절연, 특성화 및 잇몸 면역 세포 네트워크의 기능 시험
2016년 2월 16일
우리는 분리, 표현형 특성화 및 쥐의 잇몸에서 면역 세포의 기능 분석을위한 기술을 설립했다.
이 방법의 전반적인 목표는 구강 면역 및 치주염과 관련된 면역 반응의 심층적인 특성화를 위해 치은 면역 세포를 분리하는 것입니다. 이 방법은 치주염의 발병기전에 어떤 세포 요인이 관련되어 있는지와 같은 구강 면역 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 구강 면역 세포 네트워크를 평가하고 다운스트림 체외 조사를 위해 충분한 생존 가능한 세포를 분리할 수 있다는 것입니다.
이 프로토콜의 첫 번째 단계로 핀을 배치하여 마우스의 몸을 고정시키고 흉강과 복강을 열어 심장과 내부 장기를 노출시키는 것으로 시작합니다. 다음으로 대정맥을 절개하고 27게이지 바늘이 장착된 3ml 주사기를 사용하여 좌심실을 통해 3ml의 PBS를 분출합니다. 피가 모두 씻겨 나오면 쥐의 머리를 배가 위를 향하도록 해부 패드에 고정합니다.
그런 다음 가위를 사용하여 입술의 각 부분을 목 쪽으로 자르고 하악골과 목 부위를 덮고 있는 피부를 분리하고 아래에 있는 조직과 근육을 노출시킵니다. 아래골의 양쪽을 분리하기 위해 아래쪽 앞니 사이를 자릅니다. 분리된 하악의 각 측면을 25게이지 바늘로 고정하여 구강에 접근합니다.
입천장을 확인한 후 10번 수술 칼날을 사용하여 첫 번째 어금니 바로 앞과 세 번째 어금니 뒤쪽에 수직 절개를 만듭니다. 그런 다음 비강에서 조직을 해부하고 하악골에서 블록을 해부합니다. 그런 다음 치은의 경계에서 과도한 조직을 제거하고 상악 및 하악 블록을 얼음 위에 5ml의 콜라겐 분해 효소와 DNase를 포함하는 50 ml 원추형 튜브로 옮깁니다.
섭씨 37도의 쉐이커 인큐베이터에서 1시간 동안 조직을 소화하고 마지막 5분 동안 50마이크로리터의 0.5몰 EDTA를 추가합니다. 그런 다음 조직에 5ml의 차가운 DNase 배지를 넣고 소용돌이치면서 튜브 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 다음으로, 4개의 조직 블록을 페트리 접시에 옮깁니다.
그리고 500 마이크로 리터의 새로운 DNase 배지로 덮으십시오. 메스를 사용하여 각 조직 블록에서 치은을 제거합니다. 그리고 접시의 전체 내용물을 50ml 튜브 위에 있는 70미크론 셀 스트레이너로 옮깁니다.
페트리 접시와 여과기를 3-5 밀리리터의 신선한 DNase 배지로 씻으십시오. 그런 다음 멸균 3ml 주사기의 플런저를 사용하여 치은 조직을 여과기의 그물망에 으깨십시오. 30-35 밀리리터의 차가운 DNase 배지로 스트레이너를 헹구고 여과액을 원심 분리합니다.
그런 다음 완전한 배지 1ml에 입천장을 재현탁하고 생존 가능한 세포의 수를 결정합니다. 방금 설명한 바와 같이 면역 세포의 분리 및 처리는 야생형 동물과 치주염에 취약한 동물 모두의 치은 세포 사이토카인 분비 패턴의 생체 외 자극 및 특성화를 수행하기에 충분한 수의 세포를 생성합니다. 실제로, 쥐 치은 면역 세포 조성은 치주염에 취약한 LFA 녹아웃 마우스에서 t 및 자연 살해 세포 구획을 평가하는 이러한 밀도 플롯에서 입증된 바와 같이 분석할 수 있습니다.
적절한 게이팅 전략을 사용하여 TCR 베타 CD4 양성, TCR 베타 CD8 양성 및 TCR 감마 델타 양성 t 세포, NK 및 선천성 림프 세포의 세포 내 사이토카인 생성도 측정할 수 있습니다. 일단 마스터되면 기술이 적절하게 수행되면 면역 염색을 위해 3시간 내에 세포를 분리할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모든 단계를 효율적이고 신속하게 완료하고 세포를 조작하지 않을 때마다 세포를 얼음 위에 유지하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라 셀 정렬과 같은 다른 방법을 수행하여 특정 셀 하위 집합의 기능과 관련된 추가 질문에 답할 수 있습니다.
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개요
이 기사는 생쥐 잇몸에서 면역 세포를 분리하고 특성화하는 기술을 소개합니다. 이 방법은 구강 면역 및 치주염에 대한 이해를 향상시키는 것을 목적으로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 구강 생물학
- 치주과학
배경
- 구강 내 면역 반응을 이해하는 것은 치주 질환을 다루는 데 매우 중요합니다.
- 잇몸 면역 세포는 구강 면역에서 중요한 역할을 합니다.
- 현재 방법은 상세한 분석을 위한 충분한 생존 가능한 세포를 제공하지 않을 수 있습니다.
- 이 기술은 심층적인 기능 연구를 가능하게 함으로써 그 격차를 메우는 것을 목적으로 합니다.
연구 목적
- 잇몸 면역 세포를 특성화를 위해 분리합니다.
- 치주염 발병 메커니즘에 관여하는 세포 요인을 조사합니다.
- 구강 면역 세포 네트워크를 평가합니다.
사용된 방법
- 마우스를 고정하고 내부 기관을 노출합니다.
- 혈액 세척을 위해 대정맥에 절개합니다.
- 주사기를 사용하여 왼쪽 심실을 통해 PBS를 풍부하게 주입합니다.
- 추가 분석을 위해 마우스를 준비합니다.
주요 결과
- 생존 가능한 잇몸 면역 세포의 성공적인 분리.
- 구강 건강과 관련된 면역 반응의 특성화.
- 치주염 발병 메커니즘에 대한 통찰력.
- 후속 연구를 위한 인 비트로 연구의 가능성.
결론
- 이 기술은 구강 면역을 연구하기 위한 귀중한 도구를 제공합니다.
- 잇몸 조직에서 면역 세포 동태에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 향후 연구는 이 방법을 활용하여 치주 질환에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Precise isolation and functional profiling of gingival immune cells enables mechanistic de-risking in oral immunology and supports target validation for inflammatory disease research. This workflow provides high-viability cell populations for quantitative phenotyping and ex vivo functional assays, strengthening predictive confidence in early discovery and translational studies. The approach is positioned to inform portfolio decisions in immunology and oral health R&D by enabling robust interrogation of tissue-resident immune networks.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune cell subsets implicated in oral inflammatory pathogenesis.
- Supports functional target validation through ex vivo cytokine secretion assays.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying immune cell contributions to disease models.
- Provides quantitative data for hypothesis-driven portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers viable, phenotypically characterized immune cells for downstream assay development.
- Supports reproducible preparation of biological samples for standardized screening workflows.
- Enables quantitative readouts of immune function for compound evaluation.
- Improves scalability and assay readiness for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns immune cell profiling with disease-relevant oral models for translational continuity.
- Enables functional biomarker discovery in preclinical oral immunopathology studies.
- Supports risk-adjusted advancement of immunomodulatory strategies targeting oral tissues.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical candidate selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying high-quality immune cell preparations for both mechanistic studies and functional screening in oral disease models.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing on immune cell roles in oral tissue homeostasis and pathology.
- Screening: Supplies reproducible, viable cell populations for assay development and compound testing.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cytokine secretion and immune cell phenotypes for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in disease-relevant oral models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse oral immunology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in oral immune research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable immune cell isolation for cross-study comparability.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of oral immunology assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and approaches in oral and mucosal immunology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and immune cell handling.
- Demands access to flow cytometry and ex vivo functional assay infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible cell isolation and analysis.
- Adaptation to other mucosal tissues may require protocol optimization.
- Cell viability and yield are sensitive to procedural timing and temperature control.
