Name: 소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을 예쁜 꼬마 선충 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans 배아 신장의 조기 및 후기 단계에서 형태 발생 결함을 모니터링하는 방법을. 이 기술은 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 발달생물학 연구에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC)와 캐나다 혁신 재단의 보조금으로 지원되었습니다. let-502 (sb118ts) 균주에 대해 Paul Mains 박사 (캐나다 캘거리 대학교)에게 감사드립니다. 일부 균주는 NIH Office of Research Infrastructure Programs(P40 OD010440)에서 자금을 지원하는 Caenorhabditis Genetics Center에서 제공했습니다.

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200, 387-407 (2015).</li>
<li>Priess, J. R., Hirsh, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+morphogenesis%3A+the+role+of+the+cytoskeleton+in+elongation+of+the+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo.</a> Developmental biology. 117, 156-173 (1986).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tension-induced+mechanotransduction+pathway+promotes+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis.</a> Nature. 471, 99-103 (2011).</li>
<li>Diogon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoGAP+RGA-2+and+LET-502%2FROCK+achieve+a+balance+of+actomyosin-dependent+forces+in+C.+elegans+epidermis+to+control+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis.</a> Development. 134, 2469-2479 (2007).</li>
<li>Gally, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+regulation+during+C.+elegans+embryonic+elongation%3A+LET-502%2FROCK%2C+MRCK-1+and+PAK-1%2C+three+kinases+with+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles.</a> Development. 136, 3109-3119 (2009).</li>
<li>Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+integrates+the+activity+of+LET-502+Rho-binding+kinase%2C+MEL-11+myosin+phosphatase%2C+DAF-2+insulin+receptor+and+FEM-2+PP2c+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase.</a> Genetics. 156, 1671-1689 (2000).</li>
<li>Martin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pix-1+controls+early+elongation+in+parallel+with+mel-11+and+let-502+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans.</a> PloS one. 9, e94684(2014).</li>
<li>Sulston, J., Hodgkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+J+%22Methods%22">Methods</a>. Wood, W. B. , 587-606 (1988).</li>
<li>Andersen, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Powerful+New+Quantitative+Genetics+Platform%2C+Combining+Caenorhabditis+elegans+High-Throughput+Fitness+Assays+with+a+Large+Collection+of+Recombinant+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22G3+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains.</a> G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).</li>
<li>Boulier, E. L., Jenna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+Caenorhabditis+elegans+embryogenesis+using+RNA+interference+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).</li>
<li>Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+RNAi+screens+in+C.+elegans+and+C.+briggsae+reveal+the+impact+of+developmental+system+drift+on+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function.</a> PLoS genetics. 10, e1004077(2014).</li>
<li>Ramani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+majority+of+animal+genes+are+required+for+wild-type+fitness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The majority of animal genes are required for wild-type fitness.</a> Cell. 148, 792-802 (2012).</li>
<li>So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+body+size+in+C.+elegans+dependent+on+food+and+insulin%2FIGF-1+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+cells+%3A+devoted+to+molecular+%26+cellular+mechanisms%22%5BJournal%5D)">Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal.</a> Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).</li>
<li>Dineen, A., Gaudet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+can+act+from+multiple+tissues+to+regulate+C.+elegans+body+size%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size.</a> BMC developmental biology. 14, 43(2014).</li>
<li>Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+exposure+accelerated+the+aging+process+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+letters%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).</li>
<li>Yu, Z., Yin, D., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+combinational+effects+between+sulfonamides+and+metals+on+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

이 프로토콜은 초기 특성화하는 새로운 메트릭 및 배아 신장의 후반 단계에 대해 설명합니다. 섹션 1에서 중요한 단계는 패드 박테리아의 잠재적 인 존재이다. 배아는 밀봉 패드와 이미지 수집시 커버 슬립 사이에 동봉되어 있습니다. 슬라이드를 씰링하는 두 시간 이상 지속 취득 중에 동물의 탈수를 방지하기 위해 필요하다. 우리의 지식, 슬라이드와 커버 슬립 사이의 아가로 오스 패드를 장착하는 데 사용되는 실러의 아무도는 통기성 없습니다. 박테리아 (또는 배아) 다량의 패드 상에 존재하는 경우에 결과적으로, 그들은 그들의 조기 사망에 이르는 몇 시간 후, 산소를 박탈 할 수있다. 3 배 배아를 갖는 - 비 신장 배아에 비해 길이가 3 배입니다 배아에 해당하는 - 잠재적 인 저산소 조건의 좋은 지표가 될 것이다 관심의 배아와 함께 기록, 그 배아가 파묻혀 이동을 중지하기 때문에산소가없는 상태에서의 R 달걀 껍질. 어떤 형태 학적 측정은 저산소 조건 또는 죽은 배아에서 수행 될 수 없습니...

짧은 라이프 사이클 : 거의 50 년 동안 선충 예쁜 꼬마 선충 개발, 신경 생물학, 진화, 호스트 병원체 상호 작용 등의 중요한 문제를 연구하는 강력한 모델로 자리 매김 한 개발의 연구에서이 모델의 강도에 달려있다 삼일의; 이러한 동물은 유전자 조작 될 수있는 용이성; 대부분 여분의 자궁이다 살아있는 동물과 개발에 세포 변위 및 형태의 관찰을 가능하게 투명성. 선충의 발달 단계는 성인이 다음에 배아 네 애벌레 단계 (L4에 L1)를 포함한다. 배아 발생 동안, 표피 형태 형성 세포는 그들의 접합부를 재구성하는 방법을 그룹으로 마이그레이션 방법 상피의 더 나은 이해를 가능하게하고 개별적인 형태뿐만 아니라 기능적 상피 세포 내에서의 상대 위치를 수정하는 능력에 상당한 관심을 끌었다.표피의 형태 형성은 네 단계로 구분됩니다 지느러미 표피 세포의 구조 조정에 구성된 지느러미 인터에서, 하피라고 함; 따라서 상피 세포 단층의 배아를 감싸는 복부 정중선으로 복부 피하 세포의 이동에 구성된 복부 인클로저; 초기와 후기 신장 벌레 모양의 유충에 콩 모양의 배아를 변환. 다음과 같은 형태 형성, 배아 해치 및 L1 유충은 즉시 환경에서 사용 가능한 박테리아를 사용하여 먹이를 시작합니다. 배아 신장 따라서 배아 발달의 후기이다. 그것은 그것의 길이 방향 축을 따라 배아의 확장과 가로 직경의 감소로 구성되어 있습니다. 이것은 피하 세포의 형상 급격한 변형을 포함한다. 신장은 초기와 후기로 나누어진다. 몸 벽 근육이 w의 1.75 배 단계에서 계약 시작할 때 초기 단계는 쉼표 단계에서 시작 및 종료ILD 형 (중량) 배아 - 비 신장 배아에 비해 길이의 1.75 배입니다 배아에 대응. 그 단계에서 발생하는 형태 형성 공정은 주로 두 배의 안테 - 후방 축에 그들의 연장 운전 피하 세포의 꼭대기에 위치한 극 액틴 필라멘트 다발 FBS ()의 수축에 의해 구동된다. 이물 제거의 수축 세 키나제 LET-502 / ROCK, MRCK-1, PAK-1 (5)에 의해 미오신 라이트 체인의 인산화에 의해 컨트롤입니다. 몸 벽 근육의 기능이되어 계약을 시작할 때 신장의 후기가 시작됩니다. 그것은 지느러미와 복부 피하 세포에 몸 벽 근육에서 mechanotransduction 신호를 포함하고 동물 3 부화 할 때 끝납니다. 및 L1 유충 (애벌레 체포 표현형으로 그 체포 그들의 개발, 신장 결함은 일반적으로 배아로 죽어가는 동물의 비율 (EMB 배아 치사)을 특징으로 레벨a) 및 중량보다 훨씬 짧은 것을. 발달 체포의 단계의 확인은 죽은 태아의 현미경 관찰을 필요로하고 유충 3-6을 체포했다. 그것은 최근에 같은 Cdc42 / 라 세미 레귤레이터 및 이펙터 PIX-1과 박-1, 여러 유전자가, 초기와 후기 신장 3,7 둘 중에 형태 형성 과정을 제어하는 것으로 나타났다. 우리는 또한 최근에 형태 형성 과정 초기 신장 3 ~ 7시 배아의 안테 - 후방 축을 따라 차이가 있음을 보여 주었다. 이러한 연구 결과는 특히 초기 신장 동안 자신의 안테 - 후방 축을 따라 배아의 형태의 특성을 가능하게 일찍 또는 늦게 신장 단계 및 기타 측정을 대상으로 새로운 지표의 개발 동기를 부여. 이러한 새로운 방법은 폭뿐만 아니라 처음부터 초기 신장 끝에 배아의 길이를 측정하는 구성 그광고 및 꼬리. 7 두 프로토콜은 또한 L1 단계 7에서 동기화 새로 부화 유충의 길이를 측정하기 위해 개발되었다. 유충, 성인 및 배양액에 존재하는 세균이 처리에 의해 용해되는 동안 배아 달걀 껍질 알칼리 처리 염소산으로부터 보호. 이러한 처리 후, 잘 공급 성인 (8)의 대부분을 함유하는 비 - 동기화 집단으로부터 배아를 정화하는데 사용된다. 식품 제한은 새로 부화 유충을 동기화하는 데 사용됩니다. 이들 유충의 길이를 측정하는 것은 다음 신장 결함을 검출하기 위해 사용된다. 에서 부화 유충이 아닌 완전히 신장 배아가 공급 될 때 &quot;정상 길이&quot;로 복구 할 수 있지만, 음식이없는 구속 할 때 자신의 소형화를 유지하기 때문에이 측정은 배양 플레이트에 구속 유충의 측정보다 선호된다. 여기서는 르의 측정을 가능 상세한 프로토콜을 제시경과 DIC 현미경과 화상 해석 (1 프로토콜)을 사용하여 배아뿐만 아니라 헤드의 폭과 신장의 꼬리 ngth. 또한 화상 해석 (프로토콜 2) 플로우 세포 계측법 (3 프로토콜)을 사용하여 동기화 된 유충의 길이를 측정하기위한 구체적인 프로토콜을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>한천&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>Bioshop</td><td>AGA001.500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (염화칼슘)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>세척 용액&nbsp;</td><td>union Biometrica</td><td>300-5072-000</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>Fisherbrand</td><td>12-542B</td><td></td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisherbrand</td><td>12-552-3</td><td></td></tr><tr><td>고형광 제어 입자</td><td>union Biometrica</td><td>310-5071-001</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4(인산칼륨, 이염기성)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0447</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4(인산칼륨, 일염기성)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>PB0445</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4(황산마그네슘)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4(인산나트륨, 이염기성)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td></td><td></td>SDB0487</tr><tr><td>NaCl (염화나트륨)</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>Pebeo 드로잉 껌 45&nbsp; ml</td><td>p&eacute; b&eacute; o</td><td>모든 예술/공예품 매장</td><td>PDG033000</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>BioShop</td><td>PEP403.500</td><td></td></tr><tr><td>Sheath buffer</td><td>union Biometrica</td><td>300-5070-100</td><td></td></tr><tr><td>COPAS Biosort</td><td>union Biometrica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

배아 발달 중 형태 생성 과정의 변경을 제어하는 신호 전달 경로를 해부하려면 강력하고 민감한 메트릭이 필요합니다. 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장은 세로축을 따라 배아가 늘어나는 후기 발달 단계입니다. 이 발달 단계는 피하 세포와 기저 체벽 근육 사이의 세포 간 통신에 의해 제어됩니다. 이러한 신호 전달 메커니즘은 세포골격(cytoskeleton)과 세포-세포 접합부(cell-cell junctions)를 리모델링하여 피하 세포의 형태를 조절합니다. 유충 단계에서 배아 치사율 및 발달 정지를 측정하고 피하 세포와 근육 세포에서 세포 골격 및 세포-세포 접착 구조의 변화를 측정하는 것은 이러한 신호 전달 경로를 해부하기 위해 25년 이상 사용되어 온 고전적인 표현형입니다. 최근의 연구에서는 특히 조기 또는 후기 신장을 목표로 하고 배아의 전후 축을 따라 형태 생성 결함을 특성화하는 새로운 측정 방법의 개발을 필요로 했습니다. 여기에서는 신장 배아의 길이와 너비, 동기화된 유충의 길이를 정확하게 측정할 수 있는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이러한 방법은 신장을 조절하는 유전자를 식별하고, 이러한 유전자가 이 단계의 초기 및 후기 단계를 모두 제어하고 배아의 전후 축을 따라 균등하게 필요한지 여부를 평가하는 데 유용한 도구를 구성합니다.

헤드폰, Tail- 및 헤드 / 테일 폭 비율은 강력한 지표입니다. 여기에 설명 된 프로토콜이 성공적으로 조절기와의 Rho GTP 아제 PIX-1의 이펙터 기능, 박-1 특성화 렛 502 초 신장 7 동안 사용되어왔다. 구아닌 교환 인자 PIX-1 각각 박 -1- 코드 (GEF)과 RHO-1 7 이펙터에 대한 라 세미 / Cdc42 GTP 아제에 대한 구체적이고 할 수-502 코드 ...

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

이 실험군의 전반적인 목표는 배아 신장(embryonic elongation)의 초기 및 후기 단계에서 선충인 Caenorhabditis elegans의 발달 결함을 식별하는 것입니다. 이 방법은 발달 유전학 분야의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 또한, 배아 신장이라고 불리는 Caenorhabditis elegans 배아 발달의 후기 단계를 조절하는 유전자의 특성을 규명할 수 있게 해줍니다.이 기술군들의 주요 장점은 신장 과정의 초기 또는 후기 단계를 제어하는 유전자뿐만 아니라, 배아의 전단 또는 후단에서 형태 형성 과정을 제어하는 유전자들을 식별할 수 있다는 점입니다. 전 실험실 학생이었던 Olivier Rocheleau-Leclair와 함께 이 절차를 시연하겠습니다. 이 절차에는 Z-stack 타임랩스 현미경 관찰을 위한 DIC 렌즈, 프리즘 및 비디오 캡처 시스템이 필요합니다.먼저, 관찰을 위해 슬라이드에 고정된 시료를 배치합니다. 준비 상세 사항은 텍스트 프로토콜에 나와 있습니다. 저배율부터 시작하여 형태 형성 전 단계의 배아를 식별합니다.그 후, 오일을 한 방울 첨가하고 더 배율이 높은 대물렌즈를 사용하십시오. 이제 기록할 배아의 상단과 하단 지점을 확인하여 Z 스택 파라미터를 설정하십시오. 타임랩스 설정은 2분마다 이미지를 촬영하도록 설정하십시오.이미지 획득 사이에 라이트 셔터가 닫혀 있는지 확인하십시오. 초기 신장 현상을 포착하는 데 필요한 시간은 배아의 단계에 따라 1시간에서 8시간까지 다를 수 있습니다. 이제 이미지 획득 프로그램을 실행하고 결과를 저장하십시오.다음으로, Fiji ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석을 진행합니다. 이미지를 불러온 후, Hyperstack 보기 모드를 선택하십시오. 거기서 Lookup Tables의 Auto Mode를 적용하여 밝기와 대비를 조절합니다.다음으로, Analyze Set Measurements 항목으로 이동하여 파라미터를 설정합니다. 각 배아에 대해 Z Scale 바를 조절하여 배아의 중심점의 좋은 기준점이 되는 인두(pharynx)에 초점을 맞춥니다. 이제 특정 배아의 초기 신장(early elongation) 시작 시점에 맞춰 Time Scale 바를 조정합니다.이 시간을 기록하십시오. 그런 다음, Analyze Measure 도구를 사용하여 꼬리 끝에서 입까지 중앙선을 따라 선을 그려 배아의 길이를 측정하십시오. 이 길이를 기록하십시오.다음으로, 시간 지점을 초기 신장 이벤트의 종료 시점으로 조정한 후 길이를 다시 측정합니다. 이 값들을 사용하여 초기 신장의 지속 시간과 초기 신장 중의 길이 증가량을 계산하십시오. 너비의 변화 또한 직선 도구를 사용하여 머리의 중심선을 가로지르는 선을 그려 측정할 수 있습니다.이곳은 일관된 측정을 수행하기에 적합한 위치입니다. 꼬리의 중앙선에서도 동일하게 수행한 다음, 임의의 시점에서 머리-꼬리 비율을 계산하여 너비 변화를 점수화하십시오. 본 프로토콜을 위해 유세포 분석기는 대형 입자 흐름에 맞게 준비되어야 합니다.이러한 장치는 기본적으로 벌레 선별기가 됩니다. 시작하기 전에 레이저 블록, 컴프레서, 벌레 선별기와 소프트웨어를 가동하십시오. 소프트웨어에서 Start를 누르고 아르곤 레이저 제어 상태를 확인하십시오.Run 모드를 선택하고 레이저 출력이 약 10 milliwatts가 될 때까지 예열한 다음 Done을 선택하십시오. 최소 15분 동안 압력이 평형을 이룰 때까지 기다립니다. 이제 샘플을 준비하십시오.먼저, 동기화된 야생형 L1 10 µL를 시계접시에 넣고 현미경으로 죽은 알의 비율을 추정합니다. 추정치가 20%보다 크면 해당 샘플을 사용하지 마십시오. M9 용액에 들어 있는 동기화된 L1 약 700 µL를 15 mL 튜브로 옮기고 propidium iodide를 10 µg/mL가 되도록 첨가합니다.실온에서 30분 동안 염색되도록 둡니다. 이제 시스템을 준비하십시오. Sheath 및 Sample 유량 제어기를 사용하여 유량을 각각 5.1과 5.51로 조정하는 것이 매우 중요합니다.압력이 안정되면 Pressure Okay 상자를 클릭하십시오. 다음으로, Acquire 명령을 사용하고 튜브를 수동으로 가볍게 쳐서 샘플 컵과 분석 챔버 사이의 채널에서 기포를 제거하십시오. 잠시 후 Acquisition 창에 기포가 없음을 나타내는 표시가 나타납니다.이 과정 또한 실험에 있어 매우 중요합니다. 이제 형광 및 TOF 측정 파라미터를 설정하십시오. TOF, EXT, Green, Yellow 및 Red의 스케일을 256으로 설정하십시오.그런 다음, 명시된 대로 Gain을 설정합니다. 이어서 Green과 Yellow의 PMT Control은 700으로, Red의 PMT Control은 900으로 설정합니다. 이제 웜 소터(worm sorter)를 보정합니다.범용 고형광 대조 입자 20 milliliters를 샘플 컵에 넣고 소터에 장착합니다. 소프트웨어의 Tools에서 Run Control Particles를 선택하고 Acquire를 클릭합니다. 결과로 도출된 변동 계수가 11 이상이며 평균이 21 ± 6인지 확인합니다.그렇지 않은 경우, Clean 버튼을 클릭하거나 유로를 팅팅 쳐서 튜브를 세척하십시오. 이제 Tools에서 해당 명령의 체크를 해제하여 Control Particles 모드를 종료하십시오. propidium iodide를 이용한 웜의 30분 염색이 완료되면, 염색된 웜에 M9 10 milliliters를 추가하고 혼합하십시오.실온에서 최소 15분 동안 배양합니다. 이제 희석액 5 mL를 취해 M9 15 mL가 들어 있는 샘플 컵에 넣습니다. 이 희석액을 웜 소터(worm sorter)로 분석합니다. Acquire 버튼을 누르고 유속을 관찰하십시오.초당 15~25개의 개체가 통과하도록 적절한 유량을 확보하기 위해 벌레의 농도를 조절해야 할 수도 있습니다. 적절한 개체 농도가 되면, 용액 내 대조 입자의 최종 농도가 약 0.5~1x가 되도록 대조 입자를 테스트에 추가하십시오. 이제 Gating 메뉴에서 Gating Parameter를 TOF versus Green으로 조정하십시오.그 다음, 소팅(Sorting) 파라미터를 TOF 대 Red로 조정합니다. 이를 통해 대조군 입자를 사멸한 동물 및 생존한 동물로부터 분리할 수 있습니다. 이제 Acquire를 클릭하여 실험을 실행하십시오.약 8,000마리의 동물에 해당하는 약 10,000개의 객체를 분석합니다. 그다음 실험을 중단하고 Store를 클릭하여 분석을 위한 텍스트 파일로 데이터를 저장합니다. 머리 너비 측정의 견고성을 확인하기 위해, 1.2배 배아 단계의 야생형 배아 12개에 대해 5회 독립적으로 측정을 수행하였습니다.Brown-Forsythe 검정을 적용했을 때 데이터 간의 분산 차이는 나타나지 않았습니다. 머리 너비 측정과 관련된 재현성과 배치 효과는 서로 다른 3일 동안 4D DIC 이미징을 사용하여 테스트하였습니다. 이 세 가지 측정 그룹 전체에서 분산이나 배치 효과는 발견되지 않았습니다.서술된 두 가지 프로토콜 모두 야생형 및 돌연변이 배경에서 정지된 유충의 길이를 평가하는 데 사용되었습니다. 이미지 분석을 통해 마이크로미터 단위의 절대적인 길이 측정값을 얻었습니다. 본 실험에서 돌연변이체는 야생형보다 크기가 더 작았습니다.유세포 분석을 통한 길이 측정에서도 유사한 결과가 나타났습니다. 하지만 이러한 측정 방식은 훨씬 더 견고했습니다. 따라서 이 방법은 돌연변이 집단에서 더 미묘한 효과를 규명할 수 있을 것입니다.본 절차를 수행할 때는 분석 대상 균주 간의 공정한 비교를 위해 실험 전반에 걸쳐 일정한 유속을 유지하는 것이 중요합니다. 이 기술을 숙달하면 장비의 초기 보정 시간을 고려하더라도 유세포 분석법을 이용한 유충 길이 측정을 통해 하루에 18에서 24개의 조건 또는 돌연변이 균주를 특성화할 수 있습니다. 본 절차를 통해 우리는 하피 세포의 형태를 연구할 수 있습니다.이를 위해 형광 표지와 공초점 현미경을 사용하여 확인된 유전자의 분자적 기능을 특성화할 수 있습니다. 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide)는 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 항상 장갑과 보호 안경을 착용하는 등의 예방 조치를 취해야 함을 잊지 마십시오.

novel-metrics-to-characterize-embryonic-elongation-nematode

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

기본<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 방법 : 동기화 및 전망

우리는 기록하고 계량화 할 수있는 비디오 속도 추적 현미경 시스템을 개발...

C. elegans 추적 및 행동 측정

이 비디오는 야생형 또는 ALS 돌연변이 인간 TDP-43 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 운동 기능 장애를 평가하기 위해 방사형 운동 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 다양한 수준의 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 발현을 가진 웜은 크롤링할 수 있으며, 이들의 움직임은 분석 플레이트의 중심점에서 이동한 반경 거리로 측정됩니다. 이 분석은 다양한 예쁜꼬마선충 균주가 이동한 거리에 따라 경증, 중등도 및 중증 운동 장애를 구별합니다.

방사형 운동 분석법을 사용한 예쁜꼬마선충 모델의 운동 손상 평가

여기에서는 예쁜꼬마선충의 발달 과정을 추적하고 정량화하는 방법을 보여줍니다. 제시된 방법은 쉽게 구현할 수 있는 오픈 소스 도구를 기반으로 합니다. 3D 세포 모양 모델을 재구성하는 방법, 세포 내 구조를 수동으로 추적하는 방법, 피질 수축 흐름을 분석하는 방법을 보여줍니다.

의 발달 프로세스 추적 및 정량화<em&gt; C. 엘레</em&gt; 오픈 소스 도구를 사용하여

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

정자는 성공적으로 난 모 세포를 비료를 통해 이동 해야 합니다. 여기에서, 우리는 C에서 정자 이동 측정에 대 한 분석을 설명 합니다 .  이 분석은 결합 후 자 궁 내 정자 분포에 대 한 정량적 데이터 뿐만 아니라 속도, 방향 속도 및 반전 주파수를 제공 할 수 있습니다.

정자 지도 및 운동 성 아닌 간 남녀 양성 생식 기관에서 측정

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

이 작품은 한 번의 하룻밤 실행에 80-100 C. 예쁜 꼬마 배아에서 배아의 동시 3D 시간 경과 영상을 허용하는 반 높은 처리량 프로토콜을 설명합니다. 또한 데이터 분석을 간소화하기 위해 이미지 처리 및 시각화 도구가 포함되어 있습니다. 사용자 정의 리포터 균주와 이러한 방법의 조합은 배아 발생의 상세한 모니터링을 가능하게.

C. elegans 배아 개발을 분석하는 세미 고처리량 이미징 방법 및 데이터 시각화 툴킷

여기에서, 우리는 Caenorhabditis elegans embryos 를 준비하고 장착하고, 4D 현미경으로 개발을 기록하고 세포 계보를 추적하기위한 프로토콜을 제시합니다.

4D 현미경 검사: 노마르스키 현미경을 이용한 예쁜꼬마 선 충 배아 발달 풀기

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

학습하세요 Caenorhabditis elegans 배아 신장의 조기 및 후기 단계에서 형태 발생 결함을 모니터링하는 방법을. 이 기술은 유전자 조절 메커니즘을 연구하는 발달생물학 연구에 활용됩니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을

더 많은 동영상 탐색