Name: SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 학습하세요 SALVI 및 ToF-SIMS를 이용한 수성 용액에서 흡착 단백질 막의 제자리 특성화 방법을. 이 기술은 생체 분자와 생체 계면에서의 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

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PNNL(Pacific Northwest National Laboratory) CII-LDRD(Chemical Imaging Initiative-Laboratory Directed Research and Development) 및 MS3(Materials Synthesis and Simulation across Scales) 이니셔티브 LDRD 기금의 지원에 감사드립니다. 기기 액세스는 WR Wiley EMSL(Environmental Molecular Sciences Laboratory) 과학 테마 제안서를 통해 제공되었습니다. EMSL은 PNNL의 생물 및 환경 연구국(BER)이 후원하는 국가 과학 사용자 시설입니다. 저자들은 원고를 읽어주고 유용한 피드백을 제공해 준 Xiao Sui, Yuanzhao Ding, Juan Yao 씨에게 감사를 표합니다. PNNL은 DE-AC05-76RL01830 계약에 따라 DOE를 위해 Battelle이 운영합니다.

SALVI 마이크로 채널 1. 청소 및 살균 <ol><li> SALVI의 마이크로 채널의 살균 <ol><li> 주사기 70 % 에탄올 수용액 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구 단부와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 사출의 끝에서 주사기를 제거한다. 다음으로, 폴리 에테르 에테르 케톤 (PEEK) 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 대안 적으로, 동일한 절차를 수행하기 위해 주사기 펌프를 사용한다. 예를 들어, 100 μL / 분으로 유동 속도를 설정한다. </li><li> 4 시간 동안 실온에서 70 % 에탄올 용액으로 채워진 마이크로 채널 SALVI 유지. </li></ol></li><li> SALVI에 탈 (DI) 물을 소개 <ol><li> 주사기로 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리 SALVI의 입구와 주사기를 연결하고 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입. 주사기를 제거하고, PEEK 조합을 사용하여 SALVI의 입구와 출구를 연결합니다. 에서 언급 한 바와 같이 교대로 시린지 펌프를 사용하여1.1.1. </li></ol></li></ol> SALVI에서 단백질 2 막의 고정화 <ol><li> SALVI에서 단백질 막을 고정화 <ol><li> 주사기로 (인산염 완충 염수 중 10 ㎍ / ㎖, PBS) 용액 피브로넥틴 2 ㎖ 그리기 천천히 10 분에 액 1 ㎖을 주입, SALVI의 입구와 주사기를 연결 주사기를 제거하고, 유입 연결 및 SALVI의 출구 PEEK 조합을 사용하여. </li><li> 깨끗한 배양 접시에 피브로넥틴 용액을 가득 SALVI 부화 실온에서 12 시간 동안 접시 후드 유지. </li><li> 주사기에 멸균 DI 물 2 ㎖를 그리고 SALVI의 입구에 주사기를 연결합니다. 천천히 10 분에서 물 1 ㎖를 주입 주사기를 제거 SALVI의 입구와 출구를 연결한다. 참고 : 광학 현미경을 갖춘 경우, 죄의 막으로 ToF-SIMS 분석 전에 그대로 있는지 확인하기 위해 현미경으로 SALVI을 확인합니다. 이제 SALVI 장치가 준비으로 ToF-SIMSalysis. </li></ol></li></ol> 3.으로 ToF-SIMS로드 락 챔버에 SALVI 설치 참고 : SALVI 장치를 처리하고 표면 분석시 발생할 수있는 오염을 방지하기 위해으로 ToF-SIMS 단계에 그것을 설치할 때 장갑은 항상 착용해야합니다. <ol><li> 스테이지로 마운트 SALVI <ol><li> 평평하고 깨끗한 표면으로 ToF-SIMS 단계를 놓습니다. 실리콘 웨이퍼의 SiN 막 위쪽으로 향하게 스테이지로 SALVI 장치를 넣습니다. 네 개의 금속 클램프를 사용 SALVI를 해결하고 네 개의 나사에 의해 금속판에 장치의 모서리를 들고 금속편 스크류. </li><li> 부드럽게 미세 유체 채널에 연결 PFTE 튜브를 굴립니다. 딱딱한 부분을 누르고 네 개의 금속 조각과 네 개의 나사를 사용합니다. 이 분석에서 차 이온 빔을 방해하지 않도록 장치가 SIMS 스테이지 개방 공간 내에 위치되어 있는지 확인. 추가 이미지와 SALVI의 fabricat의 그림이온 및 설치 이전의 출판물에서 사용할 수 있습니다. 8,9,11 </li></ol></li><li> 스테이지로 패러데이 컵을 탑재 <ol><li> 나사에 의해 무대에 패러데이 컵을 수정합니다. </li></ol></li><li> 로 스테이지를 넣으로 ToF-SIMS로드 락 챔버 <ol><li> ,으로 ToF-SIMS의로드 록을 열고 상태에서 로딩 플랫폼에 수평으로 무대를 설정하고,로드 록 도어를 닫습니다. </li></ol></li></ol> 4.으로 ToF-SIMS 데이터 수집 <ol><li> (10-6 밀리바 또는 토르의 순서에, 예를 들면) 진공 펌프를 켜고 적당한 진공을 보장하기는로드 락 챔버에 도달한다. </li><li> 진공이 약 30 분 후 안정화되면 메인 챔버로 SALVI 이동합니다. 참고 : 진공는 데이터 수집 동안 주요 챔버에서보다 낮은 5 × 10-6 mbar의 진공을해야합니다. 그렇지 않으면, 높은 진공 SALVI 시스템의 누출을 나타낸다. </li><li> 함께으로 ToF-SIMS의 기본 이온 빔 분석기를 조정제조업체의 권장 사항에 따라 약 400 나노 미터의 공간 해상도. 사이클 타임은 DC 모드에서 30 마이크로 초 동안 기본 빔 전류는 pA 1200이다. 참고 :이 과정은 주로 제조업체의 권장 사항을 따른다. </li><li> 광학 현미경을 이용하여 미세 유체 채널을 찾을 수 있습니다. 참고로 광학 이미지 센터를 이용하여 이차 이온 화상 중심과 일치하도록 정렬. </li><li> 각 측정하기 전에, 표면 오염을 제거하기 위해 ~을위한 500 X 500 μm의 2 영역으로 죄 창에 15 초를 스캔 한 KeV의 O 2 + 빔 (~ 40 nA의)를 사용합니다. 또한, 모든 측정시 표면 충전을 보상하기 위해 전자 홍수 총을 사용합니다. 이 단계에 대한 기본 모드에서 홍수 총의 자동 기능을 사용합니다. </li><li> 데이터 수집 전에 양 또는 음의 모드를 선택합니다. 모든 측정의 기본 이온 빔으로 25 keV의 양방향 3 + 빔을 사용합니다. 참고 : 단계가 유사한 F입니다또는 양성 및 음성 데이터 취득. 공간 관심 포지티브 모드는 여기서 상세하게 설명한다. <ol><li> 깊이 프로파일 링 <ol><li> 32 픽셀 해상도로 32 픽셀 ~ 2 ㎛의 직경 라운드 영역의 양방향 3 + 빔을 스캔합니다. </li><li> 천공 통과하도록 된 SiN 막에 필요한 시간을 최소화하기 위해, 긴 펄스 폭을 사용하여 (예를 들어, 180 나노초 100 마이크로 초 사이클 시간에서 빔 전류 1.0 ~ PA) 3 + 양방향 빔. 액면 상승에 이차 이온 대표 농도는 펀치 쓰루가 도달 할 때. 펀치 - 스루 시간은 죄 멤브레인의 배치에 따라, 300 초에서 500 초로 다릅니다. 참고 :이 차이가 우리의 경험에 따라 획득 된 SiN 막의 배치 관련이있을 것으로 보인다. 그러나, 펀치 - 스루 시간은 실제로 데이터 분석에 영향을 미치지 않는다. </li><li> 죄 막 후-을 통해 펀치에 약 200 초 동안 같은 최신 상태로 유지2D 이미지 복원을위한 충분한 데이터를 얻을 수 있습니다. </li><li> 더 나은 질량 해상도 스펙트럼을 얻기 위해 데이터 수집을 위해 80 나노초에 펄스 폭을 줄일 수 있습니다. 에 대한 또 다른 200 초 동안 이번 인수를 계속합니다. 도 1에 도시 된 스펙트럼 데이터는이 영역에서 얻어진다. </li></ol></li><li> 2D 이미징 및 질량 스펙트럼 <ol><li> 깊이 프로파일 데이터를 측정 할 때 동일한 시간에 2 차원 촬상 및 질량 스펙트럼 데이터를 수집한다. 으로 ToF-SIMS 장비는 실험 기간 동안 각 지점의 모든 정보를 저장합니다. (- 스펙트럼, FPanel - 프로필 및 FPanel - 별도 이미지 FPanel) 디지털 제어 소프트웨어의 데이터는 다른 창에 표시됩니다. 신중하게 데이터 수집시 각 패널의 데이터를 확인합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 5.으로 ToF-SIMS 데이터 분석 주 : 데이터 분석은 초기 IonToF으로 ToF-SIMS 계기 소프트웨어를 이용하여 수행된다. <ol><li> 를 엽니 다다음, SIMS (측정 탐색기) 그리고 alysis 소프트웨어 깊이 프로파일, m / z 스펙트럼 화상 데이터를 처리하기 위해, 각각, &quot;정보&quot;, &quot;스펙트라&quot;및 &quot;화상&quot;버튼을 클릭. </li><li> 확장 &quot;.ita&quot;이 데이터 파일을 엽니 다. </li><li> 관심 피크를 선택 &quot;이온&quot;상자에 종의 이름을 입력 한 스펙트럼에서 다른 색깔로 레이블을 붙입니다. x 축을 따라 끌어 마우스 스크롤 휠을 사용합니다. 피크의 높이와 폭을 조정 Ctrl 키와 스크롤 휠을 사용합니다. y 축을 따라 선형 및 로그 모드 사이의 문자 &quot;L&quot;로 전환됩니다. </li><li> 질량 교정하기 전에 데이터 재구성을 실시한다. 그렇지 않으면 질량 교정 단계에서 피크들 사이의 간격을 선택하는 것이 곤란하다. <ol><li> 관심의 깊이 프로파일 링 데이터를 선택하고 깊이 프로파일 시간 시리즈에 따라 스펙트럼을 재구성. </li><li> 복원 버튼을 클릭합니다. INT의 스캔 범위에서 &quot;시작 재건&quot;창에 입력erest. 깊이 프로파일 데이터를 재구성하는 &quot;OK&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li><li> 질량 보정을 수행합니다. 보도는 &quot;F3&quot;는 &quot;질량 교정&quot;창을 엽니 다. 특정 샘플에 따라 교정을위한 피크를 선택합니다. (21) 본 연구에서는 다음과 같은 피크를 사용 CH 3 + (m / z 15), H 3 O + (m / z 19), C 2 H 5 + (m / z 29 ), H 5 O 2 + (m / z 37), C 3 H 7 + (m / z 43), H 7 O 3 + (m / z 55), H 9 O 4 + (m / z 71) H 11 O 5 + (m / z 99)와 긍정적 인 모드 H 13 O 6 + (m / z 109). 다음 봉우리 CH 사용 - (m / z 13), O - (m / z 16), OH - (m / z 17), C 2 H - (m / z 25), C 3 H - (m / z 37), 및 C 4 H - (m / z 49) 부의 모드. <ol><li> 피크를 선택,아래쪽 화살표가 윈도우의 왼쪽 하단 모서리에 절정에 지적되어 있는지 확인하십시오. 피크를 클릭하고 &quot;질량 교정&quot;창에서 피크 이름을 입력 &quot;추가&quot;를 클릭 한 관심의 이온은 질량 교정에 포함되어 있습니다. </li><li> 마지막으로, &quot;다시 보정&quot;버튼을 클릭합니다. 피크의 영역 비율을 부과하는 그들의 질량에 따라 올바른 위치에 있는지 확인하십시오. &quot;스펙트럼&quot;메뉴에서 선택하여 수행되는 특정 분석에 따라 &quot;적용 질량 교정&quot;을 &quot;모든 스펙트럼&quot;또는 &quot;선택한 스펙트럼&quot;을 클릭합니다. </li></ol></li><li> 피크 선택 시료 분석에 필요한 바와 같이, 문헌 또는 다른 이전 결과에 따라 샘플의 특징적인 피크를 결정한다. m / Z 스펙트럼에 대한 관심의 피크의 강도를 비교합니다. 필요한 경우, 피크 목록 쓸모 피크 새로운 피크를 추가하거나 삭제할. <ol><li> 피크를 추가합니다. , 피크를 클릭하면 왼쪽 아래 창에 붉은 줄을 찾을 수 있습니다. 홀리D &#39;Ctrl 키 &quot;키 자동 피크 목록에 추가 피크의 피크 폭을 정의하는 가로 스크롤 마우스. 피크를 추가하는 또 다른 방법은 창 위의 &#39;피크를 추가 &quot;버튼을 클릭 한 다음 주 스펙트럼 창에서 피크를 선택하는 것입니다. 새롭게 문을 연 창에 관련 사양, &quot;스펙트럼&quot;메뉴에 추가 &quot;검색 봉우리&quot;를 선택, 확인하는 많은 봉우리가있는 경우 필요에 따라 다음 피크를 추가 할 수 있습니다. </li><li> &quot;피크 목록&quot;메뉴에서, 피크 목록을 내보내려면 선택 &quot;itmil&quot;형식으로 피크 목록 &quot;... 저장&quot;. 스펙트럼을 따라 드래그 Ctrl 키와 왼쪽 버튼을 사용합니다. 스펙트럼 창에서 관심의 피크를 선택하고 원하는 위치에 두 개의 점선을 끕니다. </li><li> 피크 목록을 가져 오려면, &quot;대용량 간격 목록&quot;메뉴에서 &quot;가져 오기 ...&quot;, 파일 확장자 &quot;.ITPL&quot;와 기존의 피크 목록 파일의 위치를​​ 선택합니다. &quot;열기&quot;를 클릭합니다. </li><li> 에, &quot;itmil&quot;피크 목록을 사용하려면&quot;대용량 간격 목록&quot;메뉴는 &quot;열기 ...&quot;를 클릭하여 파일을 찾을 후 &quot;열기&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li><li> 추가 데이터를 분석하는 피크 목록을 적용합니다. &quot;스펙트럼&quot;윈도우의 왼쪽 하단에 &quot;대용량 간격 목록&quot;라는 창이있다. 수입 피크 목록은 여기에 표시됩니다. <ol><li> , 사용 피크 목록 파일을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 &quot;활성 스펙트럼&quot;또는 &quot;모든 스펙트럼 &#39;에 적용합니다. </li></ol></li><li> 데이터 프로파일을 볼 수 있습니다. &quot;프로필&quot;창에서 사용 문자 &quot;M&quot;은 y 축에 맞게 창 (전체 범위) 및 문자 &quot;N&quot;을에 맞게. Ctrl 키를 사용하여 프로파일 폭을 조정 휠을 스크롤합니다. 또는 Y 축 범위와 높이를 변경 키 보드의 &quot;*&quot;, &quot;/&quot;를 사용하고. </li><li> 또한 초기 분석 후 다른 그래픽 소프트웨어를 사용하여 플롯에 대한 데이터 내보내기. <ol><li> &quot;파일&quot;메뉴를 클릭 &quot;프로필&quot;창에서, 깊이 프로파일을 내보내려면 다음 &quot;내보내기 &amp; #을 선택(34), 및 다음 선택 &quot;이 .txt&quot;파일 &quot;로 저장&quot;을 선택합니다. </li><li> , &quot;스펙트럼&quot;창에서, m / Z 스펙트럼 파일을 내보내 &#39;파일&#39;메뉴를 클릭 한 다음 &quot;내보내기&quot;를 선택한 후 &quot;이 .txt&quot;파일 &quot;로 저장 &#39;을 선택합니다. </li><li> &quot;이미지&quot;창, 인쇄 화면에서 이미지 파일을 내 보낸 이미지 파일로 저장합니다. </li></ol></li></ol> 6.으로 ToF-SIMS 데이터 플로팅 및 프리젠 테이션 참고 : SIMS 데이터가 쓸모 소프트웨어를 사용하여 처리 한 후 데이터를 플롯하는 그래픽 도구를 사용합니다. <ol><li> 데이터를 가져 그래픽 도구를 사용합니다. </li><li> 재구성 된 스펙트럼을 표시하는 y 축으로서 X 축 및 피크 세기로 m / z를 사용하여 곡선을 만든다. 예를 그림 1에 제시되어있다. </li><li> 재구성 된 깊이 프로파일의 시간 시리즈를 표시하는 y 축으로서 X 축 및 피크 세기로 스퍼터 시간을 사용하여 곡선을 만든다. 예를 Figu에 제시되어있다2를 다시. </li><li> 다른 m / z의 복원 된 2 차원 영상을 결합 이온 매핑을 표시하는 매트릭스를 형성한다. 예를 그림 2에 제시되어있다. </li></ol>

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SALVI 등으로 ToF-SIMS 및 주사 전자 현미경 (SEM)과 같은 진공 기반기구에 의해 동적 액면과 액체 - 고체 계면 분석을 허용 미세 인터페이스이다. 작은 구멍의 사용은 직접 진공 액체에 노출하기 때문에, SALVI은 수정없이 많은 미세하게 초점을 맞춘 분광기 및 이미징 기술에 적합한 22 이동성과 미세 유체의 다양성이 진정한 멀티 모달 이미징 플랫폼입니다. 별개의 기능 및 기존의 기술에 비해 SALVI의 중요성이 최근 여러 후기에 요약되어있다. SALVI 기술의 개발로 22-25 우리 그룹 적극적 동적 액체 표면과 고액 인터페이스를 포함하는 다양한 연구에 적용되어 . 새로운 애플리케이션의 예로는 포유 동물 세포막 세균 생물막 부착 수성 표면 산화 반응의 결과로 15, 16 또는 나노 입자의 형성을 포함한다. 이 포장 된당, 우리는 죄의 표면에 흡착 수화 단백질 박막의 초기 액체으로 ToF-SIMS 결과를 제시한다. <p class="jove_cont...

수화 구조, 형태 1, 2 단백질의 생물학적 활성을 3 중요하다. 그들을 둘러싼 물 분자가없는 단백질은 실행 가능한 생물학적 활성이없는 것입니다. 특히, 물 분자가 표면 단백질의 내부 구조와 상호 작용 단백질의 상이한 수화 상태는 별개 이러한 상호 작용을 만든다. (4) 고체 표면과 단백질의 상호 작용은 나노, 바이오 물질 및 조직 공학 프로세스의 의미와 기본적인 현상이다. 연구는 긴 단백질이 표면에 발생으로 구조적인 변화가 발생할 수 있음을 지적했다. 으로 ToF-SIMS는 단백질 - 고체 계면을 연구 할 수있는 잠재력을 가지고 기술로서 구상되었다. 5-7 이는 잠재적으로 그 구조의기구의 기본적인 이해를 제공 고체 표면에 단백질의 수화를 이해하는 것이 중요 형태 및 생물학적등 활동. 그러나, 주 표면 분석 기술은 주로 진공 기반 휘발성 액체 연구 직접 애플리케이션 인해 진공 분위기 하에서 휘발성 액체의 신속한 증발하기 어렵다. 우리는 액체 표면과 액체 - 고체 상호 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석기를 사용하여 직접 관찰을 가능하게하는 액체 진공 인터페이스 (SALVI)에서 분석 호환 미세 인터페이스 시스템에 진공을 개발 하였다. 8- 2) 표면 장력이 개구 내에 상기 액체를 보유하기 위해 사용되는 1) 검출 창 액면 직접 촬상 있도록 직경 2-3 μm 인 개구이며 3) SALVI는 11 독특한 양상은 다음과 같다 여러 분석 플랫폼 사이의 휴대용. (11, 12) SALVI은 검출 영역 및 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 마이크로으로서 실리콘 질화막 (SiN) 막으로 구성된다. 그것은 fabr입니다클린 룸에서 icated하고, 제조 및 핵심 설계 요소는 이전의 논문 및 특허에 자세히 설명되어있다. 8-12 분석 도구 등으로 ToF-SIMS의 응용 프로그램의 일부 수용액 복잡한 액체 혼합물의 다양한 사용하여 시연 하였다 이는 나노 입자가 포함되어 있습니다. 13-17 구체적으로는, SALVI 액으로 ToF-SIMS는 현장 응축 단계에서 새로운 기회를 열어, 라이브 생물학적 시스템 (즉, 바이오 필름), 단일 세포 및 고체 전해질 인터페이스의 액체 - 고체 계면의 프로빙 동적 수 있습니다 으로 ToF-SIMS를 사용하여 액체를 포함하는 연구. 그러나, 현재의 디자인은 아직 기체 - 액체의 상호 작용을 허용하지 않습니다. 이것은 미래의 발전을위한 방향이다. SALVI 처음 본 연구에서 수화 된 막 단백질을 연구하기 위해 사용되었다. 피브로넥틴은 거의 동일한 두 개의 이황화 결합에 의해 연결된 한 쌍의 단량체 (18)로 이루어진, 일반적으로 사용되는 단백질 이량 인 I세포에 결합하는 능력에 대해 잘 알려지. 그것은 모델 시스템으로 선택되었다 (19, 20)을 수화 단백질 막 동적 SALVI 액으로 ToF-SIMS를 사용하는 방식 프로브 될 수 있음을 설명하기 위해. 단백질 용액은 마이크로 채널에 도입 하였다. 12 시간 동안 배양 한 후에, 수화 된 막 단백질의 SiN 막의 배면 측에 형성되어있다. 탈 이온수 (DI) 물은 단백질 도입 한 후의 채널을 씻어 하였다. 정보는 동적으로 ToF-SIMS를 사용하는 마이크로 채널 SALVI 수화 피브로넥틴 단백질 분자로부터 수집 하였다. DI 물은 수화 피브로넥틴 박막에서 얻은 결과와 비교 대조군으로 연구 하였다. 뚜렷한 차이점은 수화 단백질 막 및 DI 물 사이에서 관찰되었다. 이 작업은, 액체 환경에서 표면 단백질 흡착은 신규 SALVI 액상으로 ToF-SIMS 방식을 사용하여 조사 할 수 있음을 확인할 수 있었다. 비디오 프로토콜은 관심이있는 사람들을위한 기술지도를 제공하기위한 것입니다으로 ToF-SIMS와 SALVI의 다양한 애플리케이션을위한 새로운 분석 도구를 활용하고으로 ToF-SIMS 데이터 수집 및 분석뿐만 아니라 액체 처리에 불필요한 실수를 줄일 수있다.

<table><tbody><tr><td>ToF-SIMS</td><td>IONTOF</td><td>TOF. SIMS 5</td><td>해상도 : >10,000 m/&델타; 질량 분해능의 경우 m; >4,000m/&델타; 높은 공간 해상도를 위한 m&nbsp;</td></tr><tr><td>SALVI(Liquid Vacuum Interface)의 분석 시스템</td><td>Pacific Northwest National Laboratory</td><td>N/A</td><td>SALVI는 ToF-SIMS(Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)와 같은 진공 기반 과학 기기가 분자 수준에서 자연 상태의 액체 표면을 분석할 수 있도록 하는 고유한 독립형 휴대용 분석 도구입니다.</td></tr>SALVI 5축 샘플 스테이지<tr><td>의 입구와 출구를 연결하기 위한</td> <td>PEEK Union</td><td>Valco</td><td>ZU1TPK</td></tr><tr><td></td><td>IONTOF</td><td>N/A</td><td>Stage는 ToF-SIMS</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure 정수 시스템에</td> SALVI를 장착하기 위해 자체 제작한 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D11921</td><td>ROpure LP 역삼투 여과 모듈(D2716)</td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>309659</td><td>1ml</td></tr><tr><td>피펫</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21-377-821</td><td>범위: 100 - 1,000 ml</td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Neptune</td><td>2112.96.BS</td><td>1,000 &마이크로; l</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브</td><td>코닝</td><td>430791</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>F1141</td><td>1 mg/ml</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>열 피셔 사이언티픽</td><td>S25310A</td><td>95% 변성</td></tr><tr><td>Gibco PBS</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>10010-023</td><td>pH 7.4</td></tr></tbody></table>

salvi 및으로 tof-sims에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

이 작업은 액체 진공 인터페이스 (SALVI) 및 TOF (-SIMS), 비행 시간 형 이차 이온 질량 분석법으로 분석 시스템을 사용하여 수용액의 단백질의 생체 시츄 특성화 보여준다. 피브로넥틴 단백질 막을 SALVI 감지 영역을 형성하는 상기 실리콘 질화물 (SIN) 막 상에 고정화 하였다. 으로 ToF-SIMS 분석에서, 분석의 세 개의 모드는 높은 공간 분해능 질량 분석법, 2 차원 영상 및 깊이 프로파일 링을 포함하여 수행 하였다. 질량 스펙트럼을 양성 및 음성 모드를 모두 취득 하였다. 탈 이온수는 기준 샘플로서 분석 하였다. 우리의 결과는 물에 피브로넥틴 영화는 혼자 물에 비해 더 독특하고 강한 물 클러스터 피크를 가지고 있음을 보여준다. 아미노산 단편의 특징적인 피크는 단백질 수화으로 ToF-SIMS 스펙트럼에서 관찰 가능하다. 이러한 결과는 표면에 단백질 분자의 흡착 dynamica을 연구 할 수있는 예시에서야 처음으로 액체 환경에서 SALVI 및으로 ToF-SIMS를 사용하여.

대표적인 결과의 커플은 제안 된 프로토콜의 장점을 보여주기 위해 제공됩니다. SALVI 미세 인터페이스를 사용하여, 기본 이온빔 (BI + 3)가 직접 DI 물에서 수화 피브로넥틴 필름 포격있다. 따라서 액체 표면의 분자 화학 매핑 성공적 얻을 수있다. 도 1a 각각 수화 피브로넥틴 막 및 DI 물의 양으로 ToF-SIMS 질량 스펙트럼을 표시 1B. 물 클러스터를 포함하여 관심의 피크 (즉, m / z 19, 37, 55, 73, 91, 109) 및 아미노산 조각 (즉, m / z 30, 44, 61, 74, 81, 83, 98) 빨간색 화살표로 표시됩니다. 널리 건조 단백질 시료를 사용하여보고 된 아미노산 단편의 특징적인 피크...

이 작업은 수용액 중의 단백질의 생체 시츄 비행 시간 형 2 차 이온 질량 분석기 분석을위한 마이크로 액체 취급 및 샘플 도입을위한 프로토콜을 나타낸다.

SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

본 절차의 전반적인 목표는 Liquid Vacuum Interface 분석 시스템과 비행시간형 이차 이온 질량 분석법(time-of-flight secondary ion mass spectrometry)을 사용하여 수용액 내의 흡착 단백질 박막을 특성화하는 것입니다. 이 방법은 생체 분자 및 바이오 인터페이스에 관한 핵심적인 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 고체 표면에 흡착된 단백질의 특성 분석 등이 이에 해당합니다.이 기술의 주요 장점은 액체 환경 내에서 생체 분자를 제자리(in situ)에서 시작할 수 있으며, 분자 매핑과 결합하여 사용할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 고체-액체 계면의 생체 분자에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 단일 암세포 조사, 약물 상호작용, 바이오필름 부착 등 다른 시스템에도 적용될 수 있습니다. 5 mL 주사기에 70% 에탄올 용액 2 mL를 흡입합니다.주사기를 SALVI 장치의 유입구 끝에 연결하고, 10분에 걸쳐 액체 1 mL를 천천히 주입합니다. 주입이 끝나면 주사기를 제거하고, polyether-ether-ketone 유니온을 사용하여 SALVI의 유입구와 유출구를 연결합니다. SALVI 마이크로채널을 70% ethanol 용액으로 채운 상태로 상온에서 4시간 동안 유지합니다.그다음, 두 번째 주사기에 멸균 탈이온수를 채웁니다. 이를 SALVI의 입구에 연결하고 10분에 걸쳐 탈이온수를 장치 내부로 천천히 주입합니다. 주사기를 제거하고 장치의 입구와 출구를 다시 서로 연결합니다.단백질 막을 고정하려면, 먼저 주사기로 피브로넥틴(fibronectin) 용액 2 mL를 흡입합니다. 주사기를 SALVI 장치의 유입구에 연결하고, 10분에 걸쳐 액체 1 mL를 천천히 주입합니다. 그런 다음 주사기를 제거하고 유입구와 유출구를 다시 연결합니다.장치를 깨끗한 배양 접시에 담아 상온에서 12시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 10분에 걸쳐 멸균 탈이온수 1 mL를 천천히 주입한 후, 입구를 출구에 다시 연결합니다. 우선, ToF-SIMS 스테이지를 평평하고 깨끗한 표면에 놓습니다.실리콘 웨이퍼와 실리콘 질화물 막이 위를 향하도록 SALVI 장치를 스테이지 위에 놓습니다. 네 개의 금속 클램핑 조각을 사용하여 SALVI 장치를 스테이지에 고정하고, 장치의 모서리를 잡고 있는 금속 조각들을 네 개의 나사로 금속판에 조여 고정합니다. 다음으로, 미세유체 채널에 연결된 PFTE 튜빙을 조심스럽게 말아 올립니다.4개의 금속 조각과 4개의 나사를 사용하여 단단한 부분을 고정합니다. 분석 중에 장치가 1차 이온 빔을 방해하지 않도록 스테이지의 빈 공간에 위치시켜야 합니다. 다음으로, 나사를 사용하여 패러데이 컵을 스테이지에 장착합니다.그 후, ToF-SIMS 로드락 도어를 열고 스테이지를 로딩 플랫폼 위에 수평으로 놓은 다음 도어를 닫습니다. 진공 펌프를 켜고 로드락 챔버가 약 10⁻⁶ mbar까지 배기되도록 합니다. 약 30분 후 진공이 안정되면 SALVI 장치를 메인 챔버로 이동시킵니다.제조사의 권장 프로토콜에 따라 ToF-SIMS의 일차 이온 빔과 분석기를 조정하여 약 400 nanometers의 공간 분해능을 확보하십시오. 다음으로, 광학 현미경을 사용하여 미세유체 채널을 찾으십시오. 광학 이미지의 중심을 기준으로 삼아, 이를 이차 이온 이미지의 중심과 일치하도록 정렬하십시오.샘플이 일반적인 고체 샘플보다 두껍고 채널의 최적 초점을 찾기 위한 설정 조정이 어렵기 때문에, 이 단계의 시각적 시연은 학습에 있어 매우 중요합니다. 각 측정 전에 1 keV 산소 빔을 사용하여 실리콘 질화물 윈도우를 약 15초 동안 스캔함으로써 표면 오염물을 제거하십시오. 또한, 모든 측정 과정 동안 표면 대전 현상을 보정하기 위해 전자 플러드 건을 사용하십시오.다음으로, 데이터 수집을 시작하기 전에 양이온 또는 음이온 모드를 선택하십시오. 모든 측정에서 25 kiloelectronvolt bismuth three plus를 일차 이온 빔으로 사용하십시오. 깊이 프로파일링의 경우, 32 pixels by 32 pixels의 해상도로 직경 약 two micrometers의 원형 영역에서 일차 이온 빔을 스캔하십시오.질화규소 막을 관통하는 데 소요되는 시간을 최소화하려면 펄스 폭이 긴 1차 이온 빔을 사용하십시오. 질화규소 막을 관통한 후에는 2차원 이미지 재구성을 위한 충분한 데이터를 얻기 위해 약 200초 동안 동일한 전류를 유지하십시오. 데이터 수집 시에는 더 나은 질량 분해능의 스펙트럼을 획득하기 위해 펄스 폭을 80 nanoseconds로 줄이십시오.이 획득 과정을 약 200초 동안 더 계속합니다. SALVI 미세유체 인터페이스를 사용하여 1차 이온 빔이 수화된 피브로넥틴 박막을 직접 충격할 수 있습니다. ToF-SIMS 질량 분석 데이터에 의해 다수의 물 클러스터와 아미노산 파편이 나타납니다.이는 수화된 단백질 분자 내부와 그 주변을 둘러싼 물 분자의 특성에 대한 직접적인 증거를 제공합니다. 여기에서 수화된 피브로넥틴(fibronectin) 박막과 탈이온수의 깊이 프로파일 시계열을 확인할 수 있습니다. 선택된 2차 이온의 강도는 질화 규소 막이 관통되기 전까지는 무시할 수 있는 수준입니다.질화규소 막이 뚫리면 이차 이온의 강도가 현저하게 증가합니다. 이미지 및 스펙트럼 재구성을 위해 더 나은 질량 분해능의 데이터를 얻고자 짧은 펄스 폭 공정을 사용합니다. 수화된 피브로넥틴 박막과 탈이온수로부터 얻은 2D 이미지는 시료에서 선택된 이차 이온의 계수를 나타냅니다.이미지가 밝을수록 이차 이온의 계수가 더 높음을 의미합니다. 이러한 직관적인 이미지는 서로 다른 시료 간의 선택된 이차 이온을 명확하게 비교할 수 있게 하여 데이터 분석에 유용합니다. 이 절차를 수행할 때, 진공 챔버에 설치하기 전 마이크로리액터에 누설이 없어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.이 기술은 생물학 및 바이오 인터페이스 분야의 연구자들이 단백질 흡착, 바이오필름 부착, 표면 조립 단분자층 및 기타 많은 현상을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면 SALVI와 액체 ToF-SIMS를 사용하여 다양한 액체 시료를 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

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본 실험의 목적은 파악하고 물 속에 자기 조립 discotic amphiphiles의 크기, 모양과 안정성을 조절하는 것입니다. 수성 기반의 supramolecular 폴리머의 경우 제어와 같은 수준은 매우 어렵습니다. 우리는 반발하고 매력적인 상호 작용을 모두 사용하는 전략을 적용합니다. 이 시스템을 특성을 적용하여 실험적인 기법을 광범위하게 적용할 수 있습니다.

물에 Supramolecular 폴리머의 크기, 모양과 안정성을 제어

더 많은 단백질의 절반 이상이 전자 현미경 영상과 3 차원 재구성 모두 도전하고 작은 단백질 (분자량 &lt;200 kDa의)이다. 최적화 네거티브 염색 고 대비 및 비교적 높은 해상도 (~ 1 nm의) 다른 생리적 조건 하에서 작은 비대칭 또는 단백질 복합체의 이미지를 얻기 위해 견고하고 높은 처리량 프로토콜이다.

최적화 된 음의 염색 : 전자 현미경으로 작은 비대칭 단백질 구조 검사를위한 높은 처리량 프로토콜

표면 상에 대량으로 선택 이온의 연착륙은 새로운 물질의 높은 제어 준비를위한 강력한 방법입니다. 현장 이차 이온 질량 분석 (SIMS)과 적외선 반사 흡수 분광법 (IRRAS)에 의한 분석과 함께, 부드러운 착륙은 표면과 잘 정의 된 종의 상호 작용에 전례없는 통찰력을 제공합니다.

대량 선택 이온 소프트 랜딩에 의해 준비 잘 정의 된 표면의 제자리 SIMS 및 IR 분광법

단백질 기능의 주요 단계, 특히 골격 구조 변화와 양성자 전달 반응은 종종 마이크로초에서 밀리초 사이의 시간 척도에서 발생합니다. 이러한 역학 과정은 시간 분해 단계 스캔 푸리에 변환 적외선 분광법으로 연구할 수 있으며, 특히 빛에 의해 기능이 트리거되는 단백질의 경우 연구할 수 있습니다.

에 의해 감광성​​ 단백질의 양성자 이동과 단백질 입체 구조 역학 시간 분해 적외선 분광학에게 푸리에 변환 단계 - 스캔

Sedimentation equilibrium (SE)은 생리학적 환경에서 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 인간 세포융합 호흡기 바이러스(hRSV)에 의해 암호화된 작은 소수성(SH) 단백질에 의해 형성된 호모펜타머의 안정성에 대한 pH의 영향을 결정하기 위해 이 기술의 사용을 설명합니다.

작은 올리고머 형성 막 단백질의 침전 평형 : 펜타 머 안정성에 히스티딘 양성자의 효과

여기에서는 고체 분말 내 단백질에 대한 고체 상태 아미드 수소/중수소 교환 질량 분석법(ssHDX-MS) 및 고체 상태 광분해 라벨링 질량 분석법(ssPL-MS)에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 비정질 고체 상태의 단백질 형태 및 상호 작용에 대한 고분해능 정보를 제공하며, 이는 제형 설계에 유용할 수 있습니다.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

이 문서는 제자리에서 비행 시간 2 차 이온 질량 분석 매핑의 화학 수 화 상태에서 미세 반응 기, 액체 진공 인터페이스에 분석을 위한 시스템으로 사용에 대 한 biofilm 성장을 위한 메서드를 제공 합니다. 녹색 형광 단백질으로 Shewanella oneidensis 미스터 1 모델로 사용 되었다.

제자리에서 Shewanella oneidensis MR1 Biofilms SALVI 및 ToF 심즈의 특성

우리는 제자리에 액체 스캐닝 전자 현미경 검사 법에 의해 실시간 이미징 및 이온된 수 boehmite 입자의 원소 조성 분석에 대 한 절차를 제시.

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여기, 우리는 프로토콜 구조와 계면 물 submolecular 해상도 이미징, 분자 조작 및 단일 결합 진동 분광학 원자 규모에서의 역학 조사를 제시.

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이 프로토콜 단백질 호모-oligomerization에서 체 외에 상업 조명 현미경 검사를 사용 하 여 형광 변동 분광학에 따라 측정을 위한 보정 없는 접근을 설명 합니다. 올바른 인수 설정 및 분석 방법을 표시 됩니다.

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.

단백질과 수화수의 피코초-나노초 역학을 연구하기 위한 고분해능 중성자 분광법

학습하세요 SALVI 및 ToF-SIMS를 이용한 수성 용액에서 흡착 단백질 막의 제자리 특성화 방법을. 이 기술은 생체 분자와 생체 계면에서의 상호작용을 연구하는 데 활용됩니다.

SALVI 및으로 ToF-SIMS에 의해 물에 수화 된 단백질의 제자리의 특성에

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