Name: 마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 배우세요 마우스 뇌 조각에서 직류 자극과 다중 전극 배열을 이용한 발작 유사 활동 기록 방법. 이 기술은 약물 내성 간질 치료 연구에 활용됩니다.

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Academia Sinica의 Neural Circuit Electrophysiology Core의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 국가과학위원회(National Science Council, 102-2320-B-001-026-MY3 및 100-2311-B-001-003-MY3)와 Academia Sinica의 신경과학 프로그램의 지원을 받았습니다.

동물의 과목을 포함하는 절차는 기관 동물 관리 및 활용위원회, 중앙 연구원, 타이페이, 대만에 의해 승인되었다. 1. 다중 전극 배열 녹화에 대한 실험 솔루션 및 장비 준비 <ol><li> 인공 뇌척수액 (ACSF 준비 124 mM의 염화나트륨, 4.4 mM의 KCl을들을 1mM의 NaH를 2 95 % O 버블 PO 3, 2 mM의 황산, 2 mM의 CaCl2를 25 밀리미터의 NaHCO3 및 10 mM의 글루코오스, 2, 5 % CO 2). </li><li> 6 × 10 평면 MEA와 8 × 8 MEA : MEA 프로브의 두 가지 유형을 사용합니다. 전자 프로브는 피질, 선조체 및 시상을 포함하는 영역을 포함한다. 후자의 프로브는 대뇌 피질의 영역을 다룹니다. </li><li> 0.1 Hz에서 1,200 증폭에서 3 kHz의 사이에 밴드 패스 필터를 60 채널 증폭기를 사용한다. 10 kHz 샘플링 레이트로 데이터를 획득. </li><li> DCS의 MEA 챔버 내부에 두 개의 AgCl을 코팅은 와이어를 놓습니다. AgCl을을 사용하여실버 코팅 된 와이어는 절연 자극에 의​​해 생성 된 전기장을 생성한다. </li><li> 텅스텐 전극 (; 길이 7.62 cm 8 ° AC 테이퍼 팁 직경 127 μm의 저항 5 MΩ) 장소 시상 자극을하고, MEA 실 기준 전극을 배치합니다. 펄스 발생기에 의해 제어되는 격리 자극기를 사용하여 텅스텐 전극의 전류를 제공한다. </li></ol> 2. 뇌 조각 준비 <ol><li> 4-8주 세 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다. 집 에​​어컨 방에 ​​동물 음식과 물을 무료로 이용할 수로 (21 ~ 23 ° C, 50 % 습도 / 12 시간 / 암주기, 오전 8:00에 점등 12 시간). </li><li> 단계 1.1에서 제조 된 ACSF의 250 ML의 나누어지는을 가지고, 얼음이 들어있는 비커에 넣습니다. 동시에, 95 % O 2, 5 % CO 2로 구성되는 연속 가스를 공급한다. </li><li> 외과 <ol><li> 유리에서 4 % 이소 플루 란 동물을 마취약 3 분 동안 상자. 동물 (발가락 핀치에 대한 응답의 부족에 의해 표시) 마취의 수술 깊이에 도달하면, 얼음 조각으로 가득 얕은 트레이에 배치하고 가위를 사용하여 헤드를 제거합니다. </li><li> 두개골을 노출하고, 나머지 근육을 잘라. 다음으로, rongeurs를 사용하여 뇌에서 두개골의 지느러미 표면을 벗겨. rongeurs을 이용하여 두개골의 측면을 얻어 낸다. 75 % 에탄올 용액으로 수술 도구 모두 멸균. </li><li> 주걱을 사용하여 두뇌의 복부 표면을 따라 후각 전구 및 신경 연결을 절단, 뇌를 제거합니다. 잘린 후, 신속하게 얼음처럼 차가운 산소 ACSF 가득 비커에 두뇌를 전송합니다. </li></ol></li><li> 내측 시상 (MT) -ACC 뇌 조각의 준비 참고 : ACC (13)에 MT에서 경로를 포함 슬라이스를 준비합니다. <ol><li> 2.0 mm 각 반구의 중간 선 측 방향이 시상 인하와 함께 뇌 블록을 손으로 잘라피질 해부학을 표시합니다. 그런 다음 두 개의 각도 절단을합니다. 선조체에서 볼 수 섬유 기관의 첫 번째 크로스 컷 평행합니다. </li><li> thalamocingulate 경로에 복부와 평행 전방 접합면과 광학 기관 사이의 중간 지점으로 소뇌와 시각 피질 사이의 연결에서 두 번째 크로스 컷을 확인합니다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트 접착제와 각도 플레이트 (~ 120 °)로 뇌 블록을 연결하고 그냥 경로의 전환점 위에 상처를합니다. 플레이트를 펼쳐을 평평하게하고, vibratome의 실 단계에 그것을 접착제. </li><li> 내측 시상-ACC 뇌 조각 다음 (500 μm의 두께) 및 1 산소 ACSF로 녹화 실에 얼음처럼 차가운 산소 aCSF.Transfer 조각에서 그들을 몰입, 지속적인 관류 (12 ml / 분)에서 32 ° C로 유지합니다 시간. </li></ol></li></ol> 다중 전극 배열 녹화에 대한 관류 상공 회의소 3. 준비 <ol><li> 예비관류 상공 회의소 <ol><li> 다중 채널 시스템에서 MEA 프로브를 배치하고, 연동 펌프에 프로브를 연결하는 두 개의 분리 된 폴리에틸렌 튜브를 사용한다. MEA를 챔버와 챔버 밖으로 ACSF을 안내하는 다른 튜브에 ACSF을 안내하는 하나의 튜브를 사용합니다. 마지막으로, 연속적으로 따뜻한 (29-30 °의 C) 산화 된 ACSF (8 ml / 분)로 제조를 관류. </li></ol></li><li> MEA에 뇌 조각을 전송합니다. 젖은 면봉을 사용하여 MEA에 뇌 슬라이스를 누르십시오. 조심스럽게 ACC는 전극 위에 지향하기 위해 뇌 조각을 이동합니다. </li><li> 뇌 조각을 눌러 슬라이스 앵커 키트를 길게 다운을 사용합니다. 이 단계는 슬라이스와 전극 사이의 우수한 전기 접속을 보장한다. </li></ol> DCS에 의한 전기 분야의 4 세대 주 : 전계 방향의 정의는 ACC axodendritic의 축 방향을 기준으로 하였다. 수상 돌기 및 소마 구획의 방향이었다골지 염색 (12)을 이용하여 확인 하였다. <ol><li> 누산기에 인접 (양극으로 정의 됨) AgCl을 전극을 배치하고, ACC에 말단 (캐소드로 정의) 다른 전극을 배치합니다. MEA에 의한 두개의 전계 배향 (누산기 axodendritic 섬유에 평행 및 수직)에 의해 생성되는 자기장 강도를 기록 및 자극 장치를 이용하여 전계의 전류를 제공한다. </li><li> AgCl을 전극 (약 1.5 cm)의 거리를 수정 한 mA 0.5 내지 2를 DCS을 할 수있는 자극의 현재 강도를 조정합니다. </li></ol> 5. 전기에 의한 두피 시냅틱 응답 주 : 프로그램 가능한 전기 자극 발생기 직사각형 이상성 전류 펄스를 생성하는 MT의 전기 자극에 의​​한 ACC 시냅스 반응을 유도한다. <ol><li> 위의 반복 제 3 절. </li><li> 이동 단말에 텅스텐 전극을 배치하고, thal에 자극에서 펄스를 제공바이폴라 텅스텐 전극을 통해 조각의 아미드 영역입니다. </li><li> 에 ACC 응답을 이끌어 임계 값을 결정하기 위해 다양한 전류 강도를 사용합니다. 여기에 대부분의 조각에서 ACC에서 80 %의 최대 반응을 유도 200 마이크로 초의 ± 150 μA의 강도와 지속 시간을 사용합니다. </li><li> 최적의 응답 프로파일을 얻기 위해 MT-ACC 슬라이스에 (뇌량에 MT에서)를 thalamocingulate 경로를 따라 텅스텐 전극을 이동합니다. </li><li> ACC 응답의 10 ~ 20 스윕을 확인하고 소프트웨어를 사용 MT 자극에 의​​해 유발 ACC 모두 평균을 자동으로합니다. MT-ACC 경로에 의해 MT 자극으로부터 유도 된 ACC에서 시냅스 응답 ISS 결과입니다. </li></ol> 6. 전기에 의한 발작 같은 활동 (250 μM 4-AP) 및 bicuculline (5 μM) 발작 같은 활동은 4 아미노 피리딘의 응용 프로그램에 의해 유도되었다합니다. 이전 시간 제어 연구는 최대 안정적인 반응이 나타난 것을 보여 주었다약물 응용 프로그램 (14) 후 2 ~ 3 시간. <ol><li> 위의 반복 제 5 절. </li><li> 관류 액에 약물을 추가합니다. 4-AP (250 μM) 및 bicuculline (5 μM)를 사용합니다. 균일하게 약물을 혼합하고, 2 ~ 3 시간 동안 재관류를 계속합니다. </li><li> 간질 유사 활성을 촉진하기 위해, 또한 pH를 구배의 형성을 방지 할 수있는 상대적으로 빠른 혈류 속도 (8 ml / 분)에서 관류 펌프를 유지한다. </li><li> 이동 단말에서 텅스텐 전극을 배치하고 ACC 응답 프로파일을 얻기 위해 전기 자극 (150 μA, 200 마이크로 초 시간)를 제공합니다. </li><li> 10 ~ 20 스윕을 확인하고 응답을 평균. </li><li> 약을 씻어 신선한 ACSF와 관류 솔루션을 교체합니다. 단계를 반복 6.5. </li></ol> 유발 두피 응답에 DCS 7. 시험 효과 <ol><li> 반복 섹션 3과 4는 균일 한 전계가 M 내부에 배치되는 두 개의 평행 한 AgCl을 코팅은 배선 사이에 전류를 통과시킴으로써 생성된다 확인EA 실. 아무 문제가없는 경우, DCS는 0.5 2mA 사이에 유지됩니다. </li><li> DCS의 전원을 끄고 (150 μA, 200 마이크로 초 지속 시간 ±) 시상을 자극 텅스텐 전극을 배치합니다. 는 ACC에서 최대 시냅스 반응을 얻을 10-20 스윕을하고 응답을 평균합니다. </li><li> 동시에 DCS (2 MV / mm의 DCS 강도) 및 시상 자극 (350 μA, 200 마이크로 초 기간)를 켭니다. DCS 동안 시상 자극-유발 ACC 응답의 진폭의 변화를 평가합니다. </li><li> DCS의 전원을 끄고 관류 액에 4-AP (250 μM) 및 bicuculline (5 μM)를 추가합니다. 그런 다음 2 ~ 3 시간을 기다립니다. 약물은 뇌 슬라이스에 영향을 미칠 경우, 슬라이스는 대뇌 피질의 발작 반응을 생산하고 있습니다. </li><li> ACC 응답의 10 ~ 20 스윕을 확인하고 전기 유발 대뇌 피질의 발작 응답의 진폭과 지속 시간을 측정한다. </li><li> 단계 7.5 이후, 동시에합니다 (DCS (2 MV / mm DCS 강도) 및 시상 자극에 150 μA, 200 durati을 설정마이크로 초에). DCS 응용 프로그램 중 진폭과 유발 대뇌 피질의 발작 응답 시간의 변화를 평가합니다. </li><li> 약을 씻어 신선한 ACSF와 관류 솔루션을 교체하고 반복 7.2 및 7.3 단계를 반복합니다. </li><li> 다른 실험 조건에 데이터를 기록 데이터를 모두 수집하고, 기. 다른 실험 조건 하에서 대뇌 발작 응답의 진폭 및 지속 시간을 평가한다. </li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> (예를 들어, MC 랙 소프트웨어)가 자동으로 기록 된 응답을 평균 소프트웨어를 사용하여 스프레드 시트에 원시 데이터를 내보낼 수 있습니다. 원시 데이터의 크기와 지속 시간을 분석하고 색상 수치를 생성합니다. </li><li> 진동 발작 이벤트를 검출하기 위해, 기준 값 및 표준 편차 (SD)를 측정하기 위해 소프트웨어를 사용한다. 임계 값과 잡음 레벨 3 SD를 설정합니다. 이 임계 값을 능가 발진 이벤트 기간 동안 피크의 진폭은 자동으로 감지됩니다에디션. </li><li> 학생의 t의 -test를 이용하여 통계 분석을 수행합니다. </li><li> 슬라이스의 수를 나타내는 N으로 고속 측정하고 평균 ± SE로서 텍스트의 변동 (ANOVA) 결과 일방향 분석 12 공부. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 이해관계가 없음을 선언합니다.

본 연구에서 ACC 간질 유사 활성에 DCS 기간 및 배향의 영향을 시험 하였다. 마우스 뇌 조각에서 안정적인 데이터를 얻으려면 어떻게 MT-ACC 경로의 무결성을 유지하고,이 각도 복부 상처와 피질의 지느러미를 잘라 만든되는, 특히 단계 핵심 손상을 방지 할 수 있습니다. 또한, 뇌 조각을 준비하는 시간은 신선하고 강한 뇌를 유지할 수 짧은 시간이어야 뇌 슬라이스의 활성에 영향을 미칠 수있다. 이전의 연구 대상 조직에 전기 화학적 손상이 생체 내 준비 15에서 발생할 수있는 것으로 나타났다. 시험 관내 뇌 슬라이스 제제는이 문제를 방지 할 수있다. 시험 관내 대비하여, 조직이 직접 따라서 전기 효과 (16)을 최소화 전극을 접촉하지 않습니다. DCS의 효과는 상이한 방향으로 배향 된 전극과 비교 하​​였다. 때 electrodES는 DCS가 유발 활동 (그림 3)에 영향을 미치지 않았다 90 ° 및 270 °...

간질은 흔한 신경 질환입니다. 간질 환자의 30%는 약물 내성 발작을 앓고 있다1. 경두개 직류 자극(tDCS)은 발작과 같은 큰 뇌 영역에 걸쳐 네트워크 활동을 제어하거나 변경하기 위한 비침습적 접근 방식을 제공합니다. 임상 연구에 따르면 tDCS는 난치성 발작을 효과적으로 치료하고2 발작에 대한 단기 및 장기 억제 효과를 나타낼 수 있다3-5. 그러나 tDCS 작용의 치료 메커니즘은 아직 불분명합니다. 제시된 뇌 절편 모델은 tDCS 작용의 치료 메커니즘이 발작과 같은 뇌 활동의 증상을 어떻게 변화시키는지 조사하기 위한 시험관 내 방법입니다. 따라서 최적의 효과를 얻으려면 방향, 전계 강도 및 자극 지속 시간을 포함한 특정 자극 매개변수를 실험 모델에서 테스트해야 합니다. 이전 연구에서는 전기장의 방향이 치료 효과를 얻는 데 중요하다는 것을 보여주었습니다6. 따라서 테스트된 뇌 절편의 위치에 대한 전극의 방향을 테스트하고 배열하는 것이 가능합니다.
전두엽 간질과 전대상피질(ACC) 발작은 종종 약물에 내성이 있습니다7,8. 일부 연구에서는 대상피질9-11에 tDCS가 적용되었다고 보고했습니다. tDCS는 ACC 활동의 변화를 통해 경계, 의사 결정 및 감정에 영향을 미치는 것으로 나타나며, 이 뇌 영역에서 신경 흥분성 및 발작 활동을 조절할 수 있습니다12. 그러므로, ACC 발작에 대한 tDCS의 억제 효과는 임상 치료 및 대체 치료법의 평가에 도움이 될 수 있습니다.
본 프로토콜은 뇌 절편의 DCS를 위해 기록실에 전극을 준비하고 다전극 어레이(MEA)를 사용한 발작 유사 활동 기록에 미치는 영향을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>마취제:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Halocarbon Products Corporation&nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>aCSF (total:1 L):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>MERCK</td><td>1.08337.1000</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>탄산수소나트륨</td><td>MERCK</td><td>1.06329.0500</td><td>25mM</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>MERCK</td><td>1.06404.1000</td><td>124mM</td></tr><tr><td>(+)-L-아스코르브산나트륨, >=98%</td><td>SIGMA</td><td>A4034-100G</td><td>0.15g/2 cc.c</td></tr><tr><td>황산마그네슘, 무수, ReagentPlus</td><td>SIGMA</td><td>M7506-500G</td><td>2mM</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물</td><td>MERCK</td><td>1.02382.1000</td><td>2mM</td></tr><tr><td>인산이수소나트륨 일수화물</td><td>MERCK</td><td>1.06346.1000</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>5 월 & Baker LTD Dagenham England</td><td>MS 7616</td><td>4.4 mM</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drugs:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Bicuculline</td><td>TOCRIS</td><td>0130</td><td>5 &micro; aCSF</td></tr><tr><td>4-아미노피리딘</td><td>TOCRIS</td><td>0940</td><td>250 &micro 중 M; M in aCSF</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Brain slice 준비:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>시리즈 1000</td><td>블록 슬라이싱 500 &micro; m 두께의 슬라이스</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>MEA 시스템:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEA(Multielectrode Array) 프로브: 6 x 10 평면 MEA</td><td>다중 채널 시스템</td><td>60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10</td><td>전극 직경, 30 & 마이크로; m; 전극 간격, 500 & 마이크로; m; 임피던스, 50 k&Omega; 200 Hz에서</td></tr><tr><td>다전극 어레이 (MEA) 프로브: 8 x 8 MEA&nbsp;</td><td>Ayanda</td><td>Biosystems 60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8</td><td>피라미드 형 전극; 직경, 40 &마이크로; m; 팁 높이, 50 & 마이크로; m; 전극 간격, 200 & 마이크로; m; 임피던스, 1,000 k&Omega; 200Hz에서</td></tr><tr><td>60채널 앰프는 1,200X 증폭에서 0.1Hz와 3KHz 사이의 대역 통과 필터 세트와 함께 사용되었으며</td><td>, 다중 채널 시스템</td>, 10KHz 샘플링 속도의 <td>MEA-1060-BC</td><td></td></tr><tr><td>MC 랙 소프트웨어</td>, <td>데이터 수집 및 기록용</td><td>다중 채널 시스템</td>, 펄스 발생기 제어용 다중 채널 시스템<td></td></tr>, <tr><td></td><td>다중 채널 시스템</td>, <td>STG 1002</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 앵커 키트 및 홀드다운</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>SHD-26H/10; WI64-0250</td><td></td></tr><tr><td>연동 펌프-minipuls3</td><td>Gilsom</td><td>MINIPULS3</td><td>관류 속도 : 8 ml/min</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>자극 시스템:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>절연 자극기</td><td>A-M 시스템</td><td>모델 2100</td><td>강도 &plusmn; 350 &뮤; A, 200 &mu의 지속 시간; sec</td></tr><tr><td>텅스텐 전극</td><td>A-M 시스템</td><td>575300</td><td>시상에 배치</td></tr></tbody></table>

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Cathodal 두개 직류 자극 (tDCS)의 약제 내성에 발작 억제 효과를 유도한다. 효율적인 동작을 수행하기 위해, 상기 자극 파라미터 (예를 들면, 방향 전계 강도와 자극 시간)을 마우스 뇌 슬라이스 제제에서 검사 될 필요가있다. 테스트 및 마우스 뇌 슬라이스의 위치에 전극의 상대적 배향을 정렬이 가능하다. 본 발명의 방법은 앞쪽에 cingulate 피질 발작 같은 활동에 대한 DCS의 효과를 평가하기 thalamocingulate 경로를 유지합니다. 다 채널 어레이 레코딩 결과 cathodal DCS 크게 -4- 아미노 피리딘과 bicuculline 유도 발작 같은 활성의 자극 - 유발 반응의 크기 및 지속 시간을 감소 것으로 나타났다. 이 연구는 또한 15 분에서 cathodal DCS 응용 프로그램이 thalamocingulate 경로에 장기 우울증의 원인 것으로 나타났습니다. 본 연구는 thalamocingulat에 ​​DCS의 효과를 조사전자 시냅스 가소성 및 급성 발작 같은 활동. 현재의 방법은 시험 관내 마우스 모델에서 방향 전계 강도와 자극 시간을 포함하여 최적의 자극 파라미터를 테스트 할 수있다. 또한,이 방법은 두 셀룰러 네트워크 레벨에서 대뇌 발작 같은 활동 DCS의 효과를 평가할 수있다.

Thalamocingulate 조각과 MEA 녹화 시스템 설치 프로그램의 준비 생쥐에서 MT-ACC 슬라이스가 thalamocingulate 경로의 전기 생리 학적 특성을 탐구 할 수있는 특별한 제제 슬라이스이다.도 1a는 MT-ACC 슬라이스 제조 된 방식을 나타낸다. 마우스의 뇌를 신속하게 제거하고 (도 1A, A, B)의 차가운 ACSF 산소로 유지 하였다. 피질을 해부 공개, 뇌, 시상 뇌 블록을 획득하기 위해 각 반구의 중심선으로부터 2.0 mm 측면을 절단 하였다 (도 1a, C, D). 두 각도 복부 상처는 thalamocingulate 경로를 유지하기 위해 뇌 블록 하였다. 제 광구는 뇌 블록의 전면에서 만들어진, 선조체에 보이는 섬유 관 평행. 제 크로스...

연구에 따르면 음극 경두개 직류 자극은 약물 내성 발작을 억제하는 효과를 낼 수 있습니다. 본 연구에서는 생쥐의 뇌 절편 제제에서 직류 자극 및 발작과 같은 활동의 다전극 어레이 기록을 평가하는 시험관 실험 설정을 고안했습니다. 직류 자극 매개변수를 평가했습니다.

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 뇌 슬라이스의 직류 자극을 위한 기록 챔버 내 전극 배치와, 이것이 다중 전극 어레이로 기록된 발작 유사 활동에 미치는 영향을 확인하는 것입니다. 이는 직류 자극에 관한 핵심 질문과 마우스 뇌 슬라이스에서 다중 전극 어레이로 기록된 발작 유사 활동에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 장점은 직류 자극의 효과를 마우스 뇌 슬라이스의 특정 경로에서 평가할 수 있다는 점입니다.본 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Hsiang Chin과 Wei-Jen Chang이 진행하겠습니다. 이 절차에서는 실험 시작 전 모든 수술 기구를 75% ethanol 용액으로 멸균하십시오. 그 다음, 동물의 두개골을 노출시키고 남아 있는 근육을 제거합니다.다음으로, 론저(rongeurs)를 사용하여 두개골의 배측 표면을 벗겨내고 측면을 다듬습니다. 이어서 스패튤라를 사용하여 뇌를 제거하기 전, 뇌의 복측 표면을 따라 후각구와 신경 연결 부위를 절단합니다. 뇌를 얼음처럼 차갑고 산소가 공급된 ACSF가 채워진 비커로 빠르게 옮깁니다.MT-ACC 경로를 포함하는 절편을 준비하려면, 각 반구의 정중선에서 외측으로 2 mm 지점에 시상절단면을 잘라 피질하 해부학적 구조가 나타나게 합니다. 그런 다음, 선조체에서 보이는 섬유 다발과 평행하게 각도를 주어 횡단면을 자릅니다. 두 번째 각도 횡단면은 소뇌와 시각 피질 사이의 연결 부위에서 시작하여, 시상 대상 경로의 복측에 있으며 이와 평행한 전교차와 시신경로 사이의 중간 지점까지 자릅니다.그 후, 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 뇌 블록을 각도 플레이트에 부착합니다. 경로의 전환점 바로 윗부분을 절단합니다. 그 다음, 플레이트를 펼쳐 평평하게 만든 후 바이브라톰(vibratome)의 챔버 스테이지에 접착하여 고정합니다.이어서 뇌 슬라이스를 500 micrometers 두께로 절편화하고, 얼음처럼 차갑게 냉각되어 산소가 공급된 ACSF에 보관합니다. 슬라이스를 산소가 공급된 ACSF가 지속적으로 관류되는 32 degrees Celsius의 기록 챔버로 옮겨 한 시간 동안 유지합니다. 다채널 시스템 상의 MEA 프로브 배치를 확인합니다.한 개의 튜브를 사용하여 ACSF를 MEA 챔버 내부로 유입시키고, 다른 튜브를 사용하여 ACSF가 챔버 밖으로 배출되도록 합니다. 30 °C의 따뜻하고 산소가 공급된 ACSF로 시료를 지속적으로 관류합니다. 젖은 면봉을 사용하여 뇌 절편을 MEA로 옮깁니다.뇌 절편을 조심스럽게 이동시켜 ACC가 전극 위에 오도록 배치한 다음, 절편 앵커로 뇌 절편을 고정하여 절편과 전극 사이에 양호한 전기적 연결이 이루어지도록 합니다. 그 후, 양극 전극은 ACC의 근위측에, 음극 전극은 ACC의 원위측에 배치합니다. MEA의 두 가지 전계 방향을 통해 전계 강도를 기록합니다.그 다음 자극기를 사용하여 전류를 전달합니다. 두 은-염화은 전극 사이의 거리를 약 1.5에서 2 cm로 조절하고, 자극기의 전류 강도를 조절하여 DCS를 0.5에서 2 milliamps 사이로 설정합니다. 이 과정에서 텅스텐 전극을 MT에 배치하고, 자극기로부터 슬라이스의 시상 영역에 펄스를 전달합니다.다음으로, 다양한 전류 강도를 사용하여 ACC 반응을 유도하는 역치를 결정합니다. 최적의 반응 프로필을 얻기 위해 텅스텐 전극을 시상-대상회 경로(thalamus cingulate pathway)를 따라 이동시킵니다. 1-20회의 ACC 반응을 기록하고, 소프트웨어를 사용하여 MT 자극에 의해 유도된 모든 ACC 반응의 평균을 자동으로 산출합니다.발작 유사 활동을 유도하려면, 관류액에 250 micromolar 48P와 5 micromolar bicuculline을 첨가하고 2~3시간 동안 슬라이스 관류를 계속합니다. pH 구배가 형성되는 것을 방지하기 위해 펌프를 비교적 빠른 관류 속도로 유지합니다. 다음으로, 텅스텐 전극을 MT에 배치하고 전기 자극을 전달하여 ACC 반응 프로파일을 얻습니다.10-20회의 스윕(sweep)을 기록하고 반응의 평균값을 구합니다. 그 후, 약물을 세척하기 위해 prefusion 용액을 신선한 ACSF로 교체합니다. 이 과정에서는 MEA 챔버 내부에 배치된 두 개의 평행한 염화은 코팅 은선 사이에 전류를 흘려 균일한 전기장이 생성되도록 합니다.문제가 없다면 DCS는 0.5에서 2 mA 사이를 유지해야 합니다. 다음으로 DCS를 끄고 텅스텐 전극으로 시상을 자극하십시오. ACC에서 최대 시냅스 반응을 얻으려면 10-20회 반응을 기록한 후 이를 평균냅니다.그런 다음, DCS를 켜고 동시에 시상을 자극하십시오. DCS 동안 시상 자극으로 유발된 ACC 반응의 진폭 변화를 평가하십시오. 이제 DCS를 끄고, 관류액에 250 µM 48P와 5 µM bicuculline을 첨가한 후 2-3시간 동안 기다리십시오.약물이 뇌 절편에 영향을 미치면, 해당 절편에서 피질 발작 반응이 나타나야 합니다. 이어서, 10-20개의 전대상 피질 반응을 수집하고, 전기적으로 유도된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간을 측정하십시오. 다음으로, DCS를 켜고 동시에 시상(thalamus)을 자극하십시오.DCS 적용 중 유발된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간의 변화를 평가합니다. 그 후, 약물을 세척하기 위해 관류 용액을 신선한 ACSF로 교체합니다. 이 그림은 ACC에서의 시상 자극 유발 반응, 약물로 유도된 발작 유사 활동, 그리고 시상 자극과 약물 유도 발작 유사 활동이 모두 포함된 서로 다른 유발 반응들을 보여줍니다.이 그림은 전기장 내의 서로 다른 방향, DCS를 이용한 시상 자극 유발 반응, 그리고 발작 유사 활동에 대한 음극 DCS의 효과와 같이 DCS의 다양한 방향성에 따른 영향을 보여줍니다. 또한, 이 그림에서 15분간의 음극 DCS는 장기 저압을 효과적으로 유도하고 유발 반응을 억제했음을 보여줍니다. DCS를 적용하지 않았을 때와 비교하여 15분간의 음극 DCS 적용 후 발작 지속 시간이 유의하게 감소했습니다.더 빠르게, 적절하게 수행된다면 기술적으로는 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 이어, 내성 발작 제어를 위한 비침습적 접근법 제공과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 경두개 자기 자극과 같은 다른 처치를 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 비침습적 치료 분야의 연구자들이 동물 모델에서 발작 치료법을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.본 영상을 시청하신 후에는 전류 자극을 통해 뇌 절편의 발작 유사 활성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

direct-current-stimulation-multi-electrode-array-recording-seizure

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 국소 자기장 전위를 측정하기 위해 다중 생크 선형 실리콘 프로브를 마우스 뇌에 이식하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 절차에는 프로브를 입체 장치에 고정하고, 표적 뇌 영역에 정확하게 배치하고, 뇌에 삽입하고, 치과 시멘트로 고정하는 것이 포함됩니다. 이식 후 어셈블리는 케이스로 보호됩니다. 회복 후 이 설정을 통해 국소 자기장 전위를 기록하여 뉴런 활동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

Multi-Shank Linear Silicon Probes를 사용하여 행동하는 마우스의 뇌 전기 활동 기록

이 프로토콜은 미세 전극 어레이(MEA)를 사용하여 발작 유도 약물에 노출된 뇌 절편의 전기 활동을 기록하는 것을 포함합니다. 이 절차에는 MEA 기록 챔버에 뇌 절편을 배치하고, 인공 발작을 유도하기 위해 전기 자극을 가하고, 결과 신호를 분석하는 것이 포함됩니다.

Monitoring Seizure-Induced Neural Electrical Activity in Brain Slices Using Microelectrode Arrays(미세 전극 어레이를 사용한 뇌 절편에서 발작 유도 신경 전기 활동 모니터링)

이 비디오에서는 전기 신호를 측정하기 위해 MEA(Multi-Electrode Array)를 사용하여 ACC(anterior cingulate cortex) 및 시상 영역을 포함하는 뇌 절편에 대한 경두개 직류 자극(tDCS)의 영향을 조사합니다. 이 연구는 전기 펄스를 전달하고 발작 유발 약물을 주입함으로써 발작에 대한 ACC 반응을 조사합니다.

발작 유도 물질에 대한 반응으로 multi-electrode array를 사용한 뇌 피질 모니터링

이 비디오는 쥐 뇌 절편의 간질 발작에 대한 직류 자극(DCS)의 영향을 평가하기 위한 연구를 보여줍니다. 연결된 내측 시상(medial thalamus, MT)과 전대상피질(anterior cingulate cortex, ACC) 영역을 포함하는 뇌 절편은 다전극 배열(multielectrode array, MEA)에 배치됩니다. MT에 대한 전기 자극과 발작 유발 약물을 적용하여 ACC에서 간질 발작을 유도합니다. 그런 다음 DCS를 적용하여 유발 발작에 미치는 영향을 평가합니다.

Impact of Direct Current Stimulation on Evoked Epileptic Seizures in Mouse Brain Slices(마우스 뇌 절편에서 유발된 간질 발작에 대한 직류 자극의 영향)

이 비디오는 피질 흥분성 피라미드 뉴런에서 광 활성화 양이온 채널을 발현하는 형질전환 마우스의 관상 피질 절편에서 ictal events의 유도를 보여줍니다. 절편은 기록실에 놓이고, 기록전극은 표재성 피질층에 삽입된다. 칼륨 채널을 차단하는 발작 유도 약물을 관류하면 뉴런은 과흥분 상태가 되고 자발적인 ictal 이벤트를 생성합니다. 온디맨드 ictal 이벤트를 생성하기 위해 짧은 광 펄스를 사용하여 피라미드 뉴런의 양이온 채널을 활성화하여 흥분성 신경 전달 물질의 방출을 트리거하여 시냅스 후 뉴런이 짧은 기간 동안 ictal 이벤트를 생성하도록 유도합니다.

생쥐의 뇌 피질 절편에서 자발적이고 온디맨드(on-demand) 익탈 사건의 발생(Generation of Spontaneous and On-Demand Ictal Events in Mouse Brain Cortical Slices)

우리는 여기서 인간의 간질 대뇌 피질 조직의 다중 전극 배열 녹음을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 간기 및 발작 사건의 간질 조직 절제술, 슬라이스 준비 및 다중 전극 배열 기록은 구체적으로 입증된다.

인간의 간질 수술 후 두피 조직의 다중 전극 어레이 레코딩

우리는 microelectrode 배열을 사용 하는 설치류 뇌 조각에 4 aminopyridine 이용한 epileptiform 활동의 기록 및 전기 변조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 사용자 지정 녹음 실 조직 생존 연장된 실험 세션에 걸쳐 유지합니다. 전극 매핑 라이브 고 자극 쌍의 선택 사용자 지정 그래픽 사용자 인터페이스에 의해 수행 됩니다.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

제시된 프로토콜은 잠재적인 항질 물질에 대한 전임상 평가 도구로 중요한 두뇌 조각을 사용하는 궁극적인 목표를 가진 절제된 인간 해마 조직의 수송 그리고 준비를 기술합니다.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

여기에서는 상보적 금속 산화물 반도체 고밀도 미세전극 어레이 시스템(CMOS-HD-MEAs)을 사용하여 생체 외 뇌 절편에서 발작과 같은 활동을 기록하는 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

Complementary Metal-Oxide-Semiconductor High-Density Microelectrode Array System을 사용한 급성 뇌 절편에서 고품질 발작 유사 활동

배우세요 마우스 뇌 조각에서 직류 자극과 다중 전극 배열을 이용한 발작 유사 활동 기록 방법. 이 기술은 약물 내성 간질 치료 연구에 활용됩니다.

마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

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