에 RNAi의 트리거 배달 아노 펠 레스 gambiae 번데기

이 방법의 전반적인 목표는 번데기 발달 단계에서 시작되는 유전자 녹다운을 시작하기 위해 Anopheles gambiae에서 RNA 간섭 유발 요인을 전달하는 것입니다. 이 방법은 벡터 생물학 분야의 주요 질문에 답하고 성체 이전 또는 초기 성인 발달 단계에서 역할을 하는 유전자를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 과거에 RNA 간섭 주입 프로토콜이 구현되지 않았던 발달 간격인 번데기 단계에서 유전자 녹다운을 시작하여 연구자에게 신속한 기능 유전체 연구를 수행할 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다.

이 발달 단계에서 번데기의 섬세한 특성과 필요한 정밀도로 인해 주입 단계를 마스터하기 어려울 수 있기 때문에 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다. 관심 유전자를 선택한 후, off-target 효과가 없을 것으로 예상되는 200 - 800 염기쌍 영역을 확인하고 표준 PCR 증폭을 수행하여 T7 promoter sequence와 함께 있는 double-stranded RNA synthesis template을 얻습니다. 그런 다음 이중 가닥 RNA를 합성하고 상업용 in vitro 키트를 사용하여 제품을 청소합니다.

최종 RNA 농도를 마이크로리터당 3마이크로그램으로 조정합니다. 다음으로, 표준 2% 아가로스 겔을 사용하여 이중 가닥 RNA의 1/2 마이크로리터를 템플릿 DNA 및 표준 마커와 비교합니다. 다 떨어지면 이중 가닥 RNA 밴드의 품질과 길이를 확인합니다.

눈에 띄지 않는 불특정 제품이 없어야 합니다. 이중 가닥 RNA는 주형 DNA보다 더 느리게 이동합니다. 보관을 위해 이중 가닥 RNA 분취액을 준비하고 섭씨 영하 20도로 유지합니다.

패스트 그린 FCF 염료를 준비하는 것으로 시작합니다. 먼저 염료를 RNase-Free 물에 0.1부피로 희석합니다. 그런 다음 1 마이크로 리터 용량의 제제를 1.5 밀리리터 마이크로 분리 튜브로 옮깁니다.

적재된 튜브를 섭씨 65도에서 약 3시간 동안 가열하여 물을 증발시킵니다. 그런 다음 염료 고형물을 사용하기 전에 튜브를 최소 30분 동안 식히십시오. 다음으로, 붕규산 유리관에서 뽑은 유리 주사 바늘을 준비합니다.

바늘 풀러를 팁 직경이 10-30미크론으로 설정되도록 합니다. NARISHIGE 모세관 풀러의 경우 첫 번째 히터를 100으로, 두 번째 히터를 70으로 설정합니다. 그런 다음 모세관 바늘을 끼우고 당기기를 진행합니다.

이제 주입 스테이션을 준비합니다. 현미경 아래에서 쉽게 조작할 수 있는 플랫폼을 선택하십시오. 플랫폼에서 먼저 두꺼운 여과지를 테이프로 감습니다.

그런 다음 두꺼운 여과지 위에 얇은 여과지 하나를 테이프로 감습니다. 다음으로, 염료 고체 튜브에 주입 할 각 이중 가닥 RNA를 10 마이크로 리터 첨가하고 염료를 다시 현탁시킵니다. 이 튜브를 얼음에 보관하십시오.

이제 주입할 번데기를 모으십시오. 60mm 페트리 접시에 10ml의 탈이온수를 채우고 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 약 50개의 옅은 색 번데기를 접시에 옮깁니다. 이미 중간에서 어두운 무두질 수준에 도달한 번데기는 큐티클 손상을 입고 생존율이 낮으므로 색소가 옅은 번데기만 사용하십시오.

미세 주입의 첫 번째 단계는 바늘을 여는 것입니다. 현미경으로 미세한 집게를 사용하여 바늘의 맨 끝 부분을 잘라냅니다. 그런 다음 30 게이지 바늘과 주사기를 사용하여 바늘에 미네랄 오일을 다시 채웁니다.

채워지면 마이크로인젝터를 사용하여 여분의 오일을 배출합니다. 마이크로인젝터가 69나노리터 부피를 당기도록 설정합니다. 그런 다음 준비된 주사 RNA를 바늘 전면에 채웁니다.

이중 가닥 RNA의 디스펜싱에 문제가 있는지 테스트합니다. 팁이 막히거나 바늘이 부적절하게 고정되는 것이 문제의 주요 원인입니다. 주입기가 준비되면 번데기 1-3개를 골라 여과지 단계로 옮깁니다.

붓을 사용하여 등쪽 표피에 접근할 수 있도록 번데기의 방향을 지정합니다. 종이를 누르면 번데기에 여분의 물이 흡수됩니다. 젖은 붓으로 번데기를 가만히 유지하면서 전방에서 후방의 움직임을 사용하여 복부와 흉부 사이의 등쪽 표피에 약 30도 각도로 바늘을 삽입합니다.

그런 다음 이중 가닥 RNA의 1-2개 펄스를 혈림프에 주입합니다. 주입이 성공한 경우 염료가 몸 전체에 분산되는 것을 볼 수 있어야 합니다. 번데기를 주사하는 동안 바늘이 등쪽 표피를 뚫는 것만 하는 것이 중요합니다.

바늘 천자가 복부 표피를 통해 확장되면 번데기 외부에 염료 표지 액체가 고여 있거나 염료가 여과지로 옮겨집니다. 이러한 경우 번데기를 버려야 합니다. 염료가 혈림프 전체에 분포되지 않으면 끝이 막혔을 가능성이 큽니다.

팁을 약간 움직여 RNA와 염료의 방출이 발생했는지 확인합니다. 염료가 방출될 조짐이 없으면 번데기를 버리십시오. 그런 다음 바늘 끝을 평가하고 새 번데기에 다시 주사를 수행합니다.

번데기를 성공적으로 주입한 후 젖은 붓을 사용하여 바늘에서 번데기를 부드럽게 떼어내고 물이 담긴 접시에 넣어 발달을 완료합니다. 주입된 번데기 접시를 정상적인 사육 조건에서 모기장이나 용기에 넣으십시오. 성인용 식품 공급원의 경우, 면봉에 담근 10% 중량 x 부피 용액에 포도당을 제공하십시오.

성충이 나온 후에는 대조군과 비교하십시오. 예를 들어, 이중 가닥 SRPN2 곤충은 가성 종양 형성에 대해 매일 평가해야 합니다. 이렇게하려면 성인을 섭씨 영하 20도에서 2-3 분 동안 식힌 다음 섭씨 2도 냉판으로 옮겨 관찰하십시오.

성체를 본 후에는 곤충 사육 구역으로 돌려 보냅니다. 이 기술이 숙달되면 주입된 번데기가 약 70%의 빈도로 나타났습니다.주입된 번데기의 하위 집합에서 번데기 사례에서 부분적으로 출현하여 생존 불가능한 모기로 이어졌습니다. 주사된 모기와 주사되지 않은 모기 사이에 출현 속도에는 지연이 없었으며, 주사의 영향은 성별에 따라 다르지 않았다.

출현 후 10일 후, 주입된 모기의 생존율은 주입되지 않은 대조군에 비해 눈에 띄는 변화가 없었다. 세린 프로테아제 억제제인 SRPN2는 양성 대조군으로 사용되었고, 이중 가닥 LacZ는 이중 가닥 RNA 주사에 대한 음성 대조군으로 사용되었습니다. 출현 후 3일이 지났을 때, 이중 가닥 SRPN2를 주입한 성인의 가성종양이 광학 현미경을 통해 분명해졌습니다.

8일 후, 가성종양이 매우 두드러졌습니다. 성체 모기의 경우, 대부분의 이중 가닥 SRPN2 주입 동물의 표피를 통해 흑색성 가성종양이 관찰된 반면, 대조군에서는 가성종양이 관찰되지 않았다. 주사 5일 후, 이중 가닥 SRPN2 주입 모기에서 SRPN2 단백질 수치는 이중 가닥 LacZ 주입 대조군 및 비주입 대조군에 비해 현저히 낮았습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 새로 개발된 주입 프로토콜을 사용하여 Anopheles gambiae 번데기로 RNA 간섭 트리거 전달을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 번데기의 예측할 수 없는 움직임 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 그러나 번데기의 올바른 위치와 안정화를 연습하면 성공적인 주입 속도와 주입 품질이 크게 향상됩니다.

이 기술을 마스터하면 번데기당 약 30초가 소요됩니다. 이 기술의 개발로 우리는 매개체 생물학 분야의 연구자들이 말라리아 매개체 Anopheles gambiae의 성체 이전 및 초기 성인 발달 단계에서 유전자 기능을 탐구하고 평가할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차에 따라 웨스턴 블롯 분석 또는 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 수행하여 각각 단백질 또는 전사체 발현 수준에서 표적 유전자 녹다운의 정도를 결정할 수 있습니다.

궁극적으로 이 기술은 모기에 의한 기생충 전염에 중요한 유전자를 식별하는 데 도움이 될 수 있으며, 이 접근 방식은 새로운 표적을 식별하고 보다 효과적인 매개체 제어 전략을 수립할 수 있는 방법에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 것입니다.