본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

이 절차의 전반적인 목표는 갓 분리된 온전한 마우스 대동맥에서 형광 염료 DAF-2DA 및 DHE를 사용하여 세포 내 산화질소와 과산화물 음이온을 동시에 검출하는 것입니다. 이 방법은 내피 기능 장애 및 eNOS 분리와 같은 심혈관 생리학 분야에서 연구자의 사례를 복구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 혈관에서 산화질소와 과산화물 음이온을 동시에 생체 외에서 직접 검출하고 시각화할 수 있는 간단하고 정확한 방법을 제공하는 것입니다.

이 프로토콜을 위해 섭씨 37도까지 가열하고 탄소 가스 탱크에서 95%의 산소, 5%의 이산화탄소 가스로 폭기할 수 있는 장기 수조 시스템을 구축합니다. 시작하려면 관심 조직을 목욕시키는 데 필요한 만큼 충분한 양의 새로운 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액을 준비합니다. 예를 들어, 한 실험에서 대동맥에 200밀리리터가 필요합니다.

오르간 수조 시스템을 켜고 열 조절기를 섭씨 37도로 조정합니다. Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer로 챔버를 세척한 후 각 챔버에 Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer를 5ml씩 추가하고 가스를 켜서 30분 동안 95%의 산소와 5%의 이산화탄소로 폭기합니다. 챔버를 덮어 두십시오.

또한 통기와 함께 얼음처럼 차가운 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액 한 병을 준비합니다. 흉부 대동맥을 절제한 후 즉시 얼음처럼 차가운 크렙스-링거 완충액이 있는 접시에 전체 조직을 담그십시오. 해부 현미경으로 심장과 대동맥궁을 제거하고 흉부 대동맥 분절을 완충액에 유지합니다.

그런 다음 수술용 가위와 집게를 사용하여 혈관 주위 조직이 부착되지 않도록 대동맥을 절개합니다. 다음으로, 집게를 사용하여 조직의 가장자리를 잡고 주사기에서 전달된 얼음처럼 차가운 크렙스-링거 완충액을 사용하여 혈관 내강에서 혈액을 부드럽게 씻어냅니다. 혈관 내강의 혈전은 인공 신호를 유발하고 형광 신호를 방해할 수 있으므로 씻어내야 하며, 동시에 내피층을 손상시키지 않도록 세척 강도를 조절해야 합니다.

이제 청소한 대동맥 고리를 3mm 길이의 세그먼트로 자릅니다. 청소한 대동맥 고리를 준비한 후 염색합니다. 혈관을 조이지 않고 겸자로 대동맥 고리의 외래 쪽만 만지면 청소된 대동맥 분절을 준비된 장기 욕조 챔버로 옮깁니다.

동맥이 완충액에서 30분 동안 평형을 이루도록 합니다. 30 분 후, 장기 욕조에 아세틸 콜린을 첨가하여 최종 농도 1 마이크로 몰을 제공하고 아세틸 콜린으로 10 분 동안 동맥을 배양합니다. 한편, 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 예열된 Krebs 완충액으로 1ml의 염색 용액을 준비합니다.

그런 다음 튜브 튜브를 호일로 싸서 빛 노출을 최소화하고 섭씨 37도로 유지합니다. 아세틸콜린 자극 후 장기 욕조의 대동맥 고리를 염색 용액 튜브로 옮기고 통기와 함께 어둠 속에서 30 분 동안 배양합니다. 이 시점부터 모든 단계는 최소한의 빛 노출로 수행해야 합니다.

다음으로, 대동맥 고리를 크렙스 완충액으로 채워진 새 튜브로 1분 동안 옮깁니다. 이 세척 단계를 세 번 수행합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드 용액이 담긴 수조에 대동맥 고리를 실온에서 30분 동안 고정합니다.

고정 단계 후 링을 DAPI 용액에 실온에서 3분 동안 옮겨 카운터 스테인을 도포합니다. 그런 다음 PBS로 대동맥 고리를 세척할 때마다 1분 동안 3회 세척합니다. 고리를 움직일 때 항상 내피 조직의 취약성에 민감해야 합니다.

현미경으로 슬라이드에서 미세 수술 가위로 대동맥 고리를 세로로 자릅니다. 그런 다음 대동맥을 젖은 상태로 유지하면서 대동맥에 있는 과도한 액체를 제거하십시오. 두 개의 미세수술 겸자를 사용하여 내피가 유리 슬라이드를 아래로 향하게 하여 말린 대동맥을 슬라이드에 평평하게 밀어 넣습니다.

이 과정에서 대변자를 앞뒤로 움직이지 마십시오. 이 단계는 매우 중요하지만 작동하기가 쉽지 않습니다. 공식 실험을 하기 전에 연습하는 것이 좋습니다.

그런 다음 대동맥에 장착 매체를 떨어뜨립니다. 슬라이드를 덮고 매니큐어로 밀봉하십시오. 어두운 곳에서 자연 건조시킨 후 컨포칼 현미경을 사용하여 슬라이드를 이미지화합니다.

200헤르츠 스캔 속도, 1024 x 1024 픽셀의 해상도 및 1/4 미크론의 z 스택 크기를 사용합니다. DAF-2DA를 관찰하려면 아르곤 레이저를 사용하고 흥분 형광을 488나노미터로, 방출 감지를 515나노미터로 설정하십시오. DHE를 관찰하려면 여기 형광을 514나노미터로 설정하고 검출을 605나노미터로 설정합니다.

10배 배율로 초점을 맞춘 후 대물렌즈를 40배 배율로 조정합니다. 이제 DAPI 염색 핵을 랜드마크로 사용하여 제어판의 z 위치를 조정하여 내피층의 범위를 정의합니다. 그런 다음 내피 경계의 내피층에서 내피층의 전체 두께를 통해 스캔하고 이미지를 기록합니다.

각 샘플에 대해 최소 3개의 서로 다른 시야를 스캔합니다. 어린 C57 블랙 6 마우스는 14 주 동안 고지방 식단을 먹임으로써 비만이되었습니다. 통제자들은 정상적인 차우를 먹였습니다.

14주 후, 흉부 동맥을 검사했습니다. 염색하기 전에 조직을 1나노몰에서 한 시간 동안 eNOS 억제제 L-NAME에 노출시켰습니다. 녹색으로 보이는 DAF-2T의 신호는 비형광 DAF-2에서 산화질소에 의해 변환됩니다.

따라서 염색은 세포에 산화질소가 존재한다는 것을 암시합니다. 마찬가지로, 과산화물에 의해 산화되면 DHE는 적색 형광 신호를 방출합니다. 따라서 더 많은 붉은색을 보이는 샘플은 세포에 더 많은 과산화물을 가지고 있습니다.

컨포칼 형광 이미지를 정량화한 결과, 고지방 식단을 먹인 쥐의 대동맥 내피층에서 산화질소 생성이 감소하고 L-NAME 민감성 초산화물 생성이 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 비만과 함께 eNOS 분리가 발생한다는 개념을 뒷받침합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 산화질소와 과산화물 음이온을 감지하는 방법과 손상되지 않은 혈관에 형광 염료를 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 6시간 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 전체 수술 절차 동안 내피층을 그대로 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 그리고 고정 단계 전에 내피 세포가 살아 있도록 항상 Krebs-Ringer 버퍼에 혈관을 담그십시오.

이 절차와 결합하면 혈관의 혈관 운동 반응 분석과 같은 다른 조치를 수행하여 혈관 긴장도를 조절하는 내피 세포의 생리학적 기능과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.