마우스 뇌 조각 준비에서 발작 같은 활동의 직류 자극 및 다중 전극 배열 기록

이 실험 절차의 전반적인 목표는 뇌 절편의 직류 자극을 위해 기록 챔버의 전극 배열에 접근하고 다중 전극 어레이로 기록된 발작과 같은 활동에 미치는 영향에 접근하는 것입니다. 이것은 직류 자극에 대한 주요 질문에 답하는 데 더 도움이 될 수 있으며, 다중 전극 어레이는 마우스 뇌 절편에서 발작과 같은 활동을 기록했습니다. 이 기술의 장점은 직류 자극의 효과를 마우스 뇌 절편의 특정 경로에서 평가할 수 있다는 것입니다.

절차를 시연하는 것은 제 연구실의 기술자인 Hsiang Chin과 Wei-Jen Chang입니다. 이 절차에서는 실험 전에 모든 수술 기구를 75% 에탄올 용액으로 소독합니다. 그런 다음 동물의 두개골을 노출시키고 남은 근육을 잘라냅니다.

다음으로, 롱거를 사용하여 두개골의 등쪽 표면을 벗겨내고 측면을 다듬습니다. 그런 다음 주걱을 사용하여 뇌의 복부 표면을 따라 후각구와 신경 연결을 절단한 후 제거합니다. 뇌를 얼음처럼 차갑고 산소가 공급된 ACSF로 채워진 비커로 빠르게 이동합니다.

MT-ACC 경로를 포함하는 절편을 준비하려면 각 반구의 정중선 측면에서 2mm 떨어진 시상 절단을 하여 피질하 해부학적 구조를 표시합니다. 그런 다음 선조체에서 보이는 섬유 관과 평행하게 각진 십자가 절단을 만듭니다. 소뇌와 시각 피질 사이의 연결에서 복부에 있고 시상 대상 경로와 평행한 전방 커미셔와 시관 사이의 중간 지점까지 두 번째 각진 십자가 절단을 만듭니다.

그런 다음 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 각진 판에 뇌 블록을 부착합니다. 경로의 전환점 바로 위를 깎습니다. 그런 다음 플레이트를 펼치고 평평하게 펴서 비브라톰의 챔버 스테이지에 붙입니다.

그런 다음 뇌 절편을 500마이크로미터 두께로 절단하고 얼음처럼 차가운 산소가 공급된 ACSF에 보관합니다. 섭씨 32도의 기록 챔버로 슬라이스를 1시간 동안 지속적으로 산소가 풍부한 상태로 옮깁니다. 다중 채널 시스템에서 MEA 프로브의 배치를 확인합니다.

하나의 튜브를 사용하여 ACSF를 MEA 챔버 내로 안내하고 다른 튜브를 사용하여 ACSF를 챔버 밖으로 안내합니다. 섭씨 30도에서 따뜻하고 산소가 공급된 ACSF로 제제를 지속적으로 관류합니다. 젖은 면봉을 사용하여 뇌 절편을 MEA로 옮깁니다.

ACC가 전극 위의 방향을 향하도록 뇌 슬라이스를 조심스럽게 움직인 다음 슬라이스 앵커로 뇌 슬라이스를 안정화하여 슬라이스와 전극 사이의 양호한 전기 연결을 보장합니다. 그런 다음 양극 전극을 ACC에 근접하게 배치하고 음극 전극을 ACC 원위부에 배치합니다.MEA의 두 자기장 방향에 의한 전계 강도를 기록합니다.

그런 다음 자극기를 사용하여 전류를 전달합니다. 두 은염화물 전극 사이의 거리를 약 1.5-2cm로 조정하고 자극기 전류 강도를 조정하여 DCS를 0.5-2밀리암페어 사이로 만듭니다. 이 절차에서는 텅스텐 전극을 MT에 놓고 자극기에서 슬라이스의 시상 영역으로 펄스를 전달합니다.

다음으로, 다양한 전류 강도를 사용하여 ACC 응답을 유도하는 임계값을 결정합니다. 최적의 반응 프로파일을 얻기 위해 시상 대상 경로를 따라 텅스텐 전극을 이동합니다. 1-20개의 ACC 반응을 기록하고 소프트웨어를 사용하여 MT 자극을 유발한 모든 ACC 반응을 자동으로 평균화합니다.

발작과 같은 활성을 유도하려면 관류 용액에 250 마이크로 몰 48P 및 5 마이크로 몰 바이큐큘린을 첨가하고 2-3 시간 동안 슬라이스를 계속 펌핑합니다. 펌프를 비교적 빠른 관류 속도로 유지하면 pH 구배가 축적되는 것을 방지할 수 있습니다. 다음으로, 텅스텐 전극을 MT에 놓고 전기 자극을 전달하여 ACC 반응 프로파일을 얻습니다.

10-20번의 스윕을 기록하고 응답의 평균을 구합니다. 그 후, 사전 융합 용액을 새 ACSF로 교체하여 약물을 씻어냅니다. 이 절차에서는 MEA 챔버 내부에 배치된 두 개의 평행한 염화은 코팅된 은선 사이에 전류를 통과시켜 균일한 전기장의 생성을 보장합니다.

문제가 없는 경우 DCS는 0.5밀리암페어에서 2밀리암페어 사이로 유지되어야 합니다. 다음으로 DCS를 끄고 텅스텐 전극으로 시상을 자극합니다. ACC에서 최대 시냅스 반응을 얻으려면 10-20개의 반응을 기록한 다음 평균을 구합니다.

그런 다음 DCS를 켜고 동시에 시상을 자극합니다. DCS 동안 ACC 반응을 유발한 시상 자극의 진폭 변화를 평가합니다. 이제 DCS를 끄고 관류 용액에 250 마이크로 몰 48P 및 5 마이크로 몰 바이큐큘린을 첨가하고 2-3 시간을 기다립니다.

약물이 뇌 절편에 영향을 미치면, 그 절편은 대뇌 피질 발작 반응을 일으켜야 한다. 그 후, 10-20개의 전방 대상피질 반응을 수집하고 전기적으로 유발된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간을 측정합니다. 둥지를 틀고 DCS를 켜고 동시에 시상을 자극합니다.

DCS 적용 중 유발된 피질 발작 반응의 진폭과 지속 시간의 변화를 평가합니다. 그 후, 관류 용액을 새로운 ACSF로 교체하여 약물을 씻어냅니다. 이 그림은 ACC에서 시상 자극 유발 반응, 약물 유발, 발작 유사 활동, 시상 자극 및 약물 유도 발작 유사 활동을 모두 포함하는 다양한 유발 반응을 보여줍니다.

이 그림은 전기장에서의 다른 방향, DCS에 대한 시상 자극 유발 반응, 발작과 같은 활동에 대한 음극 DCS의 효과와 같은 DCS의 다양한 방향의 영향을 보여줍니다. 그리고 이 그림에서는 음극 DCS를 15분 동안 효과적으로 유발하고 장기 우울증을 유발하는 우울증 반응을 보였다. 음극 DCS를 15분 투여한 후 DCS를 적용하지 않은 경우와 비교하여 발작 지속 시간이 유의하게 감소했다.

더 빠르게, 이 작업은 제대로 수행되면 기술적으로 4시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차에 따라 저항 발작을 제어하기 위한 비침습적 접근 방식을 제공하는 것과 같은 추가 질문에 답하기 위해 경두개 자기 자극과 같은 다른 문제를 수행할 수 있습니다. 이 발달 후에, 이 기술은 비침범성 치료의 분야에 있는 연구원을 위한 동물성 모형의 발작 처리를 안으로 탐구하는 길을 닦았습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 뇌 절편에서 발작과 같은 활동을 평가하기 위해 현재 자극을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.