양적 글리코 믹스와 단백질 체학 복합 정제 전략

이 단일 필터 기반 워크플로우의 전반적인 목표는 질량 분석 분석의 생물학적 샘플에서 N-글라이칸 및 단백질을 쉽고 정량적으로 정제하는 것입니다. 이 방법의 확장성, 속도 및 분석 재현성으로 인해 생물학적 질량 분석 실험실에 대한 자원 및 기술과 관련하여 직접 액세스할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 연구원들이 대규모 고처리량 생물학 연구에서 당체학, 당화 부위 점유 및 단백질체학 질문을 동시에 조사할 수 있다는 것입니다.

당사는 이 방법을 질량 분석법 맞춤형 유도체화 전략에 결합하여 암과 대조 상태 간의 정확하고 상대적인 정량화를 달성함으로써 N-글라이칸 측정의 문제를 극복했습니다. 분석적 변동성이 감소하면 글리콤과 단백질체 사이의 새로운 생물학적 상호 작용이 규명될 수 있으며, 이를 통해 질병 상태에 대한 중요한 통찰력과 바이오마커 발견을 위한 새로운 기회를 얻을 수 있습니다. 시작하려면 필터에 2.5마이크로리터의 플라즈마를 로드합니다.

그런 다음 2마이크로리터의 1M 디티오트레이톨 용액을 추가합니다.amp필터의 각 le. 200마이크로리터의 100mM 중탄산암모늄 PNGase 분해 완충액으로 시료를 희석합니다. 필터 샘플 튜브를 덮고 가볍게 와류를 일으키되 필터가 시트에서 방해가 되지 않도록 주의하십시오.

섭씨 56도에서 30분 동안 샘플을 배양하여 단백질과 당단백질을 변성시킵니다. 샘플을 알칼리화하려면 50마이크로리터의 1M 요오도아세트아미드를 첨가하여 약 200mM의 최종 농도를 제공합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 60분 동안 배양합니다.

플로우스루를 버리기 전에 14, 000 x g에서 샘플을 40분 동안 원심분리하여 변성된 당단백질을 필터에 농축합니다. 100마이크로리터의 PNGase 분해 버퍼로 샘플을 세척합니다. 당단백질을 필터에 농축하고 플로우스루를 버립니다.

세척 및 농축 단계를 총 3회 두 번 반복하여 필터 데드 볼륨에 농축액을 산출합니다. 세척이 완료되면 모든 플로우스루와 수집 바이알을 폐기하십시오. 그런 다음 새 채취 바이알로 옮긴 후 2마이크로리터의 글리세롤이 없는 펩타이드 N-글리코시다아제 F 또는 PNGase F를 필터에 추가합니다.

98마이크로리터 PNGase 분해 버퍼를 추가하여 총 부피를 100마이크로리터로 늘리고 필터를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. Spike in Digestion 프로토콜의 경우 섭씨 50도에서 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 신속하게 작업하여 샘플을 제거하고 글리세롤이없는 PNGase F의 추가 2 마이크로 리터를 스파이크하여 1-2 초 동안 샘플을 가볍게 소용돌이하여 혼합합니다.

섭씨 50도에서 추가로 2시간 동안 샘플을 배양합니다. 섭씨 20도에서 시료를 원심분리하여 글라이칸을 제거한 후 100마이크로리터의 PNGase 분해 버퍼를 필터에 추가하고 다시 원심분리합니다. 용리액과 동일한 채취 바이알에 남아 있는 N-결합 글라이칸이 포함된 세척제를 수집합니다.

두 번 반복한 후 필터를 제거하고 단백질체학 준비를 위해 새 수집 바이알에 넣습니다. 다음으로, 글라이칸 샘플을 섭씨 80도의 냉동고에서 얼을 때까지 30-60분 동안 배양합니다. 그런 다음 진공 농축기에서 실온에서 4-6시간 동안 완전히 건조합니다.

분해된 펩타이드가 포함된 필터를 400마이크로리터의 8M 요소 완충액으로 헹굽니다. 수집 바이알의 뚜껑을 닫고 가볍게 소용돌이치며 섞습니다. 모든 흐름을 버리기 전에 펩타이드를 필터에 농축하십시오.

요소 완충액 세척을 두 번 더 반복한 후 분해된 펩타이드가 포함된 필터를 트립신 분해 완충액으로 헹굽니다. 수집 바이알의 뚜껑을 닫고 가볍게 소용돌이치도록 혼합한 후 이전과 같이 필터에 다시 집중합니다. 모든 플로우 스루를 버리고 총 3번의 트립신 다이제스트 버퍼 세척에 대해 2회 더 반복합니다.

앞으로 사용할 모든 용리액과 세척액을 새 채취 바이알에 모으십시오. 그런 다음 발견 단백질체학을 위해 1:50 트립신 대 단백질 비율로 50마이크로리터의 돼지 변형 트립신을 첨가하거나 정량적 단백질체학 실험을 위해 1:5 트립신 대 단백질 비율로 추가합니다. 수집 바이알의 뚜껑을 닫고 가볍게 소용돌이치며 섞습니다.

섭씨 37도에서 2시간 동안 샘플을 배양한 후 신속하게 샘플을 제거하고 적절한 트립신 대 단백질 비율로 50마이크로리터의 트립신을 추가로 스파이크합니다. 혼합하기 위해 1-2초 동안 샘플을 가볍게 소용돌이치십시오. 그런 다음 섭씨 50도에서 추가로 2시간 동안 배양합니다.

이전과 같이 20분 동안 원심분리하여 펩타이드를 용출한 후 담금질 완충액으로 필터에 남아 있는 펩타이드를 헹굽니다. 15분 동안 이전과 같이 원심분리하여 필터를 용리합니다. 샘플의 펩타이드 농도를 정량화한 후 펩타이드 샘플을 섭씨 80도 냉동고에서 얼을 때까지 배양합니다.

그런 다음 진공 농축기에서 실온에서 4-6시간 동안 완전히 건조합니다. 그런 다음 액체 크로마토 그래피 질량 분석 또는 LCMS 분석 직전에 모바일 상 A에서 원하는 농도로 트립틱 단백질을 추출합니다. 2.5 마이크로리터 플라즈마의 트립틱 펩타이드 농도는 마이크로리터당 100에서 300 나노그램 사이입니다.

글라이칸 분석 전에 4-페네틸 벤조하이드라지드 시약으로 표시된 건조된 안정 동위원소와 천연 P2GPN 시약을 1밀리리터의 유도체화 용액에서 최종 농도 밀리리터당 0.25mg으로 재구성합니다. 시약이 완전히 용해되는 데 최대 10분이 걸립니다. 완전한 용해를 보장하기 위해 광범위하게 와류

건조된 N-글리칸을 200마이크로리터의 안정 동위원소 표지 시약 또는 천연 P2GPN 시약으로 태그합니다. 건조된 글라이칸을 다시 현탁시키기 위해 위아래로 피펫을 사용합니다. 그런 다음 샘플을 와류로 만들고 벤치 탑 원심 분리기에서 약 5초 동안 스핀다운합니다.

글라이칸을 섭씨 56도에서 3시간 동안 시약과 반응시킵니다. 즉시 인큐베이터에서 진공 농축기로 글라이칸을 옮기고 섭씨 55도에서 3-5시간 동안 완전히 건조합니다. 액체 크로마토그래피 및 질량 분석 직전에 태그가 지정된 N-글리칸을 25-50마이크로리터의 물에 다시 현탁시킵니다.

N-글라이칸이 완전히 용해되도록 피펫을 위아래로 움직입니다. 이전과 같이 샘플을 5분 동안 원심분리한 후 피펫 끝이 원심분리기 튜브 바닥에 닿지 않도록 주의하면서 상등액을 제거합니다. 한 쌍의 천연 동위원소 표지 시료를 1:1 비율로 결합하여 상대 정량화 탠덤 분석을 수행할 수 있습니다.

단백질체학 및 글리코믹스 워크플로우를 위한 2가지 LCMS 분석법을 준비합니다. 단백질 분석을 위해 약 400나노그램의 단백질을 NPA의 컬럼에 주입합니다. 분당 300나노리터의 속도로 샘플을 실행하며, 1마이크로리터의 사전 컬럼 평형 및 5마이크로리터의 분석 컬럼 평형을 이룹니다.

텍스트 프로토콜에 제공된 MS 조건에서 단백질을 이온화합니다. 글라이칸 분석을 위해 5마이크로리터의 재현탁 P2GPN 태그가 지정된 네이티브 및 안정 동위원소 표지된 Equi-M 샘플을 컬럼에 주입합니다. 2마이크로리터의 사전 컬럼 평형 및 5마이크로리터의 분석 컬럼 평형을 통해 분당 300나노리터의 속도로 샘플을 실행합니다.

그런 다음 텍스트 프로토콜에 제공된 MS 조건에서 글라이칸을 이온화합니다. 필터 기반 정제 프로토콜은 표준 고체상 추출 방법과 비교되었으며 2가지 프로토콜 사이에서 검출된 혈장 글라이칸의 양은 크게 다르지 않았습니다. 두 방법 모두에서 동일한 글라이칸이 변동성이 증가하는 검출 한계 근처에서 발견되었습니다.

필터 기반 또는 표준 고체상 추출 프로토콜에 의해 정제된 혈장의 equiM mixures에 대한 상호 변동성을 평가했습니다. 두 프로토콜 모두 평균이 0과 크게 다르지 않은 가우스 분포를 가졌습니다. 글라이칸의 80%는 2배의 변화 내에 속했습니다.

새로운 정제 프로토콜과 기존 정제 프로토콜에서 검출된 글라이칸의 분자량 분포는 크게 다르지 않았으며 동일한 범위를 다루었습니다. 질적으로, 글라이칸 간의 편향은 관찰되지 않았습니다. 혈장 단백질은 표준 필터 지원 시료 전처리 및 여러 인라인 프로토콜로 준비되었습니다.

확인된 단백질의 수는 다양한 프로토콜에 대해 유사했습니다. 비특이적 탈아미드화는 마이크로파 분해 및 스파이크 소화 불량 프로토콜에서 10% 미만으로 제어되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 정확한 당화(glycosylation) 부위 점유는 열과 시간 노출을 최소화하는 데 달려 있다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.

일단 마스터하면 인라인 페쿠리켄 N-글리칸 정제를 2일 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 따르면 정확한 단백질 N-글리칸 정량화 및 당화 부위 점유를 고차 통계 기법을 사용하여 통합하고 모델링할 수 있습니다. 이 기술은 암 생물학이 사용하는 복잡한 언어를 빠르게 다시 읽고, 단백질 치료제의 차이점을 정량적으로 비교하며, 생물학적 맥락에서 당화(glycosylation)의 중요성을 진정으로 밝힐 수 있는 능력을 제공합니다.