Name: 본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 마우스 대동맥에서 DAF-2DA와 DHE 형광 염료를 사용하여 산화 질소와 과산화물 음이온을 동시에 검출하고 시각화하는 방법을. 이 기술은 혈관 내피 기능 장애 및 eNOS 비결합 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 스위스 국립과학재단(310030_141070/1), 스위스심장재단, 스위스 국립연구역량센터(NCCR-Kidney.CH)의 지원을 받았습니다. Yu Yi는 중국 장학금 위원회의 지원을 받고 있습니다.

동물 작품은 프리 부르, 스위스의 수의학 사무실의 윤리위원회에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 우리 기관에서 동물 관리 및 실험에 대한 가이드 라인을 따른다. 격리 된 동맥의 배양을위한 셋업 1. 준비 <ol><li> 37 ° C로 가열하고, 탄소 가스 탱크 95 % O 2, 5 % CO 2 통기 될 수 기관 욕 시스템을 구축. </li><li> 다음 조성물의 농도가 필요한만큼 크렙스 - 링거 중탄산 버퍼 준비 (118 mM의 염화나트륨, 4.7 mM의 KCl을 2.5 mM의 CaCl2를 1.2 mM의 황산, 1.2 mM의 KH 2 PO 4, 25 mM의 NaHCO3을, 0.026 mM의 EDTA, 11.1 mM의 글루코오스 D). </li><li> 얼음에 주식 버퍼를 유지하고 95 % O 2 5 % CO 2와 버퍼를 공기에 쐬다. </li><li> 오르간 조 시스템 스위치는 37 ° C의 온도를 설정 한 각 실에 즉시 사용 완충액 5 mL를 추가95 %의 O 2 5 % CO 2와 버퍼를 폭기 유지. </li><li> 30 분 동안 크렙스 - 링거 버퍼에 한 번 실을 씻으십시오. </li><li> 각 실에 5 ml의 크렙스 - 링거 버퍼를 추가하고 증발을 방지하기 위해 챔버 커버. </li></ol> 마우스 대동맥 2. 분리 <ol><li> 마우스를 희생 150 밀리그램 / kg의 농도로 복강 0.9 % 염화나트륨에 용해 펜토 바르 비탈을 주사. </li><li> 수술 보드 드러 마우스를 놓습니다. </li><li> 위생 및 습기의 목적 70 % 에탄올로 가슴 영역 모피 스프레이. </li><li> 리브 주위에 절단 엽니 다 흉강은 심장과 폐를 노출하고, 폐를 제거합니다. </li><li> 종이 티슈로 부드럽게 흉강에 혈액을 제거합니다. </li><li> 집게로 조심스럽게 마음을 잡고 수술 가위로 대동맥과 척추 사이의 혈관 주위 지방 조직을 절단하여 흉부 대동맥을 분리합니다. </li><li> 즉시도 ë 몰입얼음 감기 (4 °에 C) 크렙스 - 링거 버퍼 전자 조직. </li><li> 해부 현미경으로 심장과 대동맥 궁을 제거하고 버퍼에 흉부 대동맥 세그먼트를 유지합니다. </li><li> 수술 가위와 집게와 현미경으로 혈관 주위 조직을 준수없는 대동맥을 해부하다. </li><li> 집게와 대동맥의 끝 가장자리를 잡고 조심스럽게 26 G × 1 / 2&quot; 주사기 크렙스 - 링거 버퍼를 세척하여 혈관 내강의 혈액을 멀리 세척합니다. </li><li> 3mm 길이 세그먼트로 청소 대동맥 고리를 잘라. 참고 : 내피 층을 손상하지 않도록이 단계에서주의를 기울이십시오. </li></ol> 3. DHE와 DAF-2DA 염색 <ol><li> 37 ° C에서 크렙스 - 링거 버퍼 가득 기관 목욕 챔버에 집게로 청소 대동맥 세그먼트를 이동시켜 95 % O 2, 5 % CO 2 폭기. 집게로 대동맥 반지의 터치 만 외막 측과 B를 고정하지 않습니다 참고들 (100d) 선박. </li><li> 30 분 기관 욕 실 동맥 평형. </li><li> 최종 농도 1 μM의 장기 욕조에 아세틸 콜린 (ACH)를 추가하고 10 분 동안 동맥을 품어. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 미리 예열 크렙스 - 링거 버퍼 (1,000 × 재고에서 희석 된 각 염료의 5 μM) DHE / DAF-2DA 용액 1 ㎖를 준비합니다. 빛의 노출을 피하기 위해 알루미늄 호일로 microcentrifuge 관을 감싸. </li><li> 자극 후, 37 ° C에서 마이크로 원심 튜브 DHE / DAF-2DA 용액 오르간 조로부터 대동맥 고리를 전송할 95 % O 2, 5 % CO 2 통기하고, 30 분간의 대동맥 고리를 배양한다. 참고 :이 단계에서, 어둠 속에서 항상 대동맥을 유지합니다. </li><li> 세척 크렙스 - 링거 버퍼와 새로운 microcentrifuge 관에 대동맥 고리를 전송하고 1 분 이내에 세탁을 세 번 반복한다. </li><li> 30 고정 용 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 대동맥 링을 이동시켜분. </li><li> 준비 1 ml의 4 &#39;, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)를 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 버퍼 (1,000 × 재고에서 희석 300 nm의) 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 솔루션입니다. 3 분 동안 대동맥을 Counterstain과. </li><li> 1 분 동안 세척 PBS 버퍼 새로운 microcentrifuge 관에 대동맥을 전송합니다. 세탁 세 번 반복합니다. 주 : 대동맥 고리를 고정 또는 내피 층이 손상되지 않도록주의를 기울이십시오. </li></ol> 설치 4. 욕실 얼굴 <ol><li> 슬라이드에 매체를 장착 한 방울을 추가합니다. </li><li> 겹쳐서 대동맥이 평평하고 유리 슬라이드 아래로 향하게 내피 세포와 설치 매체에 얼굴 엉 마운트, 현미경 미세 수술 가위로 길이 방향으로 대동맥 고리를 잘라. 앞뒤로 대동맥를 이동하지 마십시오. </li><li> 커버 슬립과 슬라이드를 덮고 매니큐어와 슬라이드를 밀봉. </li><li> 빛 보호 아래 공기 건조 후, 무서운 이미징에 대한 슬라이드를 사용ctly 또는 시간 이내에 다음 몇 일 동안 -20 ° C에 저장합니다. </li></ol> 5. 공 초점 현미경 이미징 <ol><li> 형광 신호를 검출하는 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용한다. 시스템에서 스위치 및 확대, 스캔 속도, 해상도, Z-스택으로 이미지 설정을 최적화 할 수 있습니다. <ol><li> 이 프로토콜의 경우, 024 × 024 픽셀의 200 Hz의 스캔 속도, 해상도 및 0.25 ㎛ 인 Z-스텝 크기를 사용한다. 반면 514 nm에서 DHE에서 형광을 흥분과 605 nm의 방출에 감지, 488 nm의 아르곤 레이저로 DAF-2DA에서 형광을 자극하고 515 nm에서 검출한다. </li></ol></li><li> DAPI 신호가 자외선 선명해질 때까지 샘플에 초점을 10 배 배율을 사용하고 40X 배율로 목표를 조정합니다. </li><li> 조작부 Z 위치를 조정함으로써 내피 층의 범위를 정의한다. DAPI 염색 핵의 신호 내피 층 타원형 또는 둥근 점이다. </li><li> 상단에서 스캔내피 세포 신호 및 기록 이미지의 전체 두께를 통해 샘플의 (루멘 국경에 내피 층). 각각의 샘플을 스캔 적어도 3 개의 필드를 선택합니다. </li></ol> 이미지 6. 분석 <ol><li> 공 초점 현미경으로 스캔 데이터를 엽니 소프트웨어를 사용합니다. 분석을 위해 필드 당 세 개의 연속 이미지를 선택하고 샘플 당 적어도 3 가지 분야를 평가한다. 선택한 이미지를 내보내고 JPEG 파일로 저장합니다. </li><li> 이미지 처리 소프트웨어로 염색 DAF-2DA, DHE 및 DAPI에서 이미지를 정량화. DAPI 염색의 이미지를 들어, &#39;플러그인&#39;을 선택 → DAPI 긍정적 인 핵의 수를 계산 → &#39;셀 카운터를&#39;분석 &#39;. <ol><li> DAF-2DA 및 DHE 염색에서 이미지의 경우, 신호의 강도를 분석 → &#39;측정&#39;을 &#39;분석&#39;을 선택하고, 상대적 신호 강도로 &#39;평균&#39;값을. DAF-2DA의 비율로 존재 그 결과DAPI 긍정적 인 핵 또는 DAPI에 DHE의 비율. 각 샘플에 대해, 각 필드 화상의 평균값을 취. </li></ol></li><li> 배 변화를 얻을 대조군의 평균으로 모든 샘플의 결과를 나눈다. 통계 분석은 던넷 또는 페로 니 사후 테스트와 짝이 학생 t 테스트 또는 ANOVA를 수행 하였다. SEM ± 평균과 같은 데이터를 제공합니다. P &lt;0.05 14에서 상당한으로 평균값의 차이를 고려한다. </li></ol>

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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

NO 또는 O (2)의 검출 .- 형광 염료 자주 조직 저온부 (23)에 또한 배양 된 내피 세포에서 많은 연구에 사용 하였다. 여기에서 우리는 얼굴 NO의 검출 및 O 2 .-, 비교적 간단하고 직관적 인 효과가 각각 DAF-2DA 및 DHE,와 내피 층의 수준 도중, 즉 그대로 살아있는 혈관에이 방법을 확장했다. 동맥 미디어 탄성 섬유, 특히 저온부에서 대동맥 특정 NO 또는 O이 방해 할 수있는 매우 강한 형광도 신호를주고 이후 혈관 저온부의 방법에 비해,이 방법은 낮은 배경 프로그램 등 정량적이다. - 내피 세포에서 생성 된 신호. 또한, 내측 평활근 세포의 NADPH 산화 효소 또는 다른 효소에 의해 특이 O 2 .- 생성은 방해 할혈관 저온부와 방법의 문제점을 나타내는 부분의 혈관에서 혈관 내피...

혈관 내피 세포는 혈관 활성 인자 1을 해제하여 혈관 기능 및 구조적 무결성을 유지합니다. 이러한 요인 중 내피 NO 신타 제 (eNOS의)를 통해 L 아르기닌으로부터 생성 내피 - 유도 질소 산화물 (NO)이 심혈관 생리학에서 가장 중요하고 가장 특징 요소이다. NO 따라서 혈관 질환 개발 3 보호에 피하 공간으로 혈소판 응집 및 염증 세포의 부착 및 침윤을 억제 평활근 이완을 유발하고 세포 증식을 억제한다. 등 노화, 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 등 많은 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 특징 내피 기능 장애는 NO 생체 이용률을 감소하지 않고 O 2 .- 생산이 존재하고 동맥 경화증 2의 발병을 촉진 증가했다. 최근의 연구에서 eNOS의 언 커플 링이를이 있음을 입증다양한 상기 조건 1,4에서 eNOS의 효소는 O 2를 생성하는 내피 기능 장애, .- 대신 NO의 중요한 메커니즘. 따라서, 혈관 내피 기능의 분석, 특히 NO 생산 내피없고 O 2 .- 생성 심혈관 질병 및 합병증에 대한 실험적 연구에 중요한 것이다. 분석 및 생물학적 샘플에서 NO 생성을 측정하지하기 위해 개발 된 다양한 방법 론적 접근 방법이있다. 및 NO 3 - - 때문에 쉽게 NO 2로 산화되어 NO의 매우 불안정한 특성으로 3 초 6의 반감기, 어떠한 직접 측정하지 어렵다. / NO 3 - - NO 2 판정 따라서 유체 시료는 세포 나 조직을 5 NO 방출의 지표로서 사용 하였다. 절차가 비교적 용이하지만, 상기 방법은, 그러나, EA/ NO 3 - - 솔루션에 포함 된 sily 안정 NO 2의 높은 배경에 의해 영향을. NO가 클릭 구아노 신 모노 포스페이트 (cGMP) 6을 생산하는 가용성 구 아닐 레이트 사이 클라 제를 자극하기 때문에, 세포의 cGMP 수준은 NO 릴리스 7 견적 않음 결정되었다. 다시이 간접적 인 추정 및 C 형 나트륨 이뇨 펩티드 (CNP) 일부 내피 세포 유래 인자는 입자상 아닐 레이트 시클 라제의 활성화를 통해 8의 cGMP 수준을 향상 할 수 있기 때문에, 특정하지 않을 수있다. NO 부산물 (9), L - 시트룰린 생산의 측정 따라서도 NO 생성을 추정하지하는 간접적 인 방법으로 사용되는로 L - 시트룰린의 생성과 L 아르기닌에서 생산되지 않습니다. 이 방법의 주요 단점은 방사성 그것은 생체 활성 NO 수준을 측정하지 않도록하고, O 2 NO 빠르게 불 활성화 될 수있는 해제 이후 .-; 또한, L - 시트룰린은 L- 재활용 할 수있다10 아르기닌. 이러한 화학 발광 검출 (11), 전자 스핀 공명 (12), 또는 전기 포르피린 NO 센서 (13)를 같은 다른 화학적 방법은 여러 연구자에 의해 사용됩니다. 이 방법은 일반적으로 검출 절차 운영에 쉽지 않다 및 특수 장비가 필요합니다. 그것은 많은 연구 또는 내피 기능을 평가하고 간접적으로 내피 세포 유래 NO 매개 혈관 이완을 측정 할 수있는 내피없이 격리 된 혈관과 장기 목욕 실험을 적용 할 것을 언급 할 수도있다. 그것은 주로 생리 학적 상황에 가까운, 그러나 있지만 그러나이 방법은, 엄격하게 말을, 어떠한 기능을 측정하지 않습니다, 오히려의 생산 eNOS의 기능의 순 효과를 반영 일반적으로 내피 세포 매개 성 혈관 운동 반응을 평가 다른 내피 세포 유래 휴식 계수 및 내피 - 유도 수축 인자 O 2 .-의 생산 및 평활근 세포의 응답도이러한 요인이다. eNOS의 기능 또는 NO 생산의 구체적인 분석은 일반적으로 3 필요합니다. 우리 포함한 많은 연구 그룹은 NO 14-19 세포의 생산을 검출하는 형광 염색 방법을 사용 최근있다. 이 방법에서, 세포 투과 형광 표시 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA)은 시험 관내 또는 생체의 조직과 세포를 살아있는 무료 NO 및 NOS 함수를 측정 하였다. 원리는 살아있는 세포에서 DAF-2DA는 비 형광 4,5-diaminofluorescein에 세포 내 에스 테라 제에 의해 탈 아세틸되는 것을 다음 NO와 반응하여 DAF-2 트리아 졸 (DAF-2T)를 형광등으로 전환되었다 (DAF-2) . DAF-2T에서 형광을 형광 현미경 또는 형광 공 초점 현미경 (14)으로 관찰 할 수있다. 세포 내 형광 강도 따라서 세포에서 세포 내 NO의 생산 그대로 혈액 vesse에서의 내피 세포를 반영엘. 이러한 dihydroethidium (DHE)와 같은 특정 형광 염료와 조합 한 동시에 세포 또는 혈관 (14)에 세포 NO와 O 2 .- 발생을 평가할 수있다. 마찬가지로 DHE는 세포 투과성 O 2에 의해 산화되는 화합물 .- 균체 내에하고 핵산과하게 인터 형광 현미경, 형광 ​​공 촛점 현미경으로 정량적 검출 밝은 적색을 방출하는 산화 생성물도이다. 그것은 본질적으로 슈퍼 옥사이드 라디칼 감지 세포에 의해 잘 유지되고, 심지어 가벼운 고정 (20)를 허용 할 수 있으므로 DHE는 O 2 .- 생물학적 시료에서의 검출을위한 매우 구체적인 염료이다. 이 형광 염색 방법의 장점 중 하나는 검출에 직접 생체 혈관 내피 손상 층 en 얼굴 NO 및 / 또는 O 2 .- 가시화한다는 것이다. 본 논문에서는,우리는이 형광 염료 NO를 감지하는 방법 및 O 2 .- 우리가 얼굴 NO의 검출 및 O 2 욕실 개조 한 설명 .- 높은 지방 다이어트 (HFD) 공급에 의해 유도 된 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에서. 우리는이 방법이 성공적으로 안정적 NO와 O 2 .- 수준을 측정하고 비만에서 갓 고립 그대로 마우스 대동맥의 내피 층에서 eNOS의 (DYS) 기능을 평가할 수 있다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>디 하이드로 에티듐 (DHE)</td> <td>Invitrogen</td><td>D 1168</td>은 <td>DMSO로 5&nbsp; mmol/L을 1,000x 재고로 저장, -20&nbsp에 저장; &데그; C</td></tr><tr><td>Diaminofluorescein-2 Diacetate (DAF-2DA)</td> <td>Calbiochem</td><td>251505</td><td>DMSO로 용해 5&nbsp; mmol/L을 1,000x 재고로 저장, -20&nbsp에 저장; &데그; C</td></tr><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>D 1306</td>은 <td>물로 300&nbsp; &마이크로; mol/L을 1,000x 재고로 4&nbsp에 저장; &데그; C</td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>벡터 노동. (리액톨랩)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>N&#969; -Nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>N5751</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P3636</td><td></td></tr><tr><td>다중 근사진 시스템&nbsp;</td><td>덴마크 Myo Technology A/S</td><td>모델 610M</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경&nbsp;</td><td>라이카&nbsp;</td><td>DM6000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>이미지 처리 소프트웨어</td><td>National Institute of Health (NIH)</td><td>Image J&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위&nbsp;</td><td>에스& T AG</td><td>SDC-11</td><td></td></tr><tr><td>미세수술용 가위&nbsp;</td><td>F.S.T</td><td>15000-01</td><td></td></tr><tr><td>겸자</td><td>S& T AG</td><td>JF-5</td><td></td></tr><tr><td>커버슬립 원형 직경 15&nbsp; mm</td><td>VWR</td><td>631-1579</td><td></td></tr><tr><td>팁 1 ml</td><td>VWR</td><td>RFL-1200c&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>팁 200 &#956; l</td><td>VWR</td><td>613.0659</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 ml</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30120086</tr><tr><td>아세틸 콜린 클로라이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>A-6625</td><td></td></tr></tbody></table>

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

내피 NO-합성 효소 (eNOS의)에서 생산 내피 세포에서 파생 된 질소 산화물 (NO) 심장 혈관 생리학에서 가장 중요한 vasoprotective 분자의 하나입니다. eNOS의의 언 커플 링이 슈퍼 옥사이드 음이온에서 NO 생체 이용률 및 증가 감소 리드로 장애 eNOS의 예 (O 2 .-) 생산, 차례로 심혈관 질환을 촉진한다. 따라서, 내피 세포에서 NO와 O 2 .- 수준의 적절한 측정이 심혈관 질환과 합병증에 대한 연구를위한 중요한 있습니다. 때문에 NO와 O 2 .-의 매우 불안정한 특성 때문에 NO 측정하고, O 2 .- 직접 혈관에 어렵다. 수많은 방법은 NO 측정 및 O 2 .- 생산하기 위해 개발되었습니다. 이것은, 그러나, 어느 둔감 또는 비특이적 또는 기술적으로 요구하고, 특수 장비를 필요로한다. 여기에 우리가 적응을 설명얼굴의 동시 검출 및 세포 NO와 O 2의 시각화 도중에 .- 유도 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥에 각각 세포 투과성 diaminofluorescein -2- 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하는 형광 염료 방법 높은 지방 다이어트 먹이로. 제어 린 마우스에 비해 우리는 비만 마우스의 갓 고립 그대로 대동맥 2 .- 수준을 세포 내 NO 감소 O를 향상 것을 보여줍니다 수 있습니다. 우리는이 방법은 직접 검출 및 시각화 NO와 O 2를위한 쉬운 기술 .- 그대로 혈관에 널리 (물리 치료사) 병리학 적 조건에서 내피 (DYS) 함수의 조사를 위해 적용 할 수 있다는 것을 보여줍니다.

비만은 허혈성 심장 질환의 주요 위험 인자와 관련된 어떠한 생물학적, 동맥 경화성 혈관 질환 (21)의 특징 내피되지 감소된다. -eNOS의 언 커플 링 (22), 죽상 동맥 경화증, 비만 14 노화 등 다양한 생리 학적 및 병리학 적 상태에서 혈관 내피 기능 부전의 중요한 메커니즘으로 도시되었다. 따라서, 우리가 대표 NO의 결과와 O 2 .- 대동맥의 수준을 보여 마른 비만 쥐를 비교합니다. 10.6 %, 지방 27.6 %의 단백질, 57 %의 탄수화물, 섬유 4.8 % 에너지 함량 7 주 세의 나이에 시작, 수컷 생쥐 (C57BL / 6J)는 중 정상 우 (NC 14 주 동안 무료로 액세스 권한을 부여했다 ) 또는 고지방식이 (HFD 에너지 함량 : 55 %...

이 문서에서 우리는 형광 염료를 엉 얼굴 동시 탐지 및 세포 내 산화 질소의 시각화 (NO)과 슈퍼 옥사이드 음이온 (O 2 diaminofluorescein-2 디 아세테이트 (DAF-2DA) 및 dihydroethidium (DHE)를 사용하여 적응 상대적으로 쉬운 방법을 설명 .- )는 각각 갓에 비만 마우스 모델을 그대로 대동맥을입니다.

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

이 절차의 전체적인 목표는 형광 염료인 DAF-2DA 및 DHE를 사용하여 갓 분리한 온전한 생쥐 대동맥에서 세포 내 일산화질소와 초과산화물 음이온을 동시에 검출하는 것입니다. 이 방법은 혈관 내피 기능 장애 및 eNOS 언커플링(uncoupling)과 같은 심혈관 생리학 분야 연구자의 사례에서 실험적 회복에 도움을 줄 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 온전한 혈관 내에서 일산화질소와 초과산화물 음이온을 ex vivo에서 동시에 직접 검출하고 시각화할 수 있는 간단하고 정밀한 방법을 제공한다는 것입니다.본 프로토콜을 위해, 37°C까지 가열이 가능하며 탄소 가스 탱크의 95% oxygen, 5% carbon dioxide 가스로 통기할 수 있는 장기 욕조(organ bath) 시스템을 구축하십시오. 우선, 분석 대상 조직을 침전시키기에 충분한 양의 신선한 Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer를 준비합니다. 예를 들어, 한 번의 실험에서 대동맥을 처리하는 데 200 milliliters가 필요합니다.오르간 배스(organ bath) 시스템의 전원을 켜고 온도 조절 장치를 37 °C로 맞춥니다. 챔버를 Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer로 세척한 후, 각 챔버에 Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer 5 mL를 넣고 가스를 켜서 95% oxygen과 5% carbon dioxide로 30분 동안 폭기합니다. 챔버 덮개를 닫은 상태를 유지하십시오.또한, 통기 처리를 한 얼음처럼 차가운 Krebs-Ringer Bicarbonate Buffer를 병에 준비합니다. 흉부 대동맥을 절제한 후, 즉시 조직 전체를 얼음처럼 차가운 Krebs-Ringer buffer가 담긴 접시에 담급니다. 해부 현미경 하에서, 흉부 대동맥 분절을 버퍼 내에 유지한 상태로 심장과 대동맥궁을 제거합니다.그 다음, 수술용 가위와 포셉을 사용하여 혈관 주변 조직이 붙지 않도록 대동맥을 박리합니다. 이어서 포셉으로 조직의 가장자리를 잡고, 주사기를 통해 얼음처럼 차가운 Krebs-Ringer 완충액을 주입하여 혈관 내강의 혈액을 부드럽게 세척합니다. 혈관 내강의 혈전은 인위적인 신호를 생성하여 형광 신호를 방해할 수 있으므로 반드시 씻어내야 하며, 이때 내피 세포층이 손상되지 않도록 세척 강도를 조절해야 합니다.이제 세척된 대동맥 링을 3mm 길이의 세그먼트로 절단합니다. 세척된 대동맥 링을 준비한 후, 이를 염색합니다. 혈관을 압착하지 않도록 포셉으로 대동맥 링의 외막 쪽만 잡고, 세척된 대동맥 세그먼트를 준비된 장기욕 챔버로 옮깁니다.동맥을 완충액에서 30분 동안 평형 상태로 둡니다. 30분 후, 최종 농도가 1 µM이 되도록 아세틸콜린을 장기 욕조(organ bath)에 첨가하고, 아세틸콜린과 함께 동맥을 10분 동안 배양합니다. 그동안 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 미리 데워둔 Krebs 완충액을 사용하여 1 mL의 염색액을 준비합니다.그 다음, 빛 노출을 최소화하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 감싸고 37 °C로 유지합니다. 아세틸콜린 자극 후, 대동맥 링을 오르간 배스에서 염색액이 담긴 튜브로 옮기고 공기를 공급하며 암소에서 30분 동안 배양합니다. 이 시점부터 모든 단계는 빛 노출을 최소화하여 진행해야 합니다.다음으로, 대동맥 링을 Krebs 완충액이 채워진 새 튜브로 옮겨 1분간 둡니다. 이 세척 단계를 3회 반복합니다. 그 후, 4% 파라포름알데히드 용액이 담긴 배스에서 실온으로 30분 동안 대동맥 링을 고정합니다.고정 단계 후, 대조 염색을 위해 링을 상온의 DAPI 용액에 3분 동안 옮겨 둡니다. 그런 다음, 대동맥 링을 PBS로 1분씩 3회 세척합니다. 링을 이동시킬 때는 항상 내피 조직의 취약성에 유의하십시오.현미경 하에서 슬라이드 위에 놓인 대동맥 링을 미세 수술 가위로 세로 방향으로 절개합니다. 그다음, 대동맥이 젖은 상태를 유지하면서 과도한 액체를 제거합니다. 두 개의 미세 수술 포셉을 사용하여 내피세포 층이 유리 슬라이드 바닥을 향하도록 말려 있는 대동맥을 슬라이드 위에 평평하게 폅니다.이 과정에서 대동맥을 앞뒤로 움직이지 마십시오. 이 단계는 매우 중요하지만 조작하기 쉽지 않습니다. 정식 실험 전에 충분히 연습하는 것이 좋습니다.그런 다음, 대동맥 위에 마운팅 용액을 떨어뜨립니다. 슬라이드를 덮고 매니큐어로 밀봉합니다. 암실에서 공기 건조시킨 후, 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 촬영합니다.스캐닝 속도는 200 hertz, 해상도는 1024 x 1024 pixels, z-stack 크기는 0.25 µm로 설정하십시오. DAF-2DA를 관찰하려면 아르곤 레이저를 사용하고, 여기 형광을 488 nanometers로, 방출 검출을 515 nanometers로 설정하십시오. DHE를 관찰하려면 여기 형광을 514 nanometers로, 검출을 605 nanometers로 설정하십시오.10배 배율로 초점을 맞춘 후, 대물렌즈를 40배 배율로 조정합니다. 이제 컨트롤 패널에서 z 위치를 조정하여 DAPI 염색된 핵을 기준으로 내피층의 범위를 지정합니다. 그런 다음, 루멘 경계의 내피층부터 내피층의 전체 두께까지 스캔하여 이미지를 기록합니다.샘플당 최소 3곳의 서로 다른 시야를 스캔하십시오. 어린 C57 black 6 마우스에게 14주 동안 고지방 식이를 제공하여 비만을 유도하였습니다. 대조군에는 일반 사료를 제공하였습니다.14주 후, 흉부 동맥을 검사했습니다. 염색 전, 조직을 1nM의 eNOS 억제제인 L-NAME에 1시간 동안 노출시켰습니다. 녹색으로 나타나는 DAF-2T의 신호는 산화질소에 의해 비형광성 DAF-2로부터 전환됩니다.따라서, 염색 결과는 세포 내 일산화질소의 존재를 시사합니다. 마찬가지로, DHE는 superoxide에 의해 산화되면 적색 형광 신호를 방출합니다. 그러므로 적색이 더 많이 나타나는 시료일수록 세포 내에 superoxide가 더 많이 존재하는 것입니다.공초점 형광 이미지를 정량화한 결과, 고지방 식이 식이를 섭취한 마우스의 대동맥 내피층에서 일산화질소 생성은 감소하고 L-NAME 민감성 초과산화물 생성은 증가한 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 비만과 함께 eNOS 언커플링(uncoupling)이 발생한다는 개념을 뒷받침합니다. 이 영상을 시청한 후에는 일산화질소와 초과산화물 음이온을 검출하는 방법 및 온전한 혈관 내에서 형광 염료를 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 6시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 전체 수술 과정 내내 내피층을 온전하게 유지하는 것이 중요합니다. 또한 고정 단계 전까지 내피세포를 생존 상태로 유지하기 위해 혈관을 항상 Krebs-Ringer 버퍼에 담가 두십시오.혈관의 혈관운동 반응 분석과 같은 다른 측정법을 본 절차와 병행하면, 혈관 긴장도 조절에서 내피세포의 생리학적 기능과 같은 추가적인 질문에 대한 해답을 얻을 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

전자 상자 성체의 공명 (EPR) 분광학은 철 (II)-N-메틸-D-glucamine dithiocarbamate, 철 (MGD)를 사용하여 인간 neutrophils에서 소 대동맥 내피 세포와 초과 산화물 라디칼 음이온에서 질소 산화물을 감지하기 위해...

질소 산화물과 세포로부터 전자 상자 성체의 프로그램 공명 분광학에 의한 초과 산화물 음이온 급진적가 탐지 스핀 트랩을 사용하여

질소 산화물 (NO)의 내생적인 생산은 생물 학적 기능의 다양한 조절. 그것은 어떠한 기반 시그널링의 장애 또는 dysregulation이 많은 사람이 질병에 연루되어 있는지 점점 더 분명 해지고 있습니다. 메소드는 더 이상 metabolites 인간 질병에 대한 소설 진단 또는 전조 생체 자료를 제공할 수 없습니다 관련된 계량합니다.

질소 산화물 Bioactivity을 시금을위한 분석 기법

혈관 세포 기능은 세포 내 메신저의 활성에 따라 달라집니다.  여기에 설명된 것은 고립된 대동맥의 개별 내피 및 평활근 세포에서 생리학적 및 약리학적 자극에 반응하여 세포 내 칼슘 및 산화질소 수준을 측정할 수 있는 생체 외 이광자 이미징 방법입니다.

세포 내 칼슘의 두 광자 이미징<sup&gt; 2 +</sup&gt; 고립 된 쥐 대동맥의 취급 및 내피 세포에서 산화 질소 생산과 부드러운 근육 세포

1차 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 미세유체 네트워크 장치 내에서 합류하도록 성장했습니다. 내피 세포 접합부와 F-액틴 분포를 설명하고 아데노신 삼인산(ATP)에 대한 반응으로 세포 내 칼슘 농도 및 산화질소 생성의 변화를 개별 세포 수준에서 실시간으로 정량화했습니다.

개발 및 특성화의<em&gt; 체외</em&gt; 미세 혈관 네트워크 및 내피의 정량적 측정 [칼슘<sup&gt; 2 +</sup&gt;]<sub&gt; 전</sub&gt; 및 질소 산화물 생산

마우스 경동맥 및 대동맥의 얼굴 준비를위한 절차가 설명된다. 특정 항체로 면역 형광으로 염색 될 때 그러한 조제 물은 우리가 공 촛점 현미경으로 전체 혈관 벽 내에서 단백질의 위치 및 세포 유형을 확인하는 것을 가능하게한다.

마우스 혈관의 얼굴 준비

이 원고는 형광 현미경을 사용하여 단일 세포 NO• 변동을 실시간으로 모니터링하기 위해 유전적으로 인코딩된 산화질소(NO•) 프로브(geNOps)를 적용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 개별 내피 세포 수준에서 Ca2+로 트리거된 NO• 형성은 geNOps와 화학적 Ca2+ 센서를 결합하여 시각화되었습니다.

유전자 인코딩 된 형광 산화 질소의 응용 프로그램 (• NO) 단일 세포에서 NO • 신호의 실시간 이미징을위한 프로브의 geNOps,

여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.

혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용

여기에서는 고감도의 화학 발광 기반 분석을 사용하여 산화 질소 및 이의 생물학적 관련 유도체를 검출하기위한 프로토콜을 제시합니다.

산화 질소 및 그 유도체의 검출을위한 화학 발광 기반 분석 및 자동 산화 및 니트로화 화합물

과산화물 음이온의 생성은 혈소판의 자극에 필수적이며, 조절이 잘 되지 않는 경우 혈전성 질환에 매우 중요합니다. 여기에서는 과산화물 음이온의 선택적 검출과 산화 환원 의존성 혈소판 조절 연구를 위한 세 가지 프로토콜을 제시합니다.

혈소판에서 과산화물 음이온 생성을 검출하기 위한 대체 방법 

Nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)는 기본, 손상 nucleosomes의 준비에서 사후 translational 수정의 글로벌 패턴을 감지하는 민감한과 양적 방법입니다. 이러한 수정 methylations, acetylations 및 특정 히스톤 아미노산 잔류물에 phosphorylations를 포함하고, 따라서 NU - 엘리사는 특정 세포 유형의 전반적인 염색질 수정 상태의 글로벌 proteomic 분석을 제공합니다.

엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

배우세요 마우스 대동맥에서 DAF-2DA와 DHE 형광 염료를 사용하여 산화 질소와 과산화물 음이온을 동시에 검출하고 시각화하는 방법을. 이 기술은 혈관 내피 기능 장애 및 eNOS 비결합 연구에 활용됩니다.

본래 동맥의 내피 층에서 산화 질소와 활성 산소의 욕실 얼굴 인식

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