그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

이 그래디언트 스트레인 칩의 전반적인 목표는 일련의 변형 조건에서 세포 거동을 조사하기 위해 3D 하이드로겔에서 비연속 그래디언트 정적 스트레인을 생성하는 간단한 접근 방식을 제공하는 것입니다. 이 방법은 줄기세포 분화 자극 및 인공 조직 기관 발달을 위한 세포 정렬 조절과 같은 생명공학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 거동을 비교하기 위해 동일한 마이크로 환경에서 세포층과 하이드로겔에 다양한 균주를 적용할 수 있다는 것입니다.

높은 세포 가변성을 보장하기 위해 실험 기반에 대해 3-4시간 내에 광이 완료되어야 하기 때문에 칩 준비 단계를 배우기가 어렵기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 젤라틴 가루 10g의 무게를 달아 100ml의 Dulbecco's phosphate buffered saline 또는 DPBS가 들어 있는 유리 플라스크에 넣습니다. 마그네틱 교반 막대를 플라스크에 넣고 플라스크를 교반 핫 플레이트에 놓습니다.

물의 증발을 방지하기 위해 플라스크를 알루미늄 호일로 덮으십시오. 핫플레이트 온도를 50-60도로 설정하고 교반기를 100RPM으로 1시간 동안 설정하여 젤라틴 분말을 용해합니다. 젤라틴이 녹은 후 피펫을 사용하여 메타크릴 무수물 8ml를 매우 천천히 첨가합니다.

섭씨 60도에서 3시간 동안 반응하게 합니다. 그런 다음 예열된 DPBS를 플라스크에 넣고 최종 부피가 500밀리리터가 되도록 합니다. 반응을 멈추기 위해 용액이 15분 동안 잘 섞이도록 합니다.

한편, 투석막을 25mm 길이의 튜브 여러 개로 자릅니다. 탈이온수에 15분 동안 담근다. 그리고 투석 튜브의 한쪽 끝을 닫도록 매듭을 만듭니다.

적당량의 폴리머 용액을 투석 튜브에 넣고 다른 쪽 끝을 닫습니다. 그런 다음 채워진 튜브를 탈이온수가 담긴 5리터 플라스틱 비커에 일주일 동안 놓습니다. 하루에 두 번 탈이온수를 갱신하고 투석 과정에서 용액을 섭씨 40-50도로 유지하십시오.

투석 후 튜브에서 용액을 500ml 유리병에 모읍니다. 500ml 필터 컵에 약 450-500ml의 용액을 붓습니다. 그리고 살균을 위해 용액이 필터 멤브레인을 통과하도록 진공을 적용합니다.

그런 다음 멸균된 폴리머를 여러 개의 50ml 멸균 튜브로 옮깁니다. 멸균된 폴리머를 여러 개의 50ml 멸균 튜브에 옮기고 영하 80도의 냉동고에 3-5일 동안 보관합니다. 영하 80도의 폴리머를 동결 건조기를 사용하여 일주일 동안 동결 건조하여 GelMA를 형성한 다음 영하 80도의 냉동고에 보관할 수 있습니다.

칩 제조를 위해 먼저 폴리메타크릴레이트 또는 PMMA를 준비하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재생 및 성형합니다. 그런 다음 PTMS 엘라스토머 30g과 PTMS 경화제 3g을 적절하게 혼합하여 PTMS 커버와 PTMS 플러그를 준비합니다. 진공 챔버에서 혼합물을 1시간 동안 가스를 제거합니다.

혼합물 1.8-2g을 PTMS 커버용 PMMA 몰드에 주조합니다. 또한 적절한 양을 사용하여 PTMS 플러그용 PMMA 금형의 각 캐비티를 채웁니다. 또한 10g의 경화되지 않은 PTMS 혼합물을 빈 10cm 플라스틱 플레이트에 주조합니다.

이 금형을 진공 챔버에 넣어 30분 동안 가스를 제거합니다. 섭씨 80도에서 2시간 동안 PTMS를 경화시킵니다. 금형에서 경화된 PTMS를 냉각시킨 후 PMMA 금형에서 PTMS 커버와 PTMS 플러그를 분리합니다.

그런 다음 PTMS 커버의 유동 채널 끝에 약 3mm 직경의 두 개의 구멍을 뚫습니다. 10cm 플라스틱 플레이트에서 성형 된 PTMS 시트를 1cm x 1cm 입방체로 자릅니다. 그리고 각 PTMS 큐브에 3mm의 구멍을 뚫습니다.

PTMS 커버의 개구부에 1cm x 1cm의 경화되지 않은 PTMS 큐브 2개를 붙여서 매체 저장소 역할을 하고 그래디언트 원형 하이드로겔 패턴의 경화 과정을 돕습니다. 그런 다음 섭씨 80도에서 1시간 동안 경화합니다. 그런 다음 PTMS 덮개를 두 개의 PTMS 저장소와 함께 TMSPMA 코팅 슬라이드에 접착합니다.

이를 위해 산소 플라즈마 기계 아래에서 PTMS 커버의 접착면과 TMSPMA 코팅 슬라이드를 90초 동안 전처리하십시오. PTMS 커버와 TMSPMA 슬라이드의 플라즈마 처리 표면에 접촉하고 실리콘 산소 실리콘 결합의 형성을 통한 영구적인 결합을 위해 단단히 누릅니다. 설정된 레이아웃을 투명 필름에 인쇄하여 포토마스크를 인쇄합니다.

그런 다음 인쇄된 포토마스크를 25mm x 37.5mm 크기로 자릅니다. 1.5ml 검은색 마이크로 원심분리기 튜브에 0.3ml의 예열된 세포 배양 배지에 25mg의 동결 건조 GelMA를 칭량합니다. GelMA가 배지에서 용해될 때까지 마이크로 원심분리기 튜브를 실험실 교반기 핫 플레이트에 놓습니다.

마이크로 원심분리기 튜브에 있는 DPBS 1ml에 광개시제 50mg을 추가합니다. 그리고 섭씨 80도의 오븐에 15분 동안 또는 광개시제가 녹을 때까지 놓습니다. 마이크로 원심분리기 튜브에 25마이크로리터의 10% 광개시제를 추가합니다.

잘 섞기 위해 여러 번 피펫을 사용하십시오. 다음으로, 자동화된 세포 계수기를 사용하여 300만 개의 NIH3T3 세포를 계수합니다. 현탁액을 200Gs에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 175마이크로리터의 세포 배양 배지에 세포를 재현탁합니다.

마이크로 원심분리기 튜브에 세포 용액을 첨가하여 5%GelMA, 0.5% 광개시제 및 밀리리터당 약 600만 개의 3T3 세포로 구성된 프리폴리머 세포 용액을 얻습니다. 혼합 후 100마이크로리터의 셀 프리폴리머를 100마이크로리터 마이크로주사기에 로드합니다. 포토마스크 조각을 멸균된 그라디언트 스트레인 칩의 하단 슬라이드에 수동으로 정렬합니다.

그리고 중간에 작은 탈이온수 한 방울을 사용하여 위치를 고정하기만 하면 됩니다. 프리폴리머 셀 용액이 로드된 100마이크로리터 마이크로주사기를 칩의 주입구에 연결합니다. 그런 다음 마이크로주사기를 사용하여 50마이크로리터의 프리폴리머 셀 용액을 흐름 채널에 놓고 PTMS 플러그를 사용하여 콘센트를 막습니다.

추가로 40마이크로리터의 용액을 주입하여 원형 PTMS 멤브레인에 볼록한 돌출부를 만듭니다. 포토마스크, 마이크로주사기, PTMS 플러그가 있는 칩을 UV 램프 아래로 이동합니다. 그리고 30-45초 동안 노출시켜 유체 챔버에서 동심원 원형 하이드로겔을 교차 연결합니다.

가교 후 PTMS 플러그와 마이크로 주사기를 제거하여 액체 압력을 해제합니다. 예열된 DPBS가 주입된 1ml 주사기를 사용하여 주입구에서 배출구까지 세척하여 가교되지 않은 수지를 세 번 세척합니다. 다음으로, 약 100마이크로리터의 세포 배양 배지로 유동 채널을 채웁니다.

멸균된 배양 접시에 칩을 넣고 섭씨 37도의 5% 이산화탄소 분위기에서 일주일 동안 배양합니다. 매일 매체를 새로 고칩니다. 대조군으로 4시간의 배양 후 0일차에 3개의 칩을 촬영합니다.

그리고 3일째에 3개의 칩을 20배 대물렌즈가 있는 현미경을 사용하여 실험 세트로 사용합니다. 압박 얼룩을 계산하는 소프트웨어를 사용하여 1라인에서 12라인까지 각 하이드로겔의 라인 너비를 측정합니다. 여기에 표시된 것은 UV 교차 결합 및 4시간 배양 후 주입 시 0 마이크로리터 및 40 마이크로리터의 하이드로겔 패턴의 대표적인 결과입니다.

비 과잉 주입 제어에서 3D 하이드로겔의 선폭은 예상대로 균일하게 보입니다. 그러나 주입 시 40마이크로리터의 하이드로겔 패턴은 하이드로겔의 그라데이션 선 너비를 제공하여 라인 1에서 라인 12로 감소합니다. 3일간의 배양 후 하이드로겔의 세포는 다른 방향으로 확장됩니다.

1번째 줄의 세포는 하이드로겔 신장의 자극으로 인해 방사 방향을 따라 정렬됩니다. 반대로, 12선의 세포는 하이드로겔 모양을 따라 정렬되며, 여기서 기하학적 단서가 세포 정렬을 지배합니다. 라인 1과 라인 12의 두 세포 정렬 신호가 서로 균형을 이루는 라인 7에는 특정 셀 정렬이 없습니다.

일단 측정하면 3D 하이드로겔에서 구배 변형률의 미시 환경을 적절하게 수행할 경우 구배 변형 칩으로 2시간 내에 수행할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 cell prepolymer 용액을 로드하기 전에 gradient strain chip을 멸균하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 또한 칩을 세포 배양 인큐베이터에 넣기 전에 75% 에탄올로 칩 표면을 철저히 닦습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 다양한 변형주 임페리얼에서 세포 거동을 조사하기 위해 그래디언트 변형 칩을 생성하는 방법을 매우 잘 이해하게 될 것입니다.