마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

이 실험 절차의 전반적인 목표는 뇌 슬라이스의 직류 자극을 위한 기록 챔버 내 전극 배치와, 이것이 다중 전극 어레이로 기록된 발작 유사 활동에 미치는 영향을 확인하는 것입니다. 이는 직류 자극에 관한 핵심 질문과 마우스 뇌 슬라이스에서 다중 전극 어레이로 기록된 발작 유사 활동에 대한 해답을 찾는 데 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 장점은 직류 자극의 효과를 마우스 뇌 슬라이스의 특정 경로에서 평가할 수 있다는 점입니다.

본 실험 절차의 시연은 저희 실험실의 기술자인 Hsiang Chin과 Wei-Jen Chang이 진행하겠습니다. 이 절차에서는 실험 시작 전 모든 수술 기구를 75% ethanol 용액으로 멸균하십시오. 그 다음, 동물의 두개골을 노출시키고 남아 있는 근육을 제거합니다.

다음으로, 론저(rongeurs)를 사용하여 두개골의 배측 표면을 벗겨내고 측면을 다듬습니다. 이어서 스패튤라를 사용하여 뇌를 제거하기 전, 뇌의 복측 표면을 따라 후각구와 신경 연결 부위를 절단합니다. 뇌를 얼음처럼 차갑고 산소가 공급된 ACSF가 채워진 비커로 빠르게 옮깁니다.

MT-ACC 경로를 포함하는 절편을 준비하려면, 각 반구의 정중선에서 외측으로 2 mm 지점에 시상절단면을 잘라 피질하 해부학적 구조가 나타나게 합니다. 그런 다음, 선조체에서 보이는 섬유 다발과 평행하게 각도를 주어 횡단면을 자릅니다. 두 번째 각도 횡단면은 소뇌와 시각 피질 사이의 연결 부위에서 시작하여, 시상 대상 경로의 복측에 있으며 이와 평행한 전교차와 시신경로 사이의 중간 지점까지 자릅니다.

그 후, 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 뇌 블록을 각도 플레이트에 부착합니다. 경로의 전환점 바로 윗부분을 절단합니다. 그 다음, 플레이트를 펼쳐 평평하게 만든 후 바이브라톰(vibratome)의 챔버 스테이지에 접착하여 고정합니다.

이어서 뇌 슬라이스를 500 micrometers 두께로 절편화하고, 얼음처럼 차갑게 냉각되어 산소가 공급된 ACSF에 보관합니다. 슬라이스를 산소가 공급된 ACSF가 지속적으로 관류되는 32 degrees Celsius의 기록 챔버로 옮겨 한 시간 동안 유지합니다. 다채널 시스템 상의 MEA 프로브 배치를 확인합니다.

한 개의 튜브를 사용하여 ACSF를 MEA 챔버 내부로 유입시키고, 다른 튜브를 사용하여 ACSF가 챔버 밖으로 배출되도록 합니다. 30 °C의 따뜻하고 산소가 공급된 ACSF로 시료를 지속적으로 관류합니다. 젖은 면봉을 사용하여 뇌 절편을 MEA로 옮깁니다.

뇌 절편을 조심스럽게 이동시켜 ACC가 전극 위에 오도록 배치한 다음, 절편 앵커로 뇌 절편을 고정하여 절편과 전극 사이에 양호한 전기적 연결이 이루어지도록 합니다. 그 후, 양극 전극은 ACC의 근위측에, 음극 전극은 ACC의 원위측에 배치합니다. MEA의 두 가지 전계 방향을 통해 전계 강도를 기록합니다.

그 다음 자극기를 사용하여 전류를 전달합니다. 두 은-염화은 전극 사이의 거리를 약 1.5에서 2 cm로 조절하고, 자극기의 전류 강도를 조절하여 DCS를 0.5에서 2 milliamps 사이로 설정합니다. 이 과정에서 텅스텐 전극을 MT에 배치하고, 자극기로부터 슬라이스의 시상 영역에 펄스를 전달합니다.

다음으로, 다양한 전류 강도를 사용하여 ACC 반응을 유도하는 역치를 결정합니다. 최적의 반응 프로필을 얻기 위해 텅스텐 전극을 시상-대상회 경로(thalamus cingulate pathway)를 따라 이동시킵니다. 1-20회의 ACC 반응을 기록하고, 소프트웨어를 사용하여 MT 자극에 의해 유도된 모든 ACC 반응의 평균을 자동으로 산출합니다.

발작 유사 활동을 유도하려면, 관류액에 250 micromolar 48P와 5 micromolar bicuculline을 첨가하고 2~3시간 동안 슬라이스 관류를 계속합니다. pH 구배가 형성되는 것을 방지하기 위해 펌프를 비교적 빠른 관류 속도로 유지합니다. 다음으로, 텅스텐 전극을 MT에 배치하고 전기 자극을 전달하여 ACC 반응 프로파일을 얻습니다.

10-20회의 스윕(sweep)을 기록하고 반응의 평균값을 구합니다. 그 후, 약물을 세척하기 위해 prefusion 용액을 신선한 ACSF로 교체합니다. 이 과정에서는 MEA 챔버 내부에 배치된 두 개의 평행한 염화은 코팅 은선 사이에 전류를 흘려 균일한 전기장이 생성되도록 합니다.

문제가 없다면 DCS는 0.5에서 2 mA 사이를 유지해야 합니다. 다음으로 DCS를 끄고 텅스텐 전극으로 시상을 자극하십시오. ACC에서 최대 시냅스 반응을 얻으려면 10-20회 반응을 기록한 후 이를 평균냅니다.

그런 다음, DCS를 켜고 동시에 시상을 자극하십시오. DCS 동안 시상 자극으로 유발된 ACC 반응의 진폭 변화를 평가하십시오. 이제 DCS를 끄고, 관류액에 250 µM 48P와 5 µM bicuculline을 첨가한 후 2-3시간 동안 기다리십시오.

약물이 뇌 절편에 영향을 미치면, 해당 절편에서 피질 발작 반응이 나타나야 합니다. 이어서, 10-20개의 전대상 피질 반응을 수집하고, 전기적으로 유도된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간을 측정하십시오. 다음으로, DCS를 켜고 동시에 시상(thalamus)을 자극하십시오.

DCS 적용 중 유발된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간의 변화를 평가합니다. 그 후, 약물을 세척하기 위해 관류 용액을 신선한 ACSF로 교체합니다. 이 그림은 ACC에서의 시상 자극 유발 반응, 약물로 유도된 발작 유사 활동, 그리고 시상 자극과 약물 유도 발작 유사 활동이 모두 포함된 서로 다른 유발 반응들을 보여줍니다.

이 그림은 전기장 내의 서로 다른 방향, DCS를 이용한 시상 자극 유발 반응, 그리고 발작 유사 활동에 대한 음극 DCS의 효과와 같이 DCS의 다양한 방향성에 따른 영향을 보여줍니다. 또한, 이 그림에서 15분간의 음극 DCS는 장기 저압을 효과적으로 유도하고 유발 반응을 억제했음을 보여줍니다. DCS를 적용하지 않았을 때와 비교하여 15분간의 음극 DCS 적용 후 발작 지속 시간이 유의하게 감소했습니다.

더 빠르게, 적절하게 수행된다면 기술적으로는 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 이어, 내성 발작 제어를 위한 비침습적 접근법 제공과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 경두개 자기 자극과 같은 다른 처치를 수행할 수 있습니다. 이러한 발전 이후, 이 기술은 비침습적 치료 분야의 연구자들이 동물 모델에서 발작 치료법을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

본 영상을 시청하신 후에는 전류 자극을 통해 뇌 절편의 발작 유사 활성을 평가하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.