구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

본 실험의 전반적인 목적은 전반사(total internal reflection), 구조광 조명(structured illumination) 이미징 또는 turf sim을 통한 영상 획득 후, 이미지 상관 분광법(image correlation spectroscopy)을 통해 피질 액틴(cortical actin)의 역학을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 면역 시냅스(immunological synapse)에서의 상호작용 조절에 피질 액틴 흐름이 어떤 역할을 하는지와 같은 생물물리학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 나노미터 수준의 해상도와 생체 내 호환성을 결합하여, 기존의 일반적인 현미경 기술에 비해 더 작은 규모의 프로세스를 관찰하고 분석할 수 있다는 점입니다.

이 기술의 시연은 저희 연구실의 박사 과정 학생인 George Ashdown이 진행하겠습니다. 테스트 샘플을 위해, 직경 100 nm의 회절 한계 이하 형광 미세구체(sub diffraction fluorescent microsphere) 스톡 용액 5 µL를 코팅되지 않은 새 커버슬립 표면에 첨가하십시오. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 커버슬립 전체에 미세구체 용액을 넓게 펴 바르고 건조시키십시오.

이미징 준비를 위해 테스트 커버슬립에 200 µL의 마운팅 용액을 추가합니다. Turf SIM 시스템의 스테이지 히터를 위한 인큐베이터 전원을 켜고, 가열 소자의 바닥면이 완전히 잠기도록 증류수로 저장조를 채웁니다. 물의 온도가 37 °C가 될 때까지 평형을 유지합니다. 가열 칼라를 대물렌즈에 연결하고 온도를 37 °C로 설정합니다.

그 다음, 올바른 광경로가 설정되었는지 확인하기 위해 turf 4 88 호환 그라데이션 블록을 현미경의 광로에 고정하십시오. 레이저 베드의 채널 모드를 단일(single) 위치로 전환하십시오. 현미경 스테이지에 있는 광섬유 케이블에 대해서도 동일한 작업을 반복하십시오.

이 단계를 수행하지 않으면 소프트웨어 창에 오류가 발생할 수 있습니다. 모드를 설정한 후 대물렌즈를 가장 낮은 Z 평면으로 내리고 그 위에 오일 한 방울을 떨어뜨리십시오. 형광 미세구체가 있는 테스트 샘플 커버 슬립을 현미경 스테이지 위에 놓으십시오.

그 다음 현미경 본체에서 퍼펙트 포커스 시스템(perfect focus system) 또는 PFS 기능을 선택합니다. 대물렌즈를 Z 평면 방향으로 서서히 이동시키다가 PFS 버튼의 깜박임이 멈추면 정지시키십시오. 이는 제어 소프트웨어상에서 초점 평면에 도달했음을 나타냅니다. 라이브 뷰(live view)로 전환하여 화면에서 마이크로스피어(microspheres)를 관찰합니다.

PFS 마이크로 조작 휠을 사용하여 초점을 미세하게 조정하십시오. 75 nm 파장 이상의 초점 외 형광 방출이 없는 균일한 조명을 확인하십시오. 마지막으로, 형광 미세구체 샘플에서 변동되는 조명 패턴이 관찰되는지 확인하여 구조광 조명이 달성되었는지 확인하십시오. T-세포 자극을 위해 8개의 챔버를 준비하십시오.

커버슬립에 200 µL의 anti CD3 및 anti CD28 항체 혼합물을 넣고 37 °C에서 2시간 동안 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 커버슬립을 세척한 후, 이를 현미경 스테이지 위에 놓고 표면의 초점 평면을 찾습니다. 다음으로, 형질전환된 T 세포 200 µL를 커버슬립의 웰 중 하나에 조심스럽게 피펫팅하여 넣습니다.

에피 형광 현미경을 사용하여 커버슬립에 부착되는 GFP actin 형질전환 세포를 추적합니다. 세포가 완전히 가라앉으면 N SimPad를 사용하여 라이브 모드로 전환하고, 모니터상의 세포가 초점에 맞았는지 확인합니다. 타임코스를 기록하려면 ND 획득 창을 열고 time 탭을 선택하십시오.

그런 다음 add를 클릭하고 간격을 no delay로 설정하십시오. 지속 시간은 10분으로 설정합니다. 마지막으로, ND 획득 창에서 Run now를 선택하여 데이터 기록을 시작하십시오.

이미지를 재구성하려면 먼저 적절한 분석 모듈이 포함된 분석 소프트웨어를 엽니다. Applications를 클릭한 다음 show end sim window를 선택하십시오. illumination modulation contrast와 high resolution noise suppression을 1로 설정하고, 이미지 상태 표시줄에서 turf SIM 데이터 세트를 재구성하여 완전한 SIM 이미지를 생성하십시오.

픽셀 크기가 30 nanometers인지 확인한 후, 스틱 분석을 위해 데이터를 TIF 파일로 내보냅니다. sticks MATLAB 소프트웨어 패키지를 다운로드하고 압축을 푼 다음, 스크립트를 엽니다. 그다음, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 부동 제거 필터(immobile removal filter)에 대한 입력 매개변수를 정의합니다.

23행에서 필터링 파라미터를 이동 평균(moving average)으로 설정하고, 24행에서 이동 평균 파라미터 값을 21로 사용하여 하나의 벡터 맵을 생성합니다. 31행의 시간적 하위 영역(temporal subregion)을 이 경우의 최대 프레임 수인 63으로 설정하십시오. 그런 다음 32행에서 시간적 이동(temporal shift) 값을 설정하고, 33행부터 35행까지 동일하게 1로 설정합니다.

출력 파일의 이름, 출력 벡터 맵의 제목 및 출력 디렉터리 경로를 입력하십시오. 그런 다음 벡터 맵 이미지를 저장할 형식을 정의하십시오. 이 경우에는 png입니다.

MATLAB 편집기 창에서 스크립트를 엽니다. 스크립트의 1행부터 23행까지 실행하여 run one channel sticks를 수행하고 이미지 시리즈를 로드합니다. 다음으로 run one channel sticks의 29행부터 35행까지 실행합니다.

스틱 분석을 시작하려면 프롬프트를 따라 원하는 경우 폴리곤을 선택하여 관심 영역(ROI)을 정의하십시오. 벡터 맵을 표시하려면 38행부터 52행까지 실행하십시오. 그런 다음 53행부터 72행까지 실행하여 속도 크기 히스토그램을 도식화하십시오. 여기에 표시된 것은 turf sim 프로토콜로 이미징한 GFP 표지 F-actin을 발현하는 OT T-세포입니다.

면역 시냅스 형성을 자극하기 위해 anti CD3 및 anti CD28 항체가 코팅된 커버 슬립 위에 이 세포를 도포하고 5분 후에 텍스트에서 논의되었습니다. f actin의 분자 흐름을 시각화하기 위해 시계열 영상을 촬영하였습니다. 이 데이터를 sticks 프로그램으로 후속 분석하여, 왼쪽 세포의 상자 표시된 영역(시냅스 주변부의 일부)에 해당하는 이 벡터 맵에 나타난 바와 같이 F actin의 분자 흐름을 정량화할 수 있었습니다.

이 지도와 T세포 하위 영역을 추가로 확대하면 액틴 흐름의 방향성과 속도를 명확히 알 수 있으며, 이는 색상 코드뿐만 아니라 벡터 길이를 통해 결정할 수 있습니다. 속도 데이터는 히스토그램으로 작성하여 통계 분석이 가능합니다. 종합적으로, 이러한 결과는 면역 시냅스에서 F actin이 주변부에서 세포 중심을 향해 대칭적으로 흐른다는 것을 보여줍니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 이미지 상관 분광법을 사용하여 ts 데이터를 획득하고 피질 액틴 역학을 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이 방법은 T세포 이동 중의 액틴 흐름에 대한 통찰력을 얻는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 이동과 같이 분자 흐름이 중요하다고 생각되는 다른 시스템에서도 활용될 수 있습니다.