Name: 전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 배우세요 제브라피시 전체 배아에서 인산화 단백질 면역염색 기법을 통해 세포 신호 전달과 발달 과정을 관찰하는 방법을 Danio rerio를 이용하여 연구하세요.

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이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 IOS-0817658에 의해 지원되었다.

이 프로토콜의 제브라 피쉬 절차는 버지니아 커먼 웰스 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 시약 1. 준비 <ol><li> 4 % PFA / PBS. 흄 후드에서 파라 포름 알데히드의 8g (PFA)를 달아. 여전히 흄 후드에서, ~ 80 ml를 50 ° C로 교반 및 가열 증류수 H 2 O를 건조 PFA를 용해하는 동안. PFA 완전히 용해되어 용액이 명확 할 때까지 신선한 1N NaOH를 10 방울 - 교반하면서, 3을 추가합니다. 열에서 제거하고 100 ml의 2 배 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 증류수 H 2 O 200 ml의 부피를 가져와 실온으로 냉각하고 사용하기 전에 7.4의 산도를 확인합니다. 4 ° C에서 어둠에 보관하지만 1 주일 이내에 사용한다. </li><li> 어떤 보충없이 100 % 메탄올을 사용합니다. 어떤 보충없이 95 % 에탄올을 사용합니다. </li><li> 인산염 완충 트윈 (PBT)를 준비합니다. 0.1 % 트윈 -20으로 인산 완충 식염수 (PBS)를 보완. 0을 추가합니다.1X PBS 100 ㎖에 20 % 트윈 -20 스톡 용액 5 ㎖. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 인산염 완충 트리톤-X (PBTx)를 준비합니다. 0.1 % 트리톤 X-100으로 PBS를 보충합니다. PBS 100 ㎖에 20 % 트리톤 X-100 주식의 0.5 ML을 추가합니다. 실온에서 보관하십시오. </li><li> 10 % NGS / PBTx를 준비합니다. 정상 염소 혈청 (NGS) 블록은 비 - 특이 적 결합 부위. -20 ° C에서 분취에 보관 NGS. 사용 9 ml의 PBTx 1 ml에 추가합니다. </li><li> 50 % 글리세롤 / PBS를 준비합니다. 배 PBS 100 % 글리세롤의 완전히 동일한 부분을 섞는다. 실온에서 보관하십시오. </li></ol> 2. 배아 고정 <ol><li> . (. 예를 들어, β - 굴지 : CAAX-GFP) 사육 구하는 야생형 (AB 및 WIK) 또는 형질 전환 자연 교배를 통해 배아. 원하는 경우 설명 된대로, 구조 또는 morpholinos와 배아를 주입. (15, 16) </li><li> . 배아 증액 배아 모아서 바와 같이 염색을 차단하기 위해 0.003 %, 1- 페닐 -2- 티오 우레아 (PTU)의 존재하에 28.5 ℃에서 배양한다. 17 </su<html> P&gt; </li><li> 배아가 원하는 발달 단계, 18에 도달하면. 수정, &#160; , MESAB를 이용하여 배아 마취 최대한 시스템의 물을 제거하고 신선한 3 4 % PFA / PBS를 추가 - RT에서 4 시간. 참고 : 20 시간 게시물 수정 (HPF)보다 적은 시간에, dechorionation하기 전에 수정합니다. HPF (20) 이후에 때때로, 해부 현미경 하에서 미세 점 두 쌍의 집게를 이용하여 고정하기 전에 dechorionate. </li><li> 솔루션을 변경. 넓은 구멍 피펫을 사용하여 배아로 이동 한 바와 같이.의 microcentrifuge 튜브 덮인 1.5 ml의 17 변경 솔루션, 단순히 배아가 원심 분리하지 않고 중력에 의해 정착 할 수 있도록하여. </li><li> 후 정착액 3 후 -. 4 시간, 최소 48 시간 동안 -20 ° C에서 100 % 메탄올 저장 교체, PFA / PBS를 제거합니다. 참고 : 최대 P-CaMK-II 면역를 들어, 일주일 총 메탄올 저장 시간을 제한 할 수 있습니다. </li></ol>&quot;&gt; 3. 면역 염색 항목의 태아 <ol><li> 출장 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서 각 실험 조건 10 배아의 최소 배치하고 레이블을 붙입니다. </li><li> 배아가 정착하도록 허용합니다. 메탄올을 제거하고 폐기하고 다음 단계에서 나타낸 바와 같이, 에탄올의 농도를 감소 0.5ml를 함유 프로그레시브 세척하여 재수. 각 단계는 락과 5 분 세척입니다. </li><li> 점진적이 5 솔루션 재수 : 66 % 에탄올 / 33 % PBTx, 33 % 에탄올 / PBTx은 100 % PBTx 100 % PBTx (이 PBTx 첫 반복이다), 100 % PBTx (이 두 번째 반복 인 66 % PBTx). </li><li> 마지막 PBTx 세척을 제거합니다. 0.5 ml의 10 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드러운 락과 실온에서 적어도 1 시간 동안 품어 후 제거 솔루션을 폐기합니다. </li><li> 10 % NGS / PBTx에 희석 차 항체 솔루션을 준비합니다. 공동 면역 염색 경우, 먼저 높은 친 화성 항체를 사용합니다. 500 : 본 연구를 위해, 1 희석 마우스 항 아세틸 튜 불린 단클론 항체로 배양한다. exampl에 대한즉, 10 개의 샘플이 10 % NGS / PBTx 3 ml의 스톡 항체 용액 6 ㎕를 결합하고,이 각 튜브에 0.3 ㎖에 분산이있는 경우. </li><li> 모든 배아를 체험하기 위해 각 튜브에 희석 차 항체 0.5 ml의 - 0.2을 추가합니다. 실온에서 부드럽게 흔들 O / N로 품어. </li><li> 아침에 제거하고 항체 용액을 버린다. 초과 일차 항체를 씻어 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 머리 위의 조명을 어둡게하고 각 조건이 적어도 0.5 ml에 포함되도록 10 % NGS / PBTx에서 적절한 형광 접합 된 이차 항체를 희석. (500) 희석 : 마우스 항 - 아세틸 화 튜 불린 차 항체로, 1에서 녹색 형광 염료 염소 항 - 마우스 IgG를 사용합니다. </li><li> 부드러운 어둠 속에서 RT에서 흔들 4 시간 동안 차 항체를 품어. 희미하게 불빛 아래 어두운 용기에 배양 또는 알루미늄 호일에 포장하여 샘플 프로세스, 지금부터. </li><li>인큐베이션의 끝에, 제거 차 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx 세탁에 추가. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 공동 면역 경우 제 차 항체보다는 다른 종으로부터 제 차 항체를 얻었다. 이 연구에서 붉은 형광 염료 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 이차 항체에 의해 토끼 항 - 포스 CaMK-II 항체를 따릅니다. </li><li> 토끼 항 - 포스 CaMK-II 항체 1:20 희석. 배아의 각 튜브를 들어, 다음, 0.3 ml의 10 % NGS / PBTx에 중단 주식 항체 용액 15 μl를 추가합니다. </li><li> 배아가 몰입과 조명이 희미하게되어 있는지 확인합니다. 어둠 속에서 실온에서 부드럽게 흔들 O / N로 품어. </li><li> 희미한 불빛 아래에서 아침에 제거하고 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 2 % NGS / PBTx를 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. </li><li> 희미한 간접 조명을 유지하고 적절한 형광 conju 충분히 희석문이 이차 항체 있도록 각 조건은 적어도 0.5 ml에 포함되어 있습니다. 500 10 % NGS / PBTx : 본 연구에서는 붉은 형광 염료 결합 염소 항 - 토끼 IgG를 이차 항체 (적색 채널) 1을 희석. </li><li> 부드러운 어둠 속에서 RT에서 흔들 4 시간 동안 제 2의 2 차 항체를 품어. </li><li> 이 배양 희미한 조명 아래 끝에서 제거 차 항체 용액을 버린다. 0.5 ml의 PBTx을 추가합니다. 부드럽게 5 분 동안 바위. 제거 및 솔루션을 폐기합니다. 두 번 반복합니다. 쇼핑몰 PBTx 50 % 글리세롤 / PBS 하나로 촬상 절차에 따라. </li></ol> 4. 공 촛점 이미징 및 처리 <ol><li> 마운트 이미징 배아. 유리 슬라이드에 5 배아 - 1을 배치합니다. 메인 커버 슬립 및 챔버의 각각의 측면 상에 커버 슬립 단편을 사용하여 슬라이드 사이에 챔버를 만든다. 일반적으로, 네 # 1 커버 슬립은 밀봉하지 않고 이러한 스페이서 스택을 만드는 데 사용됩니다. 참고 : 설치 매체가 필요하지 않습니다. </li><li> 100X 기름 침지를 사용하여목적은 전송 된 빛을 사용하여 초점 단일 배아를 가지고 있습니다. 빛을 끕니다. 공 초점 현미경을 켭니다. 적절한 레이저 (녹색 및 / 또는 적색) 켜져 있고 원격 포커스 악세사리가 종사을 확인합니다. </li><li> 공 초점 프로그램을 켭니다. 에서 &quot;획득 바,&quot;적절한 목표를 선택합니다. &quot;XY 기본&quot;줄에 1,024 버튼을 클릭하여 1,024에 이미지 크기를 설정합니다. </li><li> &quot;레이저 및 감지기&quot;줄에서 각 채널에 대한 레이저 및 검출기를 켭 빨간색 488 상자와 녹색 568 상자를 클릭합니다. 매체에 핀홀 설정하고 시각화하는 각 채널의 &quot;게인&quot;줄의 게인을 조정합니다. </li><li> &quot;취득 설정&quot;줄에서 이미지를 획득 시작 &quot;라이브&quot;를 클릭합니다. &quot;보기 설정&quot;줄에서 &quot;라이브&quot;창에서 가운데​​로 &quot;일체형 줌을 강제로&quot;상자를 선택 취소합니다. </li><li> &quot;설정 획득&quot;줄에서 &quot;Z&quot;탭에서, 이미지의 레이어를 통해 단계. 뉴를 선택한 후광학 섹션의 mber, 이미지에 통합 Z-평면의 &quot;중심&quot;의 어느 시점으로 이동합니다. </li><li> &quot;Z&quot;탭에서 작은 빨간 &quot;참조&quot;상자를 클릭합니다. 이 &quot;중앙&quot;으로서 선택 시점 RFA 영점 것이다. &quot;스텝 크기&quot;라고 표시된 상자에 (이상적입니다 μm의 μm의 0.25 내지 2.0) 층의 두께를 선택합니다. &quot;파일 크기&quot;상자에 주목하고 1GB로 제한하려고합니다. 주 : 일반적으로 0.5 내지 40 부까지의 광학 - 1.0 μm의 수득되지만, 섹션들의 수는 실험적으로 결정될 수있다. </li><li> 이미지의 상단 극단적 인을 찾으려면 &quot;최고&quot;옆에있는 원을 클릭하고 Z 층을 통해 이동합니다. 이제 다음 &quot;바닥&quot;에 동그라미를 누르면 컴퓨터는 중심으로 층으로 다시 이미지를 취할 것입니다. 다시 이미지의 하단 극단적 인을 찾기 위해 레이어를 통해 이동합니다. </li><li> 레이저를 중지 상자 &quot;취득 설정&quot;에서 다시 &quot;라이브&quot;를 클릭취득. 이 패널에서 빨간 평균 표시 박스와 Z-스택을 클릭합니다. 이 상자는 녹색으로 바뀝니다. </li><li> &quot;취득 설정&quot;상자에서 이미지의 전체 시리즈를 취득하는 &quot;싱글&quot;을 클릭합니다. 이 두 채널에서 전체 Z - 스택을 통해 검색과 같이 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 저장 볼륨 창을 클릭 클릭 &quot;다른 이름으로 저장&quot;및 파일 이름을 지정합니다. &quot;.ids&quot;파일로 저장합니다. 볼륨 Z-스택이 열려있는 동안, 파일을 렌더링 데이터 풀다운 메뉴에서 &quot;렌더링 볼륨&quot;을 클릭 선택합니다. TIFF 파일로 렌더링 된 파일을 저장합니다. 현재 문서는 인쇄물에 표시됩니다 투사 된 이미지입니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

PFA / 메탄올 방법은 제브라 피쉬 개발하는 동안 포스-T 287 -CaMK-II 에피토프의의 면역을 최적화의 주요 목적이 실험실에서 개발되었다. 이 방법은 성공적으로 제브라 피쉬의 KV, 14, 특히 KV 단계에서 신장. (13),이 기술이 필요했다 (12) 내이 등 여러 기관 섬모의 형성 동안 P-CaMK-II를 현지화. 이러한 방법의 성공으로 인해자가 형광의) 최소화, 포스 CaMK-II 에피토프 b) 보존 항체 에피토프 c) 향상된 접근성 조합 쉽다. 이 접근법의 주요 한계는 메탄올 저장 시간이다. P-CaMK-II의 면역 반응은 -20 ° C에서 메탄올 두 일 후 최대하지만,이 에피토프의 반응은 메탄올 저장 일주일 후 손실됩니다. 또한이 때 포스페이트 기가 HY인지 명확하지 않다drolyzed 또는 추가 변성은 그 면역 반응을 감소 발생합니다. -20 ° C에서 메탄올 / EGTA 초기 ...

여기에 설명된 기술은 수정, 위형성, 체세포 형성 및 몸통, 눈, 뇌 및 장기 형성을 포함하여 초기 발달 중에 발생하는 이벤트 동안 Ca2+ 신호의 다운스트림 대상을 정의하려는 연구의 결과입니다. 1-3 배아 Ca2+ 신호전달의 최초 발견은 aequorin4 및 fura-2와 같은 자연적이고 조작된 Ca2+ 지표의 사용에 의존했습니다. 5 현재의 기술로도 Ca2+의 과도 고도를 감지하려면 번거로운 분석 도구가 필요하며 이러한 Ca2+ 신호의 대상을 드러내지 않습니다. 
이 실험실은 중추 신경계에서 풍부하며 원래 장기 강화의 조절자로 확인된 효소인 CaMK-II로 알려진 Ca2+/칼모듈린 의존성(다기능) 단백질 키나아제를 통해 작용하는 Ca2+ 신호를 조사합니다. 6 CaMK-II는 뇌 특이적이지 않으며, 무척추 동물을 포함한 동물계 전역의 종과 종의 전체 수명과 신체에 걸쳐 널리 발현되고 고도로 보존됩니다. 7,8 CaMK-II는 Thr287에서 자가인산화 능력으로 인해 Ca2+ 수치가 감소한 후에도 자체 활성을 유지할 수 있는 고유한 능력을 가지고 있습니다. 이 자가인산화 상태에서 CaMK-II는 탈인산화될 때까지 Ca2+/CaM 독립적 방식으로 활성 상태를 유지합니다. 6 따라서, 인산화된 CaMK-II(Thr287)의 국소화는 자연스럽고 유의미한 Ca2+ 상승이 발생한 세포를 식별할 수 있습니다. 
자가인산화(P-Thr287) 포유류 CaMK-II에 대한 항체는 특성이 잘 규명되어 있으며 초기에는 뇌 조직에서 활성화된 CaMK-II를 국소화하는 데 사용되었습니다. 9 제브라피시(Danio rerio)는 7개의 CaMK-II 유전자10,11을 가지고 있으며, 이 유전자의 단백질 산물은 이 영역에서 MHRQE[pT287]VECLK 서열을 포함하고 있습니다. 10,11 이 염기서열은 이 토끼 다클론 항체를 생성하는 데 사용되는 인산펩티드 항원(MHRQE[pT]VDCLK; Upstate/Millipore)에 의해 확인되었기 때문에 이 항체가 제브라피시 CaMK-II와 교차 반응한 것은 전혀 놀라운 일이 아니었습니다. 이 실험실은 이 항체가 자가인산화 및 Ca2+/CaM 독립적 활성에 비례하여 제브라피시 CaMK-II와 반응한다는 것을 보여주었습니다. 12 추가적인 팬 특이적 CaMK-II 항체도 제브라피시 CaMK-II와 교차 반응하는 것으로 나타났습니다. 13세
이 항체는 제브라피시 CaMK-II가 좌우 비대칭을 확립하는 데 필요한 섬모 기관인 제브라피시 쿠퍼 소포(KV)의 한쪽 면에 있는 세포에서 우선적으로 활성화된다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 12 이 항체는 CaMK-II가 장기 위치가 결정되는 것과 정확히 동일한 발달 단계 동안 KV의 왼쪽에 있는 4개의 인접한 세포에서 일시적으로 활성화된다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 12 Kupffer's Vesicle(KV) 외에도 자가인산화(P-T287)는 신장, 신경마스트 및 내이를 포함한 다른 섬모 조직의 특정 세포 내 부위에도 위치했습니다. 12,13 제브라피시 신장에서 P-T287-CaMK-II는 섬모 관 세포의 정점 경계를 따라 그리고 배설 섬모 내에서 농축되어 그 조립에 영향을 미칩니다. 13 마지막으로, 발달 중인 내이에서 P-T287-CaMK-II는 섬모 기저부에 집중되어 있으며 Delta-Notch 신호 경로를 통해 세포 분화에 영향을 미칩니다. 14 요약하면, 활성화된 CaMK-II의 검출은 세포 내 Ca2+ 방출 부위를 정확히 찾아내고 잠재적인 새로운 신호 경로를 밝혔습니다.
이러한 발견은 활성화된(P-T287-자가인산화) CaMK-II를 국소화하기 위한 민감하고 정확한 방법 개발에 전적으로 의존했습니다. 제브라피시 KV, 신장 및 내이를 고정하고 면역 염색하는 방법에 대해 설명합니다. 이 기술의 한계에 대해서도 설명합니다. 이러한 기술은 초기 척추동물 발달 과정에서 인산-항원결정기뿐만 아니라 모든 항원결정기의 두 가지 형광 채널에서 고해상도 이미지를 얻으려는 모든 연구자에게 유용할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>1-페닐-2-티오우레아(PTU)</td><td>시그마</td><td>P-7629</td><td>0.12% 원액. 시스템 물에 1:40 희석</td></tr><tr><td>Alexa488 안티 마우스 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>염소 다클론성, 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 안티 토끼 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>염소 다클론성, 1:500</td></tr><tr><td>Alexa488 phalloidin</td><td>Life Technologies</td><td>A12379</td><td>F-actin</td></tr><tr><td>Alexa568 안티 마우스 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11004</td><td>에 우선적으로 결합염소 다클론성, 1:500</td></tr><tr><td>Alexa568 anti-rabbit IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11011</td><td>염소 다클론성, 1:500</td></tr><tr><td>anti-acetylated &#945;-tubulin</td><td>Sigma</td><td>T7451</td><td>Mouse monoclonal, 1:500</td></tr><tr><td>anti-phospho-T287 CaMK-II</td><td>EMD Millipore</td><td>06-881</td><td>Rabbit polyclonal, 1:20</td></tr><tr><td>anti-total CaMK-II</td><td>BD Biosciences에서 사용</td><td>611292</td><td>마우스 단클론, 1:20</td></tr><tr><td>에탄올</td>에서 사용 <td>Fisher</td><td>S96857</td><td>실험실 등급, 95% 변성</td></tr><tr><td>펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>VWR</td><td>16004-330</td><td>#1&nbsp; 두께</td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td>표준 유리 슬라이드</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher</td><td>A411</td><td>냉동실에 보관</td></tr><tr><td>마이크로 원심 분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td>뚜껑이 달린 튜브, 멸균되지 않음</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>16210-064</td><td>부분 표본 1ml 튜브, 냉동실에 보관</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma</td><td>P-6148</td><td>시약 등급, 결정질</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>품질 생물학</td><td>119-069-131</td><td>10x 재고 용액 또는 실험실에서 만든</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>BP-151</td><td>10% 용액을 물에 저장, RT</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Life Technologies</td><td>85113</td><td>10% 용액을 물에 저장, RT</td></tr><tr><td>복합 현미경</td><td>Nikon</td><td>E-600</td>에 <td>보관 무진동 테이블</td></tr><tr><td>C1 플러스 2레이저 스캐닝 컨포칼</td><td>Nikon</td><td>C1 Plus</td>에 장착 <td>EZ-C1 프로그램으로 실행되지만 업그레이드는 " 요소"</td></tr></tbody></table>

전체 마운트 zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

Immunostaining Phospho-epitopes in Ciliated Organs of Whole Mount Zebrafish Embryos

세포의 급속한 확산, 유전자의 조직 - 특이 적 발현 및 시그널링 네트워크의 출현은 모든 척추 동물의 초기 배아 발달의 특성. 심지어 하나의 셀 내에서 - - 반응 속도 및 신호의 위치 배아의 중요한 발달 유전자의 식별을 보완합니다. 면역 염색 기술이 차 섬모 작게 구조의 세포 내 및 전체 동물 신호의 동역학을 정의하기 위해 도시되었다는 것을 설명한다. 레이저 스캐닝 공 초점 복합 현미경을 사용하여 정착, 영상 및 이미지 처리 기술은 적은 36 시간 내에 완료 될 수있다. 제브라 피쉬 (다니오 레 리오)는 저렴하고 인간의 질병에 관련된 척추 동물 종에서 연구를 수행하고자 연구자를위한 바람직한 유기체이다. 유전자 녹아웃 또는 knockdowns는 실제 단백질 제품의 손실에 의해 확인되어야한다. 단백질 손실 이러한 확인여기에 설명 된 기술을 사용하여 달성 될 수있다. 신호 전달 경로에 대한 단서는 번역 후 인산화에 의해 변형 된 단백질과 반응하는 항체를 사용하여 해독 할 수 있습니다. 보존 및 에피토프의 인산화 상태를 최적화하는 것은이 결정하는 것이 중요하며,이 프로토콜에 의해 달성된다. 이 연구는 개발의 첫 72 시간 동안 배아를 해결하기 위해 기술을 설명 쿠퍼의 소포 (KV)의 섬모와 관련 항원의 다양한 신장과 내이 공동 현지화. 이러한 기술은 절개하지 않아도, 간단하고 비교적 짧은 시간에 완료 될 수있다. 하나의 이미지로 공 초점 이미지 스택을 투사하는 것은 이러한 데이터를 제시하는 유용한 수단이다.

포스 에피토프를 시각화하기위한 최적의 조건 제브라 피쉬 배아에서 단백질 항원 결정기의의 면역을 설명하는 방법은 현장 하이브리드의 mRNA를 통해 현지화에 대한에 비해 상대적으로 드문 드문 있었다. 제브라 피쉬 배아의 섬모 세포에서 단백질 에피토프를 로컬 라이즈에 사용되는 고정 제 4 % PFA / PBS 및 메탄올과 현장 하이브리드의 전체 마운트에 의해 RNA의 DMSO. 19 현지화 (WISH)의 혼합물이다 덴트의 정착을 포함했다 일반적으로 PFA를 사용하여 달성 100 % 메탄올에 저장 하였다. 20,21 우리의 연구는 두 내지 7 일 메탄올 시간을 제한 할 때 WISH 정착액 조합, P-CaMK-II 항체의 면역을위한 다른 정착에 크게 우수한 것을 알았다...

기술은 전체 제브라 피쉬 배아에서 포스 항원을 발현 사이 다음 주 섬모와 같은 작은 세포 구조에서 두 색 형광 공 초점 현지화를 수행 할 수 있도록 서술되어있다. 고정 및 이미징 기술은 위치 특정 단백질의 모양이나 활성화 동력학을 정의 할 수있다.

전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

The rapid proliferation of cells, the tissue-specific expression of genes and the emergence of signaling networks characterize early embryonic development ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 배아에서 활성화된 단백질의 면역 국소화를 확인하는 것입니다. 이 방법은 전체 배아 내에서 인산화된 단백질의 국소화 및 활성화와 같이 발생학 및 세포 생물학 분야의 핵심 질문에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칼슘에 의해 활성화된 단백질을 면역 염색함으로써 전체 배아에서 칼슘 의존성 신호 전달을 국소화할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 따라 야생형 또는 형질전환 배아를 확보한 후, 색소 침착을 차단하기 위해 시스템 워터에 0.003% PTU를 첨가하고 원하는 발달 단계까지 배양합니다. 배아가 적절한 단계에 도달하면, 물고기를 마취시키기 위해 디쉬에 MESAB를 첨가합니다. 물고기가 마취되면 시스템 워터를 가능한 한 많이 제거한 다음, 신선한 4% PFA와 PBS를 첨가하고 상온에서 3~4시간 동안 배양합니다.배양 후 PFA를 제거하고 100% methanol로 교체합니다. 그런 다음 배아를 -20 °C에서 최소 48시간 동안 보관합니다. 면역 염색을 수행하려면, 실험 조건당 최소 10개의 배아를 라벨이 부착된 1.5 mm 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다.배아가 튜브 바닥에 가라앉으면 메탄올을 제거하여 버리고, PBTx 내 에탄올 농도를 점진적으로 낮추어 세척함으로써 배아를 재수화합니다. 마지막 PBTx 세척액을 제거하고 10% normal goat serum 또는 PBTx 내 NGS 0.5 milliliters를 첨가합니다. 그 후, 완만하게 흔들어주며 상온에서 최소 1시간 동안 인큐베이션합니다.다음으로, 용액을 제거하고 1:5로 희석한 mouse anti-acetylated tubulin monoclonal antibody 0.2~0.5 mL와 10% NGS 및 PBTx를 첨가합니다. 배아를 상온에서 가볍게 흔들어주며 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 항체 용액을 제거하여 버리고, 2% NGS 및 PBTx 0.5 mL를 사용하여 5분씩 3회 가볍게 흔들어 세척합니다.천장 조명을 낮추고 10% NGS 및 PBTx에 1:500으로 희석한 형광 표지 2차 항체 500 microliters를 각 샘플에 첨가합니다. 실온의 암소에서 부드럽게 흔들어주며 4시간 동안 배양합니다. 배양 후, 배아를 3회 세척합니다.공동 면역 염색을 위해, anti-phospho CaMKII 항체를 1:20으로 희석하여 첨가합니다. 부드럽게 흔들어주며 암실에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 아침, 2% NGS와 PBTx로 배아를 3회 세척한 후, red 568 형광 결합 goat anti-rabbit IgG를 1:5으로 희석하여 10% NGS 및 PBTx와 함께 첨가합니다.상온의 암소에서 4시간 동안 배양한 후, 배아를 3회 세척하고 이미징 절차에 따라 PBTx 또는 PBS 내 50% glycerol에 보관하십시오. 이미징을 위해 배아를 마운팅하려면, 슬라이드 글라스 위에 배아를 1~5개 배치하십시오. 물고기 양쪽에 1번 커버슬립 조각 4개를 쌓아 챔버를 만드십시오.그 위에 커버 슬립을 덮습니다. 100X 유침 렌즈와 투과광을 사용하여 단일 배아의 초점을 맞춥니다. 조명을 끕니다.적절한 레이저를 사용하여 공초점 현미경의 전원을 켜고 원격 초점을 설정합니다. 공초점 프로그램의 획득(acquire) 바에서 적절한 대물렌즈를 선택합니다. 그런 다음, XY 기본(basic) 바에서 1024 버튼을 클릭하여 이미지 크기를 설정합니다.레이저 및 검출기 바에서 빨간색 488 및 녹색 568 상자를 클릭하여 각 채널의 레이저 검출기를 켜고 핀홀을 medium으로 설정합니다. 그런 다음, 게인 바에서 각 채널의 게인을 조절하여 시각화합니다. 다음으로, 획득 설정 바에서 live를 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다.보기 설정 표시줄에서 force integral zoom 확인란의 선택을 해제하여 라이브 창의 중앙을 맞춥니다. 획득 설정 표시줄의 Z 탭에서 이미지의 레이어를 단계별로 확인합니다. 이미지에 포함할 레이어 수를 선택한 후, Z 평면의 중앙 지점으로 이동합니다.Z 탭에서 작은 빨간색 참조 상자를 클릭하십시오. 이렇게 하면 선택한 중심점에서 RFA가 0으로 설정됩니다. step size라고 표시된 상자에서 층의 두께를 선택하십시오.파일 크기 상자에 주의하며 파일 용량을 1GB 이내로 제한하십시오. 이미지의 최상단 끝부분을 찾으려면 top 옆의 원을 클릭하고 Z 레이어를 이동하십시오. 이제 bottom 옆의 원을 클릭하면 컴퓨터가 이미지를 중앙 레이어로 되돌립니다.그런 다음, 획득 설정 상자에서 다시 live를 클릭하여 레이저 획득을 중지합니다. 이 패널에서 average 및 Z stack이라고 표시된 빨간색 상자를 클릭합니다. 해당 상자들이 녹색으로 바뀝니다.획득 설정 상자에서 single을 클릭하여 이미지 시리즈 전체를 획득합니다. 두 채널과 전체 Z 스택을 스캔하는 동안 진행 상황을 모니터링하십시오. 저장하려면 볼륨 창을 클릭하고 save as를 클릭한 후 파일 이름을 지정합니다.Z 스택이 열려 있는 동안, 데이터 드롭다운 메뉴를 선택하고 volume render를 클릭하여 파일의 볼륨 렌더링을 수행합니다. 렌더링된 파일을 dot tif 파일로 저장하십시오. 이 그림은 제브라피시의 쿠퍼 소포(Kuppfer's vesicle 또는 KV) 내 섬모의 표준 마커인 P-CaMKII와 아세틸화 튜불린(acetylated tubulin)의 면역염색 결과를 보여줍니다. 운동성 일차 섬모는 유체의 원형 흐름을 생성하며, 이는 KV를 둘러싼 섬모 세포 내 칼슘 농도의 상승과 여기서 보이는 것과 같이 특정 위치에서의 CaMKII 활성화를 유도합니다.이 그림들은 수정 후 24시간에서 72시간(HPF) 사이, 신주위관의 특정 영역을 내벽하고 있는 섬모 세포의 정단면에서 나타나는 P-CaMKII를 보여줍니다. 발달 1일 차에 PFA와 메탄올로 고정된 제브라피시 배아 귀는 그 구조를 유지하며, 운동섬모의 기저부와 길이를 따라 CaMKII 염색을 검출할 수 있게 합니다. 72 HPF에서 내이는 Alexa 488 phalloidin 및 Alexa 568이 결합된 anti-acetylated tubulin으로 대조 염색되었습니다.PFA 메탄올 고정은 F-actin과 tubulin 모두를 보존했습니다. 이 30 HPF 물고기는 막 표적 GFP를 발현하고 있었으며, 이는 메탄올 고정 시 소실되었을 것입니다. PFA 고정은 PFA와 메탄올을 함께 사용한 고정과 비교하여 P-CaMKII 신호가 감소하는 결과를 나타냈습니다.하지만 발달의 이 단계에서는 메탄올 없이도 신호를 검출할 수 있을 만큼 충분히 강합니다. 이 기술을 숙달하면 적절히 수행했을 때 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때는 신선한 배아와 신선한 유리제를 사용하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 영상을 시청한 후, 제브라피쉬 배아에서 인산화 단백질을 국소화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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해부 Zebrafish 배아 심장의 Immunostaining

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