전체 마운트 Zebrafish의 태아의 섬모 기관에서 면역 염색 포스 - 항원 결정기

이 절차의 전반적인 목표는 제브라피시 배아에서 활성화되는 단백질을 면역국소화하는 것입니다. 이 방법은 전체 배아에서 인산화된 단백질의 국소화 및 활성화와 같은 발달 및 세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 칼슘에 의해 활성화된 단백질을 면역 염색하여 전체 배아에서 칼슘 의존성 신호를 국소화할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 따라 야생형 또는 형질전환 배아를 얻은 후 시스템 용수의 배아에 0.003%PTU를 첨가하여 색소 침착을 차단하고 원하는 발달 단계로 배양합니다. 배아가 올바른 단계에 도달하면 MESAB를 접시에 추가하여 물고기를 마취합니다. 물고기가 마취되면 가능한 한 많은 시스템 물을 제거한 다음 신선한 4% PFA 및 PBS를 추가하고 실온에서 3-4시간 동안 배양합니다.

배양 후 PFA를 제거하고 100% 메탄올을 사용하여 교체하십시오. 그런 다음 배아를 섭씨 영하 20도에서 최소 48시간 동안 보관합니다. 면역염색을 수행하려면 각 실험 조건에 대해 최소 10개의 배아를 표지된 1.5mm 마이크로 원심분리 튜브에 배치합니다.

배아가 튜브 바닥에 가라앉으면 메탄올을 제거하고 버리고 PBTx에서 에탄올 농도가 감소하는 점진적 세척을 사용하여 배아를 다시 수화합니다. 마지막 PBTx 세척을 제거하고 PBTx에 10% 일반 염소 혈청 또는 NGS 0.5ml를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 최소 1시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.

다음으로, 용액을 제거하고 0.2-0.5 밀리리터의 1 in 5 희석액 마우스 항 아세틸화 튜불린 단클론 항체와 10% NGS 및 PBTx를 추가합니다.밤새 실온에서 부드럽게 흔들면서 배아를 배양합니다. 아침에는 항체를 제거하고 버리고 0.5ml의 2%NGS와 PBTx를 각각 5분씩 부드럽게 흔들어 3회 세척합니다.

오버헤드 조명을 어둡게 하고 10%NGS 및 PBTx에서 형광 접합 2차 항체의 1/500 희석액의 각 샘플에 500마이크로리터를 추가합니다. 실온의 어두운 곳에서 4시간 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다. 배양 후에는 배아를 세 번 씻습니다.

동시 면역염색을 위해 1/20 희석된 항인산 CaMKII 항체를 추가합니다. 밤새 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 부화하십시오. 다음날 아침, 2%NGS와 PBTx로 배아를 3회 세척한 후, 적색 568 형광 접합 염소 항토끼 IgG와 10% NGS 및 PBTx를 1/5 희석합니다.

실온에서 4시간 동안 어두운 곳에서 배양한 후 배아를 3회 세척하고 이미징 절차에 따라 PBTx 또는 50% 글리세롤에 PBS에 보관합니다. 이미징을 위해 배아를 장착하려면 1개에서 5개의 배아를 유리 슬라이드에 놓습니다. 물고기의 양쪽에 4개의 1번 스택 커버 슬립 조각을 사용하여 방을 만듭니다.

그리고 그 위에 커버 슬립을 놓습니다. 100X 오일 이멀젼 렌즈와 투과광을 통해 단일 배아에 초점을 맞출 수 있습니다. 불을 끕니다.

적절한 레이저로 컨포칼 현미경을 켜고 원격 초점을 맞춥니다. 컨포칼 프로그램을 열고 획득 막대에서 적절한 대물렌즈를 선택합니다. 그런 다음 XY 기본 막대에서 1024 버튼을 클릭하여 이미지 크기를 설정합니다.

레이저 및 검출기 막대에서 빨간색 488 및 녹색 568 상자를 클릭하여 각 채널의 레이저 검출기를 켜고 핀홀을 중간으로 설정합니다. 그런 다음 게인 바에서 각 채널의 게인을 조정하여 시각화합니다. 그런 다음 획득 설정 표시줄에서 라이브를 클릭하여 이미지 획득을 시작합니다.

보기 설정 표시줄에서 강제 통합 줌 상자를 라이브 창의 중앙으로 선택 취소합니다. Z 탭 아래의 획득 설정 표시줄에서 이미지의 레이어를 단계별로 실행합니다. 이미지에 통합할 레이어 수를 선택한 후 Z 평면의 중심에 있는 특정 지점으로 이동합니다.

Z 탭에서 작은 빨간색 참조 상자를 클릭합니다. 이렇게 하면 중심으로 선택한 지점에서 RFA가 0이 됩니다. 단계 크기라고 표시된 상자에서 레이어의 두께를 선택합니다.

파일 크기 상자에주의를 기울이고 파일을 1GB로 제한하십시오. 이미지의 맨 위 끝을 찾으려면 위 옆에 있는 원을 클릭하고 Z 레이어 사이를 이동합니다. 이제 하단 옆에 있는 원을 클릭하면 컴퓨터가 이미지를 레이어의 중앙으로 다시 가져옵니다.

그런 다음 획득 설정 상자에서 라이브를 다시 클릭하여 레이저 획득을 중지합니다. 이 패널에서 average 및 Z stack이라고 표시된 빨간색 상자를 클릭합니다. 이 상자는 녹색으로 바뀝니다.

Acquire settings(설정 획득) 상자에서 single(단일)을 클릭하여 전체 이미지 시리즈를 획득합니다. 두 채널과 전체 Z 스택을 스캔할 때 진행 상황을 모니터링합니다. 저장하려면 볼륨 창을 클릭하고 다른 이름으로 저장을 클릭하고 파일 이름을 지정합니다.

파일을 볼륨 렌더하려면 Z 스택이 열려 있는 동안 데이터 풀다운 메뉴를 선택하고 볼륨 렌더를 클릭합니다. 렌더링된 파일을 dot tif 파일로 저장합니다. 이 그림은 P-CaMKII 및 아세틸화 튜불린에 대한 면역 염색을 보여주며, 이는 제브라피시 Kuppfer's vesicle 또는 KV의 섬모에 대한 표준 마커입니다. 원발성 섬모에 영양을 공급하면 액체의 순환 흐름이 생성되며, 이는 KV를 둘러싸고 있는 섬모 세포에서 칼슘의 상승과 여기에서 볼 수 있듯이 개별 위치에서 CaMKII의 활성화로 이어집니다.

이 그림은 수정 후 24시간에서 72시간 사이에 회음부 또는 HPF의 특정 영역을 내벽으로 하는 섬모 세포의 정점 표면에 나타나는 P-CaMKII를 보여줍니다. 발달 하루 만에 PFA와 메탄올로 고정된 제브라피시 배아 귀는 구조를 유지하고 기저부와 키노실럼의 길이를 따라 CaMKII 염색을 감지할 수 있습니다. 72 HPF에서 내이는 Alexa 488 팔로이딘으로, 항아세틸화 튜불린은 Alexa 568로 대조 염색되었습니다.

PFA 메탄올 고정은 F-actin과 tubulin을 모두 보존했습니다. 이 30 HPF 물고기는 메탄올 고정으로 손실되는 멤브레인 표적 GFP를 발현했습니다. PFA 고정은 PFA 및 메탄올로 고정하는 것에 비해 P-CaMKII 신호가 감소했습니다.

그러나 이 개발 단계에서 신호는 메탄올 없이 감지할 수 있을 만큼 충분히 강합니다. 이 기술을 숙달하면 제대로 수행하면 이틀 안에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 새로운 배아와 새로운 자유 계약 선수를 사용하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 비디오를 시청한 후에는 제브라피시 배아에서 인단백질을 국소화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.