에 RNAi의 트리거 배달

이 방법의 전반적인 목표는 Anopheles gambiae에 RNA 간섭 트리거를 전달하여 번데기 발달 단계부터 시작되는 유전자 넉다운을 유도하는 것입니다. 이 방법은 매개체 생물학 분야의 핵심 질문에 답하고, 성충 이전 또는 성충 초기 발달 단계에서 역할을 하는 유전자를 발견하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 과거에 RNA 간섭 주입 프로토콜이 시행되지 않았던 발달 간격인 번데기 단계에서 유전자 넉다운을 시작함으로써, 연구자가 신속한 기능 유전체 연구를 수행할 수 있는 기회를 제공한다는 점입니다.

주입 단계에서 요구되는 정밀도와 해당 발달 단계에서 번데기의 섬세한 특성 때문에 숙달이 어려울 수 있으므로, 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 관심 유전자를 선택한 후, 오프타겟 효과(off target effects)가 없을 것으로 예측되는 200~800 base pair 영역을 식별하고 표준 PCR 증폭을 수행하여 T7 프로모터 서열이 양 끝에 위치한 이중 가닥 RNA 합성 템플릿을 얻습니다. 그런 다음 이중 가닥 RNA를 합성하고 상용 in vitro 키트를 사용하여 생성물을 정제합니다.

최종 RNA 농도를 µL당 3 µg으로 조정합니다. 다음으로, 표준 2% agarose gel을 사용하여 0.5 µL의 이중 가닥 RNA를 템플릿 DNA 및 표준 마커와 비교합니다. 전기영동이 완료되면, 이중 가닥 RNA 밴드의 품질과 길이를 확인합니다.

가시적인 비특이적 생성물이 없어야 합니다. 이중 가닥 RNA는 템플릿 DNA보다 더 느리게 이동합니다. 보관을 위해 이중 가닥 RNA를 소분하여 -20 °C에서 보관하십시오.

Fast Green FCF 염료 준비부터 시작합니다. 먼저, RNase-Free water를 사용하여 염료를 0.1% v/v 농도로 희석합니다. 그 다음, 준비된 용액 1 µL를 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 옮깁니다.

물을 증발시키기 위해 시료가 담긴 튜브를 65 °C에서 약 3시간 동안 가열하십시오. 그 다음, 고체 염료를 사용하기 전에 튜브를 최소 30분 동안 냉각하십시오. 이어서, 붕규산 유리 튜브를 이용하여 인출 유리 주입 바늘을 제작하십시오.

니들 풀러(needle puller)를 팁 직경 10~30 µm로 설정하십시오. NARISHIGE 모세관 풀러의 경우, 첫 번째 히터를 100으로, 두 번째 히터를 70으로 설정하십시오. 그 다음 모세관 니들을 고정하고 풀링(pulling)을 진행하십시오.

이제 주입 스테이션을 준비합니다. 현미경 아래에서 쉽게 조작할 수 있는 플랫폼을 선택하십시오. 플랫폼 위에 먼저 두꺼운 여과지를 테이프로 고정합니다.

그 다음, 두꺼운 여과지 위에 얇은 여과지 한 장을 테이프로 고정합니다. 이어서 염료 고체 튜브에 주입할 각 이중 가닥 RNA 10 µL를 첨가하고 염료를 재현탁합니다. 이 튜브들을 얼음에 보관하십시오.

이제 주입할 번데기를 수집합니다. 60mm 페트리 접시에 3ml의 탈이온수를 채우고, 플라스틱 전이 피펫을 사용하여 색이 옅은 번데기 약 50마리를 접시로 옮깁니다. 이미 중간에서 진한 정도의 경화 단계에 도달한 번데기는 큐티클 손상이 발생하여 생존율이 낮으므로, 색소 침착이 적은 번데기만을 사용하십시오.

미세주입의 첫 번째 단계는 바늘의 끝을 여는 것입니다. 현미경 하에서 미세 핀셋을 사용하여 바늘의 최말단 팁을 제거합니다. 그런 다음 30 gauge 바늘과 주사기를 사용하여 바늘 내부에 미네랄 오일을 채웁니다.

채운 후, 마이크로인젝터를 사용하여 과잉 오일을 배출하십시오. 마이크로인젝터가 69 nanoliter 부피를 흡입하도록 설정하십시오. 그런 다음, 준비된 주입용 RNA로 니들의 앞부분을 채우십시오.

이중 가닥 RNA의 분주 상태에 문제가 없는지 테스트하십시오. 팁의 막힘과 바늘의 불완전한 고정이 주요 문제 원인입니다. 인젝터 준비가 완료되면, 번데기 1~3마리를 선택하여 거름종이 스테이지로 옮기십시오.

붓을 사용하여 배측 큐티클에 접근할 수 있도록 번데기의 방향을 잡습니다. 종이를 눌러 번데기에 묻은 과잉 수분을 흡수시킵니다. 젖은 붓으로 번데기를 고정한 상태에서, 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로 움직여 복부와 흉부 사이의 배측 큐티클에 약 30도 각도로 바늘을 삽입합니다.

그 다음, 이중 가닥 RNA를 혈림프에 1~2회 펄스로 주입합니다. 주입이 성공했다면 염료가 전신으로 퍼지는 것이 보여야 합니다. 번데기에 주입할 때는 바늘이 등쪽 큐티클만 관통하도록 하는 것이 매우 중요합니다.

바늘 천자가 복부 큐티클을 관통한 경우, 염색된 액체가 번데기 외부에 고이거나 여과지에 염료가 묻어 나오는 것이 확인됩니다. 이러한 경우에는 해당 번데기를 폐기해야 합니다. 염료가 혈림프 전체로 확산되지 않는다면, 바늘 팁이 막혔을 가능성이 높습니다.

팁을 약간 움직여 RNA와 염료가 방출되었는지 확인합니다. 염료 방출의 징후가 없다면, 해당 번데기는 폐기하십시오. 그다음 바늘 끝의 상태를 평가하고 새로운 번데기에 다시 주입을 수행합니다.

번데기에 성공적으로 주입한 후, 젖은 붓을 사용하여 바늘에서 조심스럽게 분리하고, 발달을 완료할 수 있도록 물이 담긴 접시에 옮깁니다. 주입된 번데기가 담긴 접시를 정상적인 사육 조건의 모기 케이지 또는 용기에 넣습니다. 성충의 먹이원으로는 10% w/v 농도의 glucose 용액을 적신 솜구를 제공합니다.

성충이 우화한 후, 대조군과 비교하십시오. 예를 들어, 이중 가닥 SRPN2 곤충의 경우 가성종양(pseudotumor) 형성 여부를 매일 평가해야 합니다. 이를 위해 성충을 -20 °C에서 2~3분 동안 냉각시킨 후, 관찰을 위해 2 °C 콜드 플레이트로 옮기십시오.

성충 관찰 후, 이들을 곤충 사육 구역으로 돌려보내십시오. 해당 기술을 숙달했을 때, 주입된 번데기의 우화율은 약 70%였습니다. 주입된 번데기의 일부에서는 번데기 허물에서 부분적으로만 우화하여 생존 불가능한 모기가 되는 현상이 발생했습니다. 주입된 모기와 주입되지 않은 모기 간의 우화 속도 차이는 없었으며, 주입의 영향은 성별에 따라 다르지 않았습니다.

우화 10일 후, 주입된 모기의 생존율은 주입하지 않은 대조군과 비교하여 눈에 띄는 변화가 없었습니다. 세린 프로테아제 억제제인 SRPN2는 양성 대조군으로 사용되었으며, 이중 가닥 LacZ는 이중 가닥 RNA 주입의 음성 대조군으로 사용되었습니다. 우화 후 3일째에, 이중 가닥 SRPN2가 주입된 성체에서 광학 현미경을 통해 가성종양이 확인되었습니다.

8일 후, 가성종양(pseudotumors)이 매우 뚜렷하게 나타났습니다. 성체 단계의 모기에서, double-stranded SRPN2를 주입한 대부분의 개체는 큐티클을 통해 멜라닌화된 가성종양을 관찰할 수 있었던 반면, 대조군에서는 가성종양이 관찰되지 않았습니다. 주입 5일 후, double-stranded SRPN2를 주입한 모기의 SRPN2 단백질 수치는 double-stranded LacZ를 주입한 대조군 및 비주입 대조군과 비교하여 유의미하게 낮았습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 새롭게 개발된 주입 프로토콜을 사용하여 Anopheles gambiae 번데기에 RNA 간섭 트리거를 전달하는 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사용자는 번데기의 예측 불가능한 움직임으로 인해 어려움을 겪습니다. 하지만 번데기의 정확한 위치 선정과 고정 방법을 연습하면 주입 성공률과 주입 품질을 크게 높일 수 있습니다.

기술을 숙달하고 나면, 번데기당 주입에 약 30초가 소요됩니다. 이 기술의 개발을 통해 벡터 생물학 분야의 연구자들이 말라리아 매개체인 Anopheles gambiae의 성충 전 단계 및 초기 성충 발달 단계에서 유전자 기능을 탐구하고 평가할 수 있는 길을 열었습니다. 본 절차 이후, Western blot 분석이나 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 단백질 또는 전사체 발현 수준에서 표적 유전자의 녹다운 정도를 각각 결정할 수 있습니다.

궁극적으로, 이 기술은 모기에 의한 기생충 전달에 결정적인 역할을 하는 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있으며, 이러한 접근 방식은 새로운 표적을 찾아내고 더욱 효과적인 매개체 제어 전략을 수립하는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공할 것입니다.