 다음 주입구를 배출구에 다시 연결합니다. 시작하려면 ToF-SIMS 스테이지를 평평하고 깨끗한 표면에 놓습니다.

실리콘 웨이퍼와 질화규소 멤브레인이 위를 향하도록 하여 SALVI 장치를 스테이지에 놓습니다. 4개의 금속 cl을 사용하여 SALVI 장치를 s에 고정amp조각을 만들고 장치 모서리를 고정하는 금속 조각을 4개의 나사로 금속판에 나사로 고정합니다. 다음으로, 미세유체 채널에 연결된 PFTE 튜브를 부드럽게 말아 올립니다.

4개의 금속 조각과 4개의 나사를 사용하여 뻣뻣한 부분을 고정합니다. 분석 중에 1차 이온 빔을 방해하지 않도록 장치가 스테이지의 열린 공간에 배치되어 있는지 확인하십시오. 다음으로, 나사를 사용하여 패러데이 컵을 스테이지에 장착합니다.

그런 다음 ToF-SIMS 로드록 도어를 열고 도어를 닫기 전에 로딩 플랫폼에 수평으로 스테이지를 설정합니다. 진공 펌프를 켜고 로드록 챔버가 약 10에서 마이너스 6밀리바까지 펌프를 내리도록 합니다. 그런 다음 진공이 안정화되면 약 30분 후에 SALVI 장치를 메인 챔버로 이동합니다.

ToF-SIMS의 기본 이온 빔과 분석기를 조정하여 제조업체에서 권장하는 프로토콜에 따라 약 400나노미터의 공간 분해능을 얻습니다. 다음으로, 광학 현미경을 사용하여 미세유체 채널을 찾으십시오. 광학 이미지 센터를 참조로 사용하고 보조 이온 이미지 센터와 일치하도록 정렬합니다.

샘플이 일반 고체 샘플보다 두껍고 채널의 최상의 초점을 찾기 위해 설정을 조정하기 어렵기 때문에 배우기가 어렵기 때문에 이 단계를 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 각 측정 전에 1킬로전자볼트 산소 빔을 사용하여 약 15초 동안 질화규소 창을 스캔하여 표면 오염을 제거합니다. 또한 전자 플러드 건을 사용하여 모든 측정 중에 표면 전하를 보상합니다.

다음으로, 데이터 수집을 시작하기 전에 포지티브 또는 네거티브 모드를 선택합니다. 모든 측정에서 25 kiloelectronvolt bismuth three plus를 기본 이온 빔으로 사용하십시오. 뎁스 프로파일링을 위해 32 픽셀 x 32 픽셀의 해상도로 직경 약 2마이크로미터의 둥근 영역에서 기본 이온 빔을 스캔합니다.

질화규소 멤브레인을 펀칭하는 데 필요한 시간을 최소화하려면 펄스 폭이 긴 1차 이온 빔을 사용하십시오. 질화규소 멤브레인 펀치 스루 후 약 200초 동안 동일한 전류를 유지하여 2차원 이미지 재구성을 위한 충분한 데이터를 얻습니다. 데이터 수집의 경우, 더 나은 질량 분해능을 가진 스펙트럼을 획득하기 위해 펄스 폭을 80나노초로 줄이십시오.

약 200초 동안 이 획득을 계속합니다. SALVI 미세유체 계면을 사용하여 1차 이온 빔이 수화된 피브로넥틴 필름에 직접 충격을 가할 수 있습니다. 많은 물 클러스터와 아미노산 조각이 ToF-SIMS 질량 분석 데이터로 표시됩니다.

이것은 수화된 단백질 분자를 둘러싸고 내부에 있는 물 분자의 특성에 대한 직접적인 증거를 제공합니다. 여기서, 수화된 피브로넥틴 필름과 탈이온수의 깊이 프로파일 시계열을 볼 수 있습니다. 선택된 두 번째 이온의 강도는 질화규소 멤브레인이 펀칭되기 전에 무시할 수 있습니다.

질화규소 멤브레인이 펀칭되면 2차 이온의 강도가 크게 증가합니다. 짧은 펄스 폭 프로세스는 이미지 및 스펙트럼 재구성을 위해 더 나은 질량 분해능으로 데이터를 얻는 데 사용됩니다. 수화된 피브로넥틴 필름과 탈이온수의 2-D 이미지는 샘플에서 선택된 2차 이온의 수를 나타냅니다.

이미지가 밝을수록 2차 이온 수가 많아집니다. 이러한 직관적인 이미지는 서로 다른 시료 간에 선택된 2차 이온을 명확하게 비교하여 데이터 분석에 도움이 됩니다. 이 절차를 시도하는 동안 진공 챔버에 설치하기 전에 마이크로 반응기에 누출이 없어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 생물학 및 생물 인터페이스 분야의 연구자들이 단백질 흡착, 생물막 부착, 표면 조립 단층 및 기타 여러 현상을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 SALVI 및 액체 ToF-SIMS를 사용하여 다양한 액체 샘플을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.