Name: 양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 LC-MS/MS를 이용한 고효율 N-글리칸 및 단백질 동시 정량 정제 방법을 통해 글리코믹스와 프로테오믹스를 통합 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 암 및 대조군 샘플 간 정확한 상대 정량을 가능하게 합니다.

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이 연구는 NIH NCI IMAT 프로그램 보조금 R33 (CA147988-02), NC State Grant (T32GM008776)의 분자 생명 공학 NIGH NIGMS 대학원 교육, NC State Grant (P200A140020)의 분자 생명 공학 GAANN Fellowship Program, WM Keck 재단 및 노스 캐롤라이나 주립 대학. 암탉 혈장은 노스캐롤라이나 주립 대학 가금류 과학과의 James N. Petitte 박사와 Rebecca Wysocky의 도움으로 얻었습니다.

<ol><li>Wisniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nat. Meth. 6, 359-362 (2009).</li>
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<li>Hasnain, S. Z., Gallagher, A. L., Grencis, R. K., Thornton, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+role+for+mucins+in+immunity%3A+Insights+from+gastrointestinal+nematode+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new role for mucins in immunity: Insights from gastrointestinal nematode infection.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 45, 364-374 (2013).</li>
<li>Roseman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+glycobiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Reflections on glycobiology.</a> J. Biol. Chem. 276, 41527-41542 (2001).</li>
<li>Laine, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+calculation+of+all+possible+oligosaccharide+isomers+both+branched+and+linear+yields+1.05+x+10%2812%29+structures+for+a+reducing+hexasaccharide%3A+The+isomer+barrier+to+development+of+single-method+saccharide+sequencing+or+synthesis+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">A calculation of all possible oligosaccharide isomers both branched and linear yields 1.05 x 10(12) structures for a reducing hexasaccharide: The isomer barrier to development of single-method saccharide sequencing or synthesis systems.</a> Glycobiology. 4, 759-767 (1994).</li>
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<li>Hirabayashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lectin-based+structural+glycomics%3A+Glycoproteomics+and+glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+J%22%5BJournal%5D)">Lectin-based structural glycomics: Glycoproteomics and glycan profiling.</a> Glycoconjugate J. 21, 35-40 (2004).</li>
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<li>Redmond, J. W., Packer, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+solid-phase+extraction+with+graphitised+carbon+for+the+fractionation+and+purification+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohyd.+Res%22%5BJournal%5D)">The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars.</a> Carbohyd. Res. 319, 74-79 (1999).</li>
<li>Ruhaak, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophilic+interaction+chromatography-based+high-throughput+sample+preparation+method+for+N-glycan+analysis+from+total+human+plasma+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrophilic interaction chromatography-based high-throughput sample preparation method for N-glycan analysis from total human plasma glycoproteins.</a> Anal. Chem. 80, 6119-6126 (2008).</li>
<li>Kim, Y. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+high-throughput+analysis+of+N-glycans+from+ovarian+cancer+serum+using+a+96-well+plate+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Rapid and high-throughput analysis of N-glycans from ovarian cancer serum using a 96-well plate platform.</a> Anal. Biochem. 391, 151-153 (2009).</li>
<li>Zielinska, D. F., Gnad, F., Wiśniewski, J. R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+mapping+of+an+in+vivo+N-glycoproteome+reveals+rigid+topological+and+sequence+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Precision mapping of an in vivo N-glycoproteome reveals rigid topological and sequence constraints.</a> Cell. 141, 897-907 (2010).</li>
<li>Abdul Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filter-aided+N-glycan+separation+%28FANGS%29%3A+a+convenient+sample+preparation+method+for+mass+spectrometric+N-glycan+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Filter-aided N-glycan separation (FANGS): a convenient sample preparation method for mass spectrometric N-glycan profiling.</a> J. Proteome Res. 13, 1167-1176 (2014).</li>
<li>Walker, S. H., Carlisle, B. C., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+comparison+of+reverse+phase+and+hydrophilic+interaction+liquid+chromatography+platforms+for+the+analysis+of+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Systematic comparison of reverse phase and hydrophilic interaction liquid chromatography platforms for the analysis of N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 84, 8198-8206 (2012).</li>
<li>Walker, S. H., Taylor, A. D., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individuality+normalization+when+labeling+with+isotopic+glycan+hydrazide+tags+%28INLIGHT%29%3A+A+novel+glycan-relative+quantification+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectr%22%5BJournal%5D)">Individuality normalization when labeling with isotopic glycan hydrazide tags (INLIGHT): A novel glycan-relative quantification strategy.</a> J. Am. Soc. Mass Spectr. 24, 1376-1384 (2013).</li>
<li>Walker, S. H., Lilley, L. M., Enamorado, M. F., Comins, D. L., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic+derivatization+of+N-linked+glycans+for+increased+ion+abundance+in+electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectr%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic derivatization of N-linked glycans for increased ion abundance in electrospray ionization mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectr. 22, 1309-1317 (2011).</li>
<li>Baldwin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permethylation+and+tandem+mass+spectrometry+of+oligosaccharides+having+free+hexosamine%3A+Analysis+of+the+glycoinositol+phospholipid+anchor+glycan+from+the+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Permethylation and tandem mass spectrometry of oligosaccharides having free hexosamine: Analysis of the glycoinositol phospholipid anchor glycan from the scrapie prion protein.</a> Anal. Biochem. 191, 174-182 (1990).</li>
<li>Harvey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivatization+of+carbohydrates+for+analysis+by+chromatography%3B+electrophoresis+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Derivatization of carbohydrates for analysis by chromatography; electrophoresis and mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. B. 879, 1196-1225 (2011).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Hecht, E. S., McCord, J. P., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+screening+design+optimization+of+mass+spectrometry+parameters+for+sensitive+comparison+of+filter+and+solid+phase+extraction+purified%2C+inlight+plasma+N-glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Definitive screening design optimization of mass spectrometry parameters for sensitive comparison of filter and solid phase extraction purified, inlight plasma N-glycans.</a> Anal. Chem. 87, 7305-7312 (2015).</li>
<li>Nepomuceno, A. I., Gibson, R. J., Randall, S. M., Muddiman, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+deamidated+peptides+in+global+proteomics+using+a+quadrupole+orbitrap+mass+spectrometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of deamidated peptides in global proteomics using a quadrupole orbitrap mass spectrometer.</a> J. Proteome Res. 13, 777-785 (2013).</li>
<li>Yen, T. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+challenges+and+opening+new+opportunities+in+glycoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Overcoming challenges and opening new opportunities in glycoproteomics.</a> Biomolecules. 3, 270-286 (2013).</li>
<li>Meiring, H. D., van der Heeft, E., ten Hove, G. J., de Jong, A. P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+LC-MS%28n%29%3A+technical+design+and+applications+to+peptide+and+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Sep.+Sci%22%5BJournal%5D)">Nanoscale LC-MS(n): technical design and applications to peptide and protein.</a> J. Sep. Sci. 25, 557-568 (2002).</li>
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<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass.+Spectrom%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 5, 976-989 (1994).</li>
<li>Gonzalez-Galarza, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+techniques%2C+software+packages%2C+and+standards+for+quantitative+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Omics%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of techniques, software packages, and standards for quantitative proteomic analysis.</a> Omics. 16, 431-442 (2012).</li>
<li>Spivak, M., Weston, J., Bottou, L., Käll, L., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Percolator+Algorithm+for+Peptide+Identification+from+Shotgun+Proteomics+Data+Sets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Percolator Algorithm for Peptide Identification from Shotgun Proteomics Data Sets.</a> J Proteome Res. 8, 3737-3745 (2009).</li>
<li>Collier, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+stable-isotope+labeling+with+amino+acids+in+cell+culture+and+spectral+counting+for+relative+quantification+of+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Sp%22%5BJournal%5D)">Comparison of stable-isotope labeling with amino acids in cell culture and spectral counting for relative quantification of protein expression.</a> Rapid Commun Mass Sp. 25, 2524-2532 (2011).</li>
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<li>Sheeley, D. M., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+characterization+of+carbohydrate+sequence%2C+linkage%2C+and+branching+in+a+quadrupole+ion+trap+mass+spectrometer%3A+Neutral+oligosaccharides+and+N-linked+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural characterization of carbohydrate sequence, linkage, and branching in a quadrupole ion trap mass spectrometer: Neutral oligosaccharides and N-linked glycans.</a> Anal. Chem. 70, 3053-3059 (1998).</li>
</ol>

우리는 Cambridge Isotope Laboratories(CIL)와 협력 관계를 맺고 P2GPN 시약 및 기술을 제품(GTK-1000)의 형태로 더 넓은 과학계에 전파하고 있습니다. 그러나 우리는 이 제품의 판매에 따른 수익을 받지 않습니다.

일상적인 글리칸 분석을 용이하게 하기 위해서는 처리량이 많은 정량적 분석법이 필요합니다. 지난 30년 동안 글리코믹스 분석은 질병, 임상 응용 및 제약에서 중요성에도 불구하고 연구 그룹의 하위 집합으로 제한되었습니다. 글리코믹스 및 단백질체학을 위한 FANGS-P2GPN 정제 및 태깅 방법은 단일 분취량 샘플에 대해 동일한 분석을 수행하여 공급 비용과 필요한 재료의 양을 줄입니다(특히 인간 및 마우스 연구에서 중요). 또한, 모든 추가 단계가 오류에 기여하고 잠재적으로 환자-대조군 연구에서 중요하지만 풍부도가 낮은 변화를 가릴 수 있기 때문에 준비의 가변성을 최소화하려는 노력이 매우 중요합니다. FANGS를 소수성 히드라지드 태깅에 결합하면 단백질 및 글리칸 샘플을 동일한 RPLC 컬럼에서 실행할 수 있고, 글리칸 이온화를 향상시키며, 상대적인 정량화를 제공하며, 혈장에 정량적으로 적용할 수 있습니다.
N-글리칸 분석의 경우 완전한 탈글리코실화를 달성하기 위해 제안된 수준의 PNGase F를 사용하는 것이 중요합니다. 글리칸은 용매에 노출되지만 단백질의 변성과 과도한 효소는 효율적이고 완전한 절단을 보장하는 데 도움이 됩니다. 글리칸의 정확한 정량을 위해서는 유도체화 후 글리칸이 완전히 건조되어 반응을 담금질하고 NAT와 SIL 종을 혼합할 때 교차 반응을 방지해야 합니다. 마지막으로, 워크플로우를 글리코사이트 분석으로 확장할 때 비특이적 탈아미드화를 최소화하기 위해 단계의 타이밍이 중요합니다. 결합된 글리코믹스 및 단백질체학 분석을 위해 제공된 수정된 프로토콜은 그에 따라 수행될 때 일관되게 작동합니다.
이 워크플로우는 골드 스탠다드인 SPE 분석법과 비교하여 혈장에서 N-글리칸의 정확한 상대 정량을 달성합니다. 분자량, 친수성 및 조성 구조 측면에서 추출된 글리칸의 유형에는 명백한 편향이 없습니다. O-결합 글리칸의 정성적 분석을 탐색하지는 않았지만 FANGS가 N-결합 글리칸의 PNGase F 분해 후 β-제거 단계의 추가를 수용할 수 있을 것으로 기대합니다. 그러나 질량 분석 전에 시약 세척을 위해 절차를 크게 수정해야 하며 펩타이드 분석은 상당한 영향을 미칩니다. 단백질체학의 경우 기존 FASP 방법과 비교하여 동일한 깊이의 단백질체 커버리지가 달성됩니다. 중요한 것은 분석법이 N-글리칸 탈아미드화에 대한 최소한의 잘못된 발견률을 달성한다는 것입니다. 이 방법은 PNGase 분해 단계22,23 동안 Asn의 18O표지와 호환되지만, 낮은 글리코실화 부위 거짓 발견률은 필요하지 않을 수 있음을 시사하여 비용과 복잡성을 더욱 줄입니다.
프로테옴은 이 방법에서 당단백질에 대해 풍부하지 않으며 이는 장점과 단점을 모두 가지고 있습니다. 특정 저풍부 당단백질은 분석에서 검출되지 않을 수 있습니다. 그러나 단백질당 당화된 부위의 점유율은 생물학적 샘플 간에 비교할 수 있습니다. 또한 렉틴 친화성 정제 또는 화학적 농축으로 인해 발생하는 오류와 편향이 제거됩니다. 결론적으로, 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 FANGS를 개별성 정규화에 결합하면 글리콤 및 프로테옴의 탠덤 분석을 위한 단순화되고 정량적이며 처리량이 많은 방법이 생성되며 임상 환자-대조군 연구에 적용할 수 있는 큰 잠재력이 있습니다.

프로테오믹스 분야에서는, 필터를 이용한 시료 준비 (FASP)가 널리 출발 물질의 양을 최소화하는 샘플 준비 아티팩트를 감소시키고, 시료 처리 1을 최대화하는 기능을 채용하고있다. 그러나, 이러한 방법은 아직 나오고 글라 이코믹스의 필드 견인력을 얻을 수있다. 높은 처리량의 개발은 양적 워크 플로우 때문에 필수적인 생물학적 방어 당화의 역할과 암 또는 질병 2,3에 의해 그 변조의 필요하다. 포유 동물에서, N의 -glycans은 코어 구조를 장식 당 단위 (탄당 (육각), hexosamines (HexNac), 시알 산 (NeuAc의), 그리고 푸 코스 (FUC)), (육각 3 HexNac 2) 4 공유 결합을 반복으로 구성되어 아스파라긴합니다. 이성질체가 반영되면 glycospace 상당히 큰 것이지만 (&gt; 10 ~ 12)은, 그 조성에 기초하여 매우 작고, 전형적으로는 분자량 1,000-8,000 다 5 &lt;에서부터/ SUP&gt;. 클래스의 조성 균일 성 및 글리 칸의 친수성 정제 분리에 고유 한 문제를 제기하고, 질량 분석 (MS) (6)를 워크 플로우. 전통적으로, N의 -glycans는 F (MALDI 스펙트럼은 PNGase F)는 펩티드 - N으로 단백질 또는 펩티드의 글리코시다 제 분해 된 후 히드라 지드 비드 (8)에 의해, 렉틴 친 화성 크로마토 그래피 (7)에 의해 농후 포착, 또는 고체 상 추출 (SPE) 9,10 통해 정제. 이들 방법은 모두 매우 효과적이지만, 이들은 탈염위한 추가 단계가 도입 된 샘플의 수는 동시에 처리 제한한다. 지난 10 년간, 글라 이코믹스에 대한 높은 처리량 플랫폼 다수 제안되어있다. 김 외. 진공 조작, SPE 96 웰 플레이트 (11)를 사용하여 반 - 자동화 된 방법을 발표 하였다. 또한, 친 화성 필터 방법 (N의 -glyco-FASP)는 파이의 초기 유도체를 필요로하는 맨 그룹에 의해 개발되었다렉틴 (12)의 합성과 LTER. 마지막으로, 토마스 - 오우 츠 그룹은 glycospace (13)의 좁은 조성 크기를 악용 반 정량적 방법, N -Glycan 분리 (송곳니)를 돕는 필터를 제안 하였다. 분자량 컷 - 오프 필터에 의존 작은 오염물 제 낭비 세척 한 다음 N의 -glycans는 분해 용출 하였다. 탈글 라이코 실화 된 단백질이 프로토콜에서 필터에 남아 인라인 FASP을 실시 할 수있다. 식별 및 전기 분무 이온화에 의해 글리 칸의 정량화 (ESI) MS는 저 풍부한 종의 검출을위한 이성체 및 유도체의 (부분) 해결을위한 오프라인 분리가 필요합니다. 개성 라벨링 당쇄 히드라 지드 태그 전략 정규화 역상 액체 크로마토 그래피 (역상) (14, 15)과의 호환성을 부여한다. 4- 펜 에틸 benzohydrazide (P2PGN)은 소수성 태그 ENH, 글리 칸의 친수성을 매개평균적으로 이온화 ancing 16 4 배. 용이 한 조건에서 화학량 론적 1 ​​: 메틸화 예 17 아민 반응성 화학 태그 (18)과 같은 다른 기술은 유사한 이점을 제공하지만, 히드라 지드의 반응에 글리 칸은 (1) 반응한다. 상대 정량 네이티브 (NAT) 또는 (13) C (6) 안정된 동위 원소 라벨 (SIL)로 유도 샘플의 직렬 분석에 의해 달성된다. 다음 방법은 정확한 상대 정량 P2GPN 소수성 태그에 플라즈마 응용 프로그램과 커플을위한 송곳니를 진화. 또한,이 분석의 무결성을 손상시키지 않고, 샘플의 단일 나누어지는에 총 총의 프로테오믹스, 탈 아미드 화 프로파일, 양적 글라 이코믹스을 수행하도록 설계되었습니다.

<table><tbody><tr><td>아세트산 (50%)</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>45754</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴, HPLC 등급</td><td>Burdick & 잭슨&nbsp;</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마 Aldrich&nbsp;</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>브래드포드 시약</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>B6916</td><td>대안: Bicinchoninic acid kit (Sigma Aldrich BCA1)</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td>14,000 x g에 이르는 대체 원심분리기가 적합합니다.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol, 1&nbsp; 용액 중 M</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td></td><td></td>646563</tr><tr><td>Easy-nLC 1000</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC120</td><td>대체 나노 또는 초고압 LC는 다음과 같은 유사한 데이터를 생성합니다: 1. Dionex UltiMate&Ograve; 3000 LC(Thermo Scientific); 2. Acquity UPLC(Waters).</td></tr><tr><td>플로팅 튜브 랙</td><td>TedPella</td><td>20831-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetuin</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td><td>P6042S</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Scientific Isotemp 표준 실험실 오븐</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625F</td><td>56&nbsp에 이르는 대체 인큐베이터; &데그; C는</td></tr><tr><td>적합한 포름산</td><td>시그마 Aldrich입니다&nbsp;</td><td>56302</td><td></td></tr><tr><td>GE 전자레인지 오븐</td><td>General Electric</td><td>57B5 E82904</td><td>조절 가능한 전력 설정이 있는 모든 전자레인지가 적합합니다</td></tr>. <tr><td>INLIGHT Glycan 태깅 키트&nbsp;</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>GTK-1000</td><td>INLIGHT 키트는 P2GPN 시약의 NAT 및 SIL 버전을 제공합니다.</td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>A3221</td><td></td></tr><tr><td>Kinetix 2.6 mM, 100 &Aring;, C18 벌크 고정상</td><td>Phenomenex&nbsp;</td><td>벌크 미디어</td><td>대안: 모든 C18 고정상 5&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Mascot Daemon 소프트웨어 및 서버</td><td>매트릭스 과학</td><td></td><td>대안: Proteome Discoverer Software(Thermo Scientific)</td></tr><tr><td>메탄올, HPLC 등급</td><td>Burdick & 잭슨&nbsp;</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>PicoFrit 자체 팩 열: 360&nbsp; &#956; m, OD 75&nbsp; &#956; m ID, 15&nbsp; &#956; m 팁, 비코팅, 박스당 5개, 50 cm</td><td>새로운 목표</td><td>1 5 PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F (글리세롤 프리), 75,000&nbsp; 단위/ml</td><td>New England BioLabs</td><td>P0705L</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량</td>분석기 <td>Thermo Scientific</td><td></td><td>대체 고질량 정확도 (5&nbsp; ppm) 질량 분석기는 유사한 데이터를 제공합니다</td></tr><tr><td>RNase B</td><td>New England Biolabs&nbsp;</td>돼지 췌장에서 추출한 <td>P7817S</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>T6567-5X</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>시그마 알드리치&nbsp;</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>진공 집중기Savant SPD131DDA SpeedVac 집중기</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD131DDA</td><td>대체 진공 농축기가 적합합니다</td></tr><tr><td>. Vivacon 500 30 kDa 필터&nbsp;</td><td>Sartorius Stedim Biotech</td><td>VN01H22</td><td>대안: Amicon Ultra 0.5 원심 필터 유닛과 Ultracel-10&nbsp; kDa 멤브레인 (Millipore UFC501096)</td></tr><tr><td>물, HPLC 등급</td><td>Burdick & 잭슨&nbsp;</td><td>AH365-4</td><td></td></tr><tr><td>물, 18O</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>OLM-240-97-1</td><td>PNGase F 다이제스트 단계에서 18O를 추가하는 것은 선택 사항이며 95% 신뢰도로 완료된 탈아미드화 연구에는 필요하지 않을 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>Xcalibur 2.0</td><td>Thermo Scientific</td><td>XCALIBUR20</td><td></td></tr><tr><td>Zwittergent 테스트 키트</td><td>Merck Millipore</td><td>693030</td><td></td></tr></tbody></table>

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

생물학 및 임상 과학에서는 생물학을 밝히고, 경로를 정의하고, 치료를 개선하고, 질병을 이해하고, 바이오마커 발견을 돕기 위해 여러 종류의 생체 분자를 통합하고 상관시키려는 욕구가 증가하고 있습니다. N-linked glycosylation은 단백질에 대한 가장 중요하고 강력한 번역 후 변형 중 하나이며 신호전달, 접착 및 효소 기능과 같은 중요한 세포 기능을 조절합니다. N-글리칸을 정제하고 분석하기 위한 분석 기술은 지난 10년 동안 상대적으로 정적인 상태를 유지해 왔습니다. 정확하고 효과적이지만 일반적으로 상당한 전문 지식과 리소스가 필요합니다. 일부 고처리량 정제 계획이 개발되었지만 아직 널리 채택되지 않았으며 종종 글리코펩타이드의 농축에 의존합니다. Thomas-Oates 등이 개발한 한 가지 유망한 방법인 FANGS(Filter Aided N-Glycan Separation)가 조직에서 정성적으로 입증되었습니다. 여기서, 우리는 액체 크로마토그래피 질량 분석법 및 향상된 전기 분무 이온화에 의한 정확한 상대 정량화를 달성하기 위해 FANGS를 플라즈마에 적용하고 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 개별성 정규화와 결합했습니다. 또한, 암탉 혈장에 대한 탠덤, 샷건 단백질체학 및 당화 부위 분석을 달성하여 프로토콜에 새로운 기능을 설계했습니다. 우리는 필터에서 정제되고 소수성 히드라지드 태그에 의해 유도체화된 N-글리칸이 고체상 추출(SPE)에 의한 것과 풍부도 및 등급 측면에서 유사하다는 것을 보여주었습니다. 후자는 이 분야에서 황금 표준으로 간주됩니다. 중요한 것은 두 프로토콜의 변동성이 통계적으로 다르지 않았다는 것입니다. 글리코믹 데이터와 인라인으로 수집된 단백질체학 데이터는 표준 트립신 다이제스트와 동일한 깊이를 가졌습니다. 프로토콜에서 펩타이드 탈아미드화(Peptide deamidation)가 최소화되어 글리코실화(glycosylation) 모티프에서 검출되는 비특이적 탈아미드화(deamidation)가 제한됩니다. 이를 통해 직접적인 당화(glycosylation) 부위 분석이 가능했지만, 이 프로토콜은 18O 부위 라벨링도 수용할 수 있습니다. 전반적으로, 당사는 정량적 당체학 및 단백질체학 분석을 위한 새로운 인라인 고처리량, 비편향, 필터 기반 프로토콜을 시연했습니다.

<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig1.jpg" /> 그림 1 :. 결합 단백질 체학 및 글라 이코믹스 분석을위한 송곳니 - P2GPN 소수성 태그 결합 방법의 체계 (방법)이 주어 당화 사이트 식별과 글라 이코믹스 전용 처리 및 직렬 글라 이코믹스 및 프로테오믹스 분석,이 서로 다른 단계, 강조 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 이 인라인 프로테오믹스 및 글라 이코믹스 필터 기반 P2GPN 소수성 태깅 방법 (방법 A)는 풀링 암탉 혈장 샘플 (도 1)를 이용하여 식별, 정량 및 분자량 바이어스 검증 하였다. 전적으로 글라 이코믹스 실험의 경우, N의 존재비에 간 비교는 방법에 의해 추출 -glycans이 SPE (금 표준, 방법 B) 만들어졌다 (그림 2) carbograph합니다. 두 가지 방법 사이의 글리 칸의 존재비에서 유의 한 차이가 없었다. 동일한 방법에 의해 추출 된 글리 칸의 NAT 비율 내 변동은 SIL을 정량함으로써 측정 하였다. 두 방법의 로그 2 -distributions 제로를 중심으로, 가우스했고, (그림 3A-B) 유의 한 차이가. 분자량은 필터가 N이 분자량 범위 및 친수성 (도 4)에 기초 -glycans 구별하지 않았다 시사 완전히 겹쳐진 두 프로토콜 사이의 범위이다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig2.jpg" /> 그림 2 :. NAT 및 SIL N의 몰 혼합물 방법 또는 방법 B에 의해 추출 -glycans 2.5 암탉 플라즈마의 μL (N = 4) 샘플이었다 항문 제조 하였다각 NAT / SIL의 채널 부 (6) 각각의 당쇄에 대한 존재비 제안 추천 파라미터에 따른 UPLC-MS에 의해 yzed 분자를 보정 추출 된 이온 크로마토 그램 (MMA = 3 PPM) 아래의 면적을 적분하여 계산 하였다 TGNF 중량 중복 및 조정. 이 비율은 표준 오류가 표시됩니다. 방법 B의 존재비 :. 방법 N의 -glycans은 (p&gt; 0.05) 유의 한 차이가 없었다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig3.jpg" /> 도 3 (A) 방법 인트라 변이 (N = 133) 또는 (B) 방법은 B (N = 123) 전략을 비교 하였다. 같은 추출 방식에서 N의 -glycans의 NAT 및 SIL 몰 혼합물세 가지 기술 복제 통해 분석 하였다. 로그 2 -distributions 제로를 중심으로 두 흐름 사이. 유의 한 차이가 없었다 된 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig4.jpg" /> 도 4 각 전략 글리 칸에서의 분자량 범위를 비교 하였다. 이 워크 플로는 동일한 분자량 범위에 걸쳐 글리 칸을 얻었다. N은 다른 단지 검출 (1 × 10 5 풍부)의 한도를 초과 하락에 비해 하나의 프로토콜에서 검출 -glycans하고 체계적인 편견을 반영하지 않습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig4large.jpg" target="_blank">더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.</a> (표 5)가없는 전통 FASP 제제를 비교 하였다. FASP 트립신 다이제스트 (표준 프로토콜) 다음에 우리의 일반적인 18 시간 필터를 기반으로 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 소화는 glycosites의 식별을 방해 할 수 비특이적 탈 아미드 화 상당한 수준의 결과. 따라서, 높은 온도 (50 °의 C)와 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 스파이크 - 단계 (SPI 프로토콜)에서 짧은 배양 시간을 이용하는 방법은 마이크로파 분해 프로토콜 (MD 프로토콜)와 함께 대안으로 탐구하고, 비 최소화 특정 탈 아미드 화. 새로운 소화 방법에서 관찰 글리 칸은 표준 18 시간에서 조성물 또는 존재비에서 유의 한 차이가 없었다 37 ° C 필터 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 다이제스트 ( <strong&gt; 그림 5). 짧은 트립신 배양과 결합, 비특이적 탈 아미드 화 크게 glycosites &lt;5 % (표 5)에 대한 거짓 긍정적 인 속도로 감소 하였다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> 단백질 </td><td></td><td colspan="4"> 펩티드 </td><td></td><td colspan="4"> 탈 아미드 펩티드 </td><td></td><td colspan="4"> Glycosites </td><td></td><td colspan="4"> 당 단백질 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td><td></td><td colspan="2"> + </td><td colspan="2"> - </td></tr><tr><td colspan="2"> FASP </td><td colspan="2"></td><td colspan=&quot;2&quot;&gt; (249) </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 3083 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> 795 </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> (5) </td><td></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"> (5) </td></tr><tr><td colspan="2"> 18hr </td><td colspan="2"> (217) </td><td colspan="2"> (304) </td><td></td><td colspan="2"> 6013 </td><td colspan="2"> 5086 </td><td></td><td colspan="2"> 1,029 </td><td colspan="2"> 733 </td><td></td><td colspan="2"> 257 </td><td colspan="2"> (24) </td><td></td><td colspan="2"> (112) </td><td colspan="2"> (18) </td></tr><tr><td colspan="2"> MD </td><td colspan="2"> (270) </td><td colspan="2"> (266) </td><td></td><td colspan="2"> 5190 </td><td colspan="2"> 5125 </td><td></td><td colspan="2"> 465 </td><td colspan="2"> (455) </td><td></td><td colspan="2"> (254) </td><td colspan="2"> 8 </td><td></td><td colspan="2"> (102) </td><td colspan="2"> (7) </td></tr><tr><td colspan="2"> SPI </td><td colspan="2"> 281 </td><td colspan="2"> 288 </td><td></td><td colspan="2"> 4729 </td><td colspan="2"> 4,482 </td><td></td><td colspan="2"> (602) </td><td colspan="2"> 573 </td><td></td><td colspan="2"> (232) </td><td colspan="2"> (10) </td><td></td><td colspan="2"> (145) </td><td colspan="2"> 8 </td></tr></tbody></table> . 표 5 : 표준 트립신에서 단백체 데이터의 비교는 인라인 송곳-P2GPN 태깅 방법 만들었다 대 소화 물질을 사용하여 수행 하였다 (+) 및하지 (-) MALDI 스펙트럼은 PNGase F는 비특이적 탈 아미드 화 및 추정의 배경 요금을 결정 거짓 긍정적 인 요금 glycosite. 단백질을 1 % 거짓 검색 속도 (FDR)로 확인되었다; 펩타이드는 프로테옴 Discoverer는 1.4 &quot;높은&quot;펩타이드의 신뢰를 기반으로 여과 (Q &lt;0.01); glycosites는 identifi했다에드 보존 글리코 실화를 모티브로 (NXS / T)의 탈 아미드 화를 포함하는 고유 한 시퀀스에 기초 및 당 단백질은 적어도 하나의 식별 glycosite 확인 된 단백질을 함유하는 것으로 정의 하였다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/53735/53735fig5.jpg" /> 그림 5 : 글리 칸에 대한 단축 프로토콜은 샘플 탈 아미 노화를 최소화하기 위해 개발 18hr 송곳니 MALDI 스펙트럼은 PNGase F 다이제스트에 비교 하였다. 존재비의 평균 차이는 10 % 각각 MD (2.2.3) 및 SPI (2.2.2) 프로토콜, 5 %였다. 확인 된 48 글리 칸 중 90 % 이하 1.5 배의 변화보다. 표시 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53735/53735fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

고처리량 프로토콜은 단백질체학 및 글리코믹스 정제와 혈장에서 LC-MS/MS 정량화를 결합하기 위해 개발되었습니다. N-linked glycosylation motifs의 탈아미드화 분석은 탈glycosylated 부위에 특이적이었습니다. N-글리칸의 정확한 정량화는 글리칸 히드라지드 태그 전략으로 라벨링할 때 필터 지원 N-글라이칸 분리를 개별성 정규화에 결합함으로써 달성되었습니다.

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

단일 필터 기반 워크플로의 전반적인 목표는 질량 분석법 분석을 위해 생물학적 샘플로부터 N-글리칸과 단백질을 연속적으로 쉽고 정량적으로 정제하는 것입니다. 이 방법의 확장성, 속도 및 분석 재현성은 생물학적 질량 분석 실험실에서 자원과 기술 수준에 관계없이 직접적으로 적용 가능하게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 연구자가 대규모 고처리량 생물학 연구에서 글라이코믹스, 당화 부위 점유율 및 프로테오믹스 관련 문제를 동시에 조사할 수 있다는 점입니다.당사는 이 방법을 질량 분석법에 최적화된 유도체화 전략과 결합함으로써 N-글리칸 측정의 어려움을 극복하였으며, 그 결과 암 상태와 대조군 상태 사이의 정확한 상대 정량을 달성하였습니다. 분석 변동성이 감소함에 따라 글라이콤과 프로테옴 사이의 새로운 생물학적 상호작용을 규명할 수 있으며, 이는 질병 상태에 대한 핵심적인 통찰력과 바이오마커 발굴의 새로운 기회를 제공할 것입니다. 우선, 2.5 µL의 혈장을 필터에 로딩하십시오.그 다음, 필터 내의 각 샘플에 1M dithiothreitol 용액 2 µL를 첨가합니다. 100-mM Ammonium Bicarbonate PNGase digest buffer 200 µL를 사용하여 샘플을 희석합니다. 필터 샘플 튜브의 캡을 닫고, 필터가 고정된 위치에서 벗어나지 않도록 주의하며 가볍게 볼텍싱합니다.단백질과 당단백질을 변성시키기 위해 시료를 56 °C에서 30분 동안 배양합니다. 시료를 알킬화하려면 1M Iodoacetamide 50 µL를 첨가하여 최종 농도가 약 200 mM이 되도록 합니다. 그 다음, 37 °C에서 60분 동안 배양합니다.샘플을 14,000 x g에서 40분 동안 원심분리하여 변성된 당단백질을 필터에 농축시킨 후 통과액을 제거합니다. PNGase digest buffer 100 µL로 샘플을 세척합니다. 당단백질을 필터에 농축시키고 통과액을 제거합니다.세척 및 농축 단계를 총 3회가 될 때까지 두 번 더 반복하여 필터 사dead volume에 농축액을 얻습니다. 세척이 완료되면 모든 통과액과 수집 바이알을 폐기하십시오. 그 후, 새로운 수집 바이알로 교체한 다음 필터에 glycerol-free peptide N-glycosidase F 또는 PNGase F 2 microliters를 첨가하십시오.PNGase 소화 버퍼 98 µL를 첨가하여 총 부피를 100 µL로 맞추고, 필터 위에서 피펫으로 부드럽게 섞어줍니다. 스파이크-인 소화 프로토콜의 경우, 샘플을 50 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 신속하게 샘플을 꺼내어 글리세롤이 없는 PNGase F 2 µL를 추가로 스파이크-인합니다. 샘플을 1~2초 동안 가볍게 볼텍싱하여 섞어줍니다.샘플을 50 °C에서 2시간 더 인큐베이션합니다. 20 °C에서 샘플을 원심분리하여 글리칸을 용출시킨 후, 필터에 PNGase 소화 버퍼 100 µL를 추가하고 다시 원심분리합니다. 남아 있는 N-연결 글리칸이 포함된 세척액을 용출액과 동일한 수집 바이알에 수집합니다.두 번 반복한 후, 필터를 제거하여 단백질체학 준비를 위한 새로운 수집 바이알에 넣습니다. 다음으로, 글리칸 샘플을 80 °C 냉동고에서 얼 때까지 30~60분 동안 배양합니다. 그런 다음, 진공 농축기에서 실온으로 4~6시간 동안 완전히 건조합니다.탈아미노화된 펩타이드가 포함된 필터를 400 µL의 8M urea 버퍼로 헹굽니다. 수집 바이알의 캡을 닫고 가볍게 볼텍싱하여 혼합합니다. 모든 통과액을 버리기 전에 필터에서 펩타이드를 농축합니다.우레아 완충액 세척을 두 번 더 반복한 후, 탈아미노화된 펩타이드가 포함된 필터를 Trypsin 소화 완충액으로 헹굽니다. 수집 바이알의 캡을 닫고 가볍게 볼텍싱하여 혼합한 다음, 이전과 동일하게 필터에서 다시 농축합니다. 모든 통과액을 버리고 이 과정을 2회 더 반복하여 총 3회의 Trypsin 소화 완충액 세척을 수행합니다.이후의 모든 용출액과 세척액을 새로운 수집 바이알에 수집합니다. 그런 다음, discovery proteomics의 경우 1:50, quantitative proteomics 실험의 경우 1:5의 Trypsin 대 단백질 비율로 50 microliters의 porcine-modified Trypsin을 첨가합니다. 수집 바이알의 캡을 닫고 가볍게 vortex하여 혼합합니다.샘플을 37 °C에서 2시간 동안 배양한 후, 신속하게 샘플을 꺼내어 적절한 Trypsin 대 단백질 비율에 따라 Trypsin 50 µL를 추가로 첨가합니다. 샘플을 1~2초 동안 가볍게 볼텍싱하여 혼합합니다. 그 다음, 50 °C에서 2시간 동안 추가로 배양합니다.이전과 동일하게 20분 동안 원심분리하여 펩타이드를 용출시킨 후, Quench 버퍼를 사용하여 필터에 남아 있는 펩타이드를 헹굽니다. 이전과 동일하게 15분 동안 원심분리하여 필터에서 용출시킵니다. 샘플 내 펩타이드 농도를 정량한 후, 펩타이드 샘플이 얼 때까지 80 °C 냉동고에서 배양합니다.그 다음, 진공 농축기에서 실온으로 4~6시간 동안 완전히 건조합니다. 그 후 액체 크로마토그래피 질량 분석 또는 LCMS 분석 직전에 트립신 처리된 단백질을 이동상 A로 원하는 농도까지 재용해합니다. 2.5 µL 혈장으로부터 얻은 트립신 처리 펩타이드의 농도는 100~300 ng/µL 범위입니다.글리칸 분석 전, 건조된 안정 동위원소 표지 4-phenethyl benzohydrazide 시약과 네이티브 P2GPN 시약을 유도체화 용액 1 mL에 녹여 최종 농도가 0.25 mg/mL가 되도록 재구성하십시오. 시약이 완전히 용해되는 데 최대 10분이 소요될 수 있습니다. 완전히 용해되었는지 확인하기 위해 충분히 볼텍싱하십시오.건조된 N-글리칸에 200 µL의 안정 동위원소가 표지된 또는 천연 P2GPN 시약을 첨가하여 태깅합니다. 피펫팅을 통해 건조된 글리칸을 다시 현탁시킵니다. 그런 다음, 샘플을 볼텍싱하고 벤치탑 원심분리기로 약 5초 동안 원심분리하여 침전시킵니다.글리칸을 시약과 함께 56 °C에서 3시간 동안 반응시킵니다. 반응이 끝나면 즉시 글리칸을 인큐베이터에서 진공 농축기로 옮겨 55 °C에서 3~5시간 동안 완전히 건조합니다. 액체 크로마토그래피 및 질량 분석 직전에 태그가 붙은 N-glycan을 25~50 µL의 물에 다시 현탁합니다.N-글리칸이 완전히 용해되도록 피펫으로 위아래로 섞어줍니다. 이전과 동일하게 샘플을 5분 동안 원심분리한 후, 피펫 팁이 원심분리 튜브 바닥에 닿지 않도록 주의하며 상층액을 제거합니다. 상대 정량 탠덤 분석을 위해 네이티브 샘플과 안정 동위원소 표지 샘플 한 쌍을 1:1 비율로 혼합합니다.프로테오믹스 및 글라이코믹스 워크플로우를 위해 두 가지 서로 다른 LCMS 분석법을 준비합니다. 단백질 분석의 경우, NPA에 녹인 약 400 nanograms의 단백질을 컬럼에 주입합니다. 유속은 300 nanoliters per minute로 설정하고, 프리컬럼 평형화는 1 microliter, 분석 컬럼 평형화는 5 microliter로 수행합니다.텍스트 프로토콜에 제공된 MS 조건하에 단백질을 이온화합니다. 당쇄 분석을 위해, 재현탁된 P2GPN 태그가 붙은 native 및 stable-isotope-labeled equi-M 샘플 5 µL를 컬럼에 주입합니다. 샘플을 300 nL/min의 속도로 가동하며, 2 µL의 pre-column 평형화와 5 µL의 분석 컬럼 평형화를 수행합니다.그 다음, 텍스트 프로토콜에 제공된 MS 조건 하에서 글리칸을 이온화합니다. 필터 기반 정제 프로토콜을 표준 고상 추출법과 비교한 결과, 두 프로토콜 간에 검출된 혈장 글리칸의 풍부도는 유의미한 차이가 없었습니다. 두 방법 모두에서 검출 한계 부근에서 동일한 글리칸들이 발견되었으며, 이 지점에서 변동성이 증가합니다.필터 기반 또는 표준 고체상 추출 프로토콜로 정제된 혈장 equiM 혼합물의 개체 간 변동성을 평가하였습니다. 두 프로토콜 모두 평균이 0과 유의미한 차이가 없는 가우시안 분포를 보였습니다. 글리칸의 80%가 2배 변화 범위 내에 있었습니다.새로운 정제 프로토콜과 기존 정제 프로토콜에서 검출된 글라이칸의 분자량 분포는 유의미한 차이가 없었으며 동일한 범위를 나타냈습니다. 정성적으로, 글라이칸 간의 편향은 관찰되지 않았습니다. 혈장 단백질은 표준 필터 보조 시료 준비법과 다중 인라인 프로토콜을 통해 준비되었습니다.확인된 단백질의 수는 다양한 프로토콜에서 유사하게 나타났습니다. 비특이적 탈아미드화는 마이크로파 소화 및 스파이크 소화 프로토콜에서 10% 미만으로 제어되었습니다. 이 절차를 수행할 때, 정확한 당화 부위 점유율은 열 및 시간 노출을 최소화하는 것에 달려 있다는 점을 유의하는 것이 중요합니다.숙달되면, 인라인 pecurikene N-글리칸 정제는 2일 만에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 따르면, 고차 통계 기법을 사용하여 정확한 단백질 N-글리칸 정량 및 당화 부위 점유율을 통합하고 모델링할 수 있습니다. 이 기술은 암 생물학이 말하는 복잡한 언어를 빠르게 읽어내고, 단백질 치료제의 차이점을 정량적으로 비교하며, 생물학적 맥락에서 당화의 중요성을 진정으로 밝혀낼 수 있는 능력을 제공합니다.

a-quantitative-glycomics-and-proteomics-combined-purification-strategy

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

이 동영상은 복합 펩타이드 혼합물에서 잔류 디글리신 펩타이드를 포함하는 유비퀴틴닐화 펩타이드를 추출하고 정제하는 방법을 설명합니다. 제시된 방법은 단백질의 원래 유비퀴틴(ubiquitination) 부위를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유비퀴틴화 펩타이드의 면역친화성 기반 추출: 정제된 펩타이드 분획에서 유비퀴틴 태그 펩타이드를 선택적으로 추출하는 기술

세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

본 프로토콜은 질량 분광법 전에 프로테옴 샘플의 견고하고 신속한 회수 및 정제를 위한 조절된 조건 하에서의 용매-기반 단백질 침전을 기술한다.

질량 분광법에 앞서 강력한 프로테옴 정제를 위한 유기 용매 기반 단백질 침전

여기에서는 다양한 세포 유형의 세포 표면 단백질체의 특성화를 위한 단백질체학 워크플로우에 대해 설명합니다. 이 워크플로우에는 세포 표면 단백질 농축, 후속 시료 전처리, LC-MS/MS 플랫폼을 사용한 분석 및 특수 소프트웨어를 사용한 데이터 처리가 포함됩니다.

Cell Surface Proteome의 Label-free 정량화를 위한 "Cell Surface Capture" 워크플로우

단백질에 있는 글라이칸의 자동적이고 신속한 분석을 위한 시스템이 이전에 개발되었습니다. 이 기사에서는 바이오 의약품 및 기타 당접합체 물질의 글라이칸 구조를 분석하는 사용자와 같은 광범위한 사용자에게 최적화된 "글리코 정성 분석"을 위한 프로토콜을 제시합니다.

완전 자동화된 시스템을 사용한 재조합 단백질의 신속한 Glyco-Qualitative Assessment of recombinant proteins with a fully automated system (완전 자동화된 시스템을 사용한 재조합 단백질의 신속한 Glyco-Qualitative Assessment of recombinant proteins using a fully automated system)

이 프로토콜은 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 복잡한 종양 미세환경에서 이질적인 당단백질체에 대한 포괄적인 통찰력을 제공하는 통합 오믹스 기술인 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명합니다.

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다. 

질량분석법(UPLC-MS)과 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 비표적 대사 산물 프로파일링은 대사를 조사하는 강력한 기술입니다.  이 문서에서는 시료 조직 및 준비, 데이터 수집, 데이터 분석, 품질 관리 및 대사 산물 식별을 포함하여 혈청의 비표적 대사 산물 프로파일링에 사용되는 일반적인 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

울트라 성능 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석법 (UPLC-MS)에 의해 혈청 대규모 비 타겟 Metabolomic 프로파일

배우세요 LC-MS/MS를 이용한 고효율 N-글리칸 및 단백질 동시 정량 정제 방법을 통해 글리코믹스와 프로테오믹스를 통합 분석하는 기술입니다. 이 프로토콜은 암 및 대조군 샘플 간 정확한 상대 정량을 가능하게 합니다.

양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

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