절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험

이 방법의 전반적인 목표는 구강 면역 및 치주염과 관련된 면역 반응을 심층적으로 분석하기 위해 잇몸 면역 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 치주염의 병인에 어떤 세포 인자들이 관여하는지와 같은 구강 면역 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 구강 면역 세포 네트워크를 평가할 수 있으며, 후속 인비트로(in-vitro) 연구에 충분한 양의 생존 세포를 분리할 수 있다는 점입니다.

본 프로토콜의 첫 번째 단계로, 마우스의 몸통을 고정하기 위해 핀을 꽂고 흉강과 복강을 열어 심장과 내부 장기를 노출시킵니다. 다음으로, 대정맥에 절개창을 내고 27-gauge 바늘이 장착된 3-milliliter 주사기를 사용하여 좌심실을 통해 3 milliliters의 PBS를 관류합니다. 모든 혈액이 씻겨 나가면, 마우스의 배 부분이 위를 향하도록 하여 해부 패드 위에 머리를 핀으로 고정합니다.

그 후 가위를 사용하여 입술의 각 구각에서 목 방향으로 절개하여, 하악 및 목 부위를 덮고 있는 피부를 분리하고 하부 조직과 근육을 노출시킵니다. 하악의 양측을 분리하기 위해 하악 절치 사이를 절개합니다. 구강 내에 접근할 수 있도록 분리된 하악의 각 측면을 25-gauge 바늘로 고정합니다.

구개부를 확인한 후, 10번 수술용 메스를 사용하여 첫 번째 어금니 바로 앞쪽과 세 번째 어금니 뒤쪽으로 수직 절개를 가합니다. 그런 다음 조직을 비강으로부터 분리하고, 하악골에서 블록을 분리합니다. 이후 잇몸 경계의 과잉 조직을 제거하고, 상악 및 하악 블록을 얼음 위에 보관된 5 mL의 collagenase 및 DNase가 들어 있는 50 mL 원심분리관(conical tube)으로 옮깁니다.

진탕 인큐베이터에서 37 °C로 1시간 동안 조직을 소화시키며, 마지막 5분 동안 0.5 M EDTA 50 µL를 첨가합니다. 그런 다음 조직에 냉각된 DNase 배지 5 mL를 넣고 튜브 내용물을 부드럽게 회전시켜 섞습니다. 이어서 4개의 조직 블록을 페트리 접시에 옮깁니다.

그 후 500 µL의 신선한 DNase 배지로 덮어줍니다. 메스를 사용하여 각 조직 블록에서 잇몸을 제거합니다. 그리고 배양 접시의 모든 내용물을 50 mL 튜브 위에 놓인 70 µm 셀 스트레이너로 옮깁니다.

페트리 접시와 체를 3~5 mL의 신선한 DNase 배지로 세척합니다. 그런 다음 멸균된 3 mL 주사기의 플런저를 사용하여 잇몸 조직을 체의 메시에 대고 으깹니다. 체를 30~35 mL의 차가운 DNase 배지로 헹구고, 여과액을 원심 분리합니다.

그 다음, 펠렛을 1 milliliter의 완전 배지에 재현탁하고 생존 세포 수를 측정합니다. 방금 시연한 면역 세포의 분리 및 처리 과정은 야생형 및 치주염 감수성 동물 모두에서 치은 세포의 사이토카인 분비 패턴에 대한 ex-vivo 자극 및 특성 분석을 수행하기에 충분한 수의 세포를 얻을 수 있게 합니다. 실제로, 치주염 감수성 LFA 녹아웃 마우스의 T 세포 및 자연 살해 세포 구획을 평가하는 이 밀도 도표에서 보여주는 것처럼 마우스 치은 면역 세포 조성을 분석할 수 있습니다.

적절한 게이팅 전략을 사용하여 TCR beta CD4 양성, TCR beta CD8 양성, TCR gamma delta 양성 T 세포뿐만 아니라 NK 세포 및 선천성 림프구 세포의 세포 내 사이토카인 생성 또한 측정할 수 있습니다. 기술을 충분히 숙달하고 적절하게 수행한다면, 면역 염색을 위해 3시간 이내에 세포를 분리할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 모든 단계를 효율적이고 빠르게 완료하는 것이 중요하며, 세포를 조작하지 않는 모든 시간에는 항상 얼음 위에 보관해야 함을 기억하십시오.

이 절차를 마친 후, 특정 세포 하위 집단의 기능과 관련된 추가적인 질문에 답하기 위해 세포 분류(cell sorting)와 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.