크기 배제 ICP-MS를 이용하여 정량적 Metalloproteomic 분석을위한 표준

이 기술의 전반적인 목표는 알려진 금속단백질 표준물질의 사용을 기반으로 복잡한 표준물질에서 다양한 금속단백질을 정량화할 수 있는 것입니다. 이 방법은 생물학에서 금속의 역할에 대한 주요 질문에 답할 수 있습니다. 예를 들어, 질병에서 단백질의 금속 상태는 어떻게 변합니까?

이 기술의 주요 장점은 네이티브 상태에서 단백질의 금속 상태를 측정할 수 있다는 것입니다. 이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 Amber Lothian이 될 것입니다. 먼저, Tris 완충 식염수를 사용하여 5분 동안 수동 다운 또는 초음파 처리로 균질화된 조직 또는 세포 배양 샘플을 수행합니다.

16, 000 시간 G에 원심분리에 의하여 균질산염을 5 분 동안 명백하게 하십시오. 생성된 상층액을 수집한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단백질 농도를 측정하여 단백질의 총량을 정규화합니다. 유도 결합 플라즈마 분광분석기(inductively coupled plasma maspectrometor)를 제조업체의 프로토콜을 사용하여 예열하고 조정합니다.

금속 단백질 표준을 희석하여 1%의 질산을 사용하여 리터당 0에서 500마이크로그램 범위 내로 떨어지는 것을 즐깁니다. 이 범위 내에서 표준을 달성하려면 1과 20을 초과하는 희석액을 사용하지 마십시오. 먼저 7가지 보정 수준을 분석하여 주입 순서를 설정합니다.

농도는 리터당 0에서 500마이크로그램 사이이며, 그 다음은 금속 단백질 표준물질입니다. 7가지 보정 수준은 리터당 0, 1, 5, 10, 50, 100 및 500마이크로그램입니다. 다음으로, 관심 있는 요소를 선택합니다.

여기에는 철, 구리, 아연, 코발트 및 요오드를 사용하십시오. 그것들은 단백질 표준물질이 묶여 있는 요소이기 때문입니다. element selector 탭을 열고 분석할 원소와 해당 동위원소 질량을 추가하여 획득 방법에서 원소를 선택합니다.

그런 다음 기기로 샘플 분석을 수행합니다. 기기 소프트웨어는 분석 중인 각 원소에 대한 보정 곡선을 자동으로 생성합니다. 검량선을 사용하여 미지의 샘플에서 금속의 농도를 측정합니다.

벌크 분석 결과에서 구리, 아연 과산화물 디스뮤타아제 및 페리틴의 혼합물을 사용하여 포유류 조직에서 가장 풍부한 세 가지 미량 원소를 포함하는 금속 단백질 표준물질을 생성합니다. 200밀리몰의 질산암모늄 완충액을 사용하여 hyperformance 퀵 크로마토그래피 또는 HPLC 펌프를 분당 5밀리리터의 유속으로 5분 동안 퍼지합니다. 시스템이 퍼지되면 유량을 분당 1밀리리터의 영점으로 설정합니다.

그리고 측면의 제외 열을 연결합니다. 컬럼의 반대쪽 끝을 UV 검출기에 연결하고 피크 튜브를 사용하여 측정 흡광도를 280나노미터로 설정합니다. 최종 0점 4ml/분 유속에 도달할 때까지 분당 0점 1밀리리터씩 컬럼의 유속을 점진적으로 증가시킵니다.

이 현상이 발생하는 동안 컬럼에 대한 튜빙 연결부에 누출이 있는지 확인하십시오. 이 시스템의 압력을 모니터링하여 소프트웨어에서 크로마토그램의 압력 트레이스를 관찰하여 컬럼 요구 사항을 초과하지 않는지 확인합니다. 컬럼이 5-10 컬럼 부피에 걸쳐 필요한 유속으로 평형을 이루도록 둡니다.

평형을 이룬 후 시료 분석이 이루어질 수 있도록 기기를 연결합니다. HPLC Method를 설정하여 15분 동안 분당 4ml의 영점 속도로 컬럼 위로 버퍼 A를 펌핑합니다. 하드웨어 설정을 변경하기 전에 ICPMS를 대기 모드로 전환하십시오.

대기 모드에 들어가면 자동 샘플러에 대한 통신을 끄고 샘플 소개를 다른 것으로 변경합니다. PEEK 튜빙을 사용하여 UV 검출기의 유출을 ICPMS의 분무기에 직접 연결합니다. ICPMS의 전원을 켜고 기기를 10-20분 동안 예열합니다.

플라즈마가 점화된 후 ICPMS의 원격 케이블을 HPLC 자동 샘플러 뒷면에 연결합니다. 플라즈마가 점화되면 이 작업을 수행합니다. 그렇지 않으면 ICPMS가 켜져 있지 않기 때문에 HPLC 시스템이 자동으로 종료됩니다.

먼저 수집 방법을 스펙트럼에서 시간 분석 수집으로 변경하여 LC ICPMS에 대한 데이터를 수집하도록 ICPMS 방법을 변경합니다. 그런 다음 분석할 요소를 선택합니다. 철, 구리, 아연, 코발트, 요오드 및 기타 관심 원소 및 통합 시간 설정.

관심 원소를 선택한 후 크로마토그래피의 실행 시간과 일치하도록 수집 시간을 조정합니다. 버퍼에 포함된 세슘 및 안티몬이 흐르는 크로마토그래피 버퍼를 사용하여 감도 및 충돌 셀 헬륨 가스 유량에 대해 ICPMS를 수동으로 조정합니다. 금속 이온 수치가 안정화되고 상대 표준 편차 값이 5% 미만이 되면 시스템을 사용할 준비가 된 것입니다.

HPLC 및 ICPMS 소프트웨어 프로그램 모두에서 샘플 실행 목록을 만듭니다. 샘플 실행 목록에는 각 샘플이 주입되는 순서가 포함되어 있습니다. 데이터가 저장될 이름도 포함됩니다.

목록의 총 샘플 수가 두 프로그램 간에 일치하는지 확인합니다. HPLC에 의한 샘플 주입으로 ICPMS가 데이터 수집을 시작하게 되므로 HPLC 전에 ICPMS에 대한 샘플 배치를 시작합니다. 이 작업을 올바른 순서로 수행하지 않으면 데이터가 누락됩니다.

다양한 부피의 superoxide dismutase 및 ferritin mixed standard를 주입하여 검량선 점을 생성합니다. 주입 용량은 1 마이크로 리터에서 30 마이크로 리터까지 다양합니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석하기 전에 조직, 혈장 또는 세포 배양과 같은 알려지지 않은 각 샘플을 분석합니다.

2000에서 60, 000 피코그램의 철이 기둥에 주입 된 페리틴의 환상이 표시됩니다. 회귀 분석은 피크 면적을 사용하여 수행되었습니다. 구리, 아연, 과산화물 디스뮤타아제에 대한 환상 프로파일은 구리와 아연 모두에 대해 표시됩니다.

피크 영역을 사용하여 생성된 회귀 분석도 표시됩니다. 회귀 분석의 결과는 초당 카운트의 원시 데이터를 초당 피코그램으로 변환하는 데 사용됩니다. 단백질과 관련된 금속의 양이 정량적으로 결정될 수 있도록.

이 기술은 복잡한 생물학적 샘플에서 금속 단백질을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 SEC ICPMS로 분리된 인간의 뇌를 보여줍니다. 각각은 다른 관심 금속을 나타냅니다.

즉, 구리, 아연 또는 철입니다. 여기에 표시된 것은 인간 플라즈마에 이 기술을 적용했을 때 얻은 흔적입니다. 샘플의 복잡성과 풍부함은 보이는 피크의 수에 영향을 미칩니다.

예상대로 혈장은 세룰로플라스민(ceruloplasmin)과 트랜스페린(transferrin)을 포함한 몇 가지 금속단백질에 의해 지배됩니다. 이 비디오를 시청한 후에는 복잡한 샘플에서 금속 단백질의 기본 상태를 측정하기 위해 기기를 설정하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 완전히 익히면 3-4시간 내에 성공적으로 적용할 수 있습니다.

이를 통해 하루에 20-36개의 샘플을 분석할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 구리 및 아연에 관심이 있는 경우 구리 아연 SOD와 같은 적절한 금속 단백질 표준물질을 사용하는 것이 중요합니다. 뿐만 아니라 세슘과 같은 버퍼의 내부 표준물질도 있어 시간 경과에 따른 기기의 드리프트를 수정할 수 있습니다.

이 절차에 따라 다른 형태의 질량 분석법을 구현하여 중요한 질문에 답할 수도 있습니다. 예를 들어, 내 샘플에 존재하는 금속 단백질은 무엇입니까? 이는 분해 및 질량 분석 단백질 펩타이드 염기서열분석의 표준 트립을 통해 수행할 수 있습니다.

또는 단백질을 원래 상태로 재치 있게 분석함으로써. 개발 후 이 기술은 단백질체학 분야의 연구자들이 알츠하이머병과 같은 질병에서 금속단백질의 역할을 이해할 수 있는 길을 열 수 있습니다. 농축 질산 및 임상 샘플로 작업하는 것을 잊지 마십시오.

적절한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다.