2015년 12월 17일
T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.
이 실험의 전반적인 목표는 전반사, 구조화 조명 이미징 또는 잔디 시뮬레이션에 의한 획득 후 이미지 상관 분광법으로 피질 액틴의 역학을 정량화하는 것입니다. 이 방법은 면역학적 시냅스에서 상호 작용을 조절하는 데 피질 액틴 흐름이 어떤 역할을 하는지와 같은 생물물리학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 나노미터 규모의 해상도와 라이프스타일 호환성을 결합하여 기존의 인스턴스 현미경 기술에 비해 소규모 프로세스를 관찰하고 분석할 수 있다는 것입니다.
이 기술을 시연하는 사람은 제 연구실의 박사 과정 학생인 George Ashdown입니다. 테스트 샘플의 경우, 코팅되지 않은 새 커버 슬립 표면에 직경 100나노미터 미만의 sub diffraction 형광 마이크로스피어 스톡 용액 5마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 마이크로스피어 용액을 커버 위에 펴고 피펫 팁으로 밀어 넣고 건조시킵니다.
이미징을 시작할 준비를 하기 위해 테스트 커버 슬립에 200마이크로리터의 장착 매체를 추가하고, 스테이지 용 인큐베이터를 켜고, 잔디 SIM 시스템의 히터를 켜고, 저장소에서 증류수를 채워 발열체 바닥을 완전히 덮습니다. 물이 섭씨 37도로 평형을 이루도록 합니다. 히팅 칼라를 대물렌즈에 연결하고 섭씨 37도로 설정합니다.
그런 다음 현미경의 광 경로에 잔디 4 88 호환 등급 블록을 고정하여 올바른 광학 경로가 맞물렸는지 확인합니다. 레이저 베드의 채널 모드를 단일 위치로 전환합니다. 현미경 스테이지의 광섬유 케이블에 대해 이 작업을 반복합니다.
이러한 단계를 수행하지 않으면 소프트웨어 창에 오류가 표시될 수 있습니다. 모드를 설정하면 목표를 가장 낮은 Z 평면으로 낮추고 그 위에 기름 한 방울을 떨어뜨립니다. 테스트 샘플 커버 슬립을 형광 마이크로스피어와 함께 현미경 스테이지에 놓습니다.
그런 다음 현미경 본체에서 완벽한 초점 시스템 또는 PFS 기능을 선택합니다. Z 평면을 통해 대물렌즈를 점차적으로 위로 이동하고 PFS 버튼이 깜박임을 멈추면 멈추면 멈추는데, 이는 제어 소프트웨어에서 초점면에 도달했음을 나타냅니다. 라이브 뷰로 전환하여 화면의 마이크로스피어를 이미지화합니다.
PFS 마이크로 매니퓰레이터 휠을 사용하여 초점을 미세 조정합니다. 75나노미터 향파 이상에서 초점을 벗어난 형광등 제출 없이 균일한 조명을 관찰합니다. 마지막으로, T 세포 자극이 8의 챔버에 대처하기 위해 형광 마이크로스피어 샘플에서 변동하는 조명 패턴을 관찰하여 구조화된 조명이 달성되었는지 확인합니다.
200 마이크로 리터의 안티 CD 3 및 안티 CD 28 항체 혼합물로 슬립을 덮고 섭씨 37도에서 2 시간 동안 커버 슬립을 배양합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 커버 슬립을 세척한 후 현미경에 놓습니다.tage 그런 다음 잔디 초점면을 찾습니다. 다음으로, 200마이크로리터의 형질주입된 T 세포를 커버 슬립의 웰 중 하나에 부드럽게 피펫팅합니다.
epi fluorescence를 사용하여 커버 슬립에 착륙하는 GFP 액틴 형질 주입 세포를 추적합니다. 셀이 안정되면 N SimPad를 사용하여 라이브 모드로 변경하고 모니터의 셀에 초점이 맞춰져 있는지 확인합니다. 시간 경과를 기록하려면 ND 수집 창을 열고 시간 탭을 선택합니다.
그런 다음 추가를 클릭하고 간격을 지연 없음으로 설정합니다. 지속 시간을 10분으로 설정합니다. 마지막으로, ND 수집 창에서 지금 실행을 선택하여 데이터 기록을 시작합니다.
이미지를 복원하려면 먼저 올바른 분석 모듈이 포함된 분석 소프트웨어를 엽니다. 응용 프로그램을 클릭한 다음 show end sim 창을 선택합니다. 조명 모듈레이션 대비 및 고해상도 노이즈 억제를 1로 설정하고 잔디 SIM 데이터 세트를 재구성하여 이미지 상태 표시줄에서 완전한 SIM 이미지를 생성합니다.
픽셀 크기가 30나노미터인지 확인한 다음 스틱 분석을 위해 데이터를 TIF 파일로 내보냅니다. sticks MATLAB 소프트웨어 패키지를 다운로드하고 압축을 푼 후 스크립트를 엽니다. 그런 다음 immobile 제거 필터에 대한 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 입력 파라미터를 정의합니다.
23행에서 필터링 매개변수를 이동 평균으로 설정하고 24행에서 21을 이동 평균 매개변수로 사용하여 하나의 벡터 맵을 생성합니다. 31행의 시간 하위 영역을 최대 프레임 수(이 경우 63)로 설정합니다. 그런 다음 32행에서 33행에서 35행까지 시간 이동을 하나로 설정합니다.
출력 파일의 이름, 출력 벡터 맵의 제목 및 출력 디렉토리 경로를 입력합니다. 그런 다음 벡터 맵 이미지를 저장해야 하는 형식을 정의합니다. 이 경우 png입니다.
MATLAB 편집기 창에서 스크립트를 엽니다. 하나의 채널 스틱을 실행하고 스크립트의 1행에서 23행까지 실행하여 이미지 시리즈를 로드합니다. 다음 런 1 채널의 29행에서 35행은 고정됩니다.
스틱 분석을 시작하려면 프롬프트에 따라 원하는 경우 관심 영역 또는 ROI를 정의할 폴리곤을 선택합니다. 벡터 맵을 표시하려면 38행부터 52행까지 실행하십시오. 그런 다음 53행에서 72행까지 실행하여 여기에 표시된 속도 크기 히스토그램을 플롯하면 Turf sim 프로토콜로 이미지화된 F 액틴으로 표시된 GFP를 발현하는 OT T 세포가 있습니다.
본문에서 논의된 바와 같이, 이 세포가 면역학적 시냅스의 형성을 자극하기 위한 항 CD 3 및 항 CD 28 항체로 코팅된 커버 슬립에 삽입된 후 5분 후였습니다. f actin의 분자 흐름을 시각화 할 수 있도록 시간 과정을 수행했습니다. 이 스틱 프로그램을 사용하여 이러한 데이터를 후속 분석하면 시냅스 주변부의 일부를 나타내는 왼쪽 세포의 상자 영역에 해당하는 이 벡터 맵에 표시된 대로 F 액틴 분자 흐름을 정량화할 수 있었습니다.
이 지도와 T-cell 하위 영역을 추가로 확대하면 액틴 유동 방향성과 속도가 명확해지며, 이는 벡터 길이와 색상 코드로 결정할 수 있으며, 속도 데이터는 통계 분석을 위해 히스토그램에 표시할 수도 있습니다. 총체적으로, 이러한 결과는 면역학적 시냅스에서 F가 주변부에서 세포 중심을 향해 대칭적으로 흐른다는 것을 보여줍니다. 이 비디오를 시청한 후에는 이미지 상관 분광법을 사용하여 데이터에서 ts를 획득하고 피질 액틴 역학을 분석하는 방법에 대해 잘 알게 되었을 것입니다.
이 방법은 T 세포 이동 중 액틴 흐름에 대한 통찰력을 얻는 데 사용할 수 있지만, 세포 이동과 같이 분자 흐름이 중요하다고 생각되는 다른 시스템에서도 사용할 수 있습니다.
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이 연구는 고급 이미징 기술을 사용하여 T 세포 면역 시냅스에서 피질 액틴의 동역학을 조사합니다. 생체 셀 초고해상도 이미징 및 총 내부 반사형 형광을 사용하여 필라멘터스-액틴의 흐름 속도와 방향성을 정량화합니다.
Quantifying cortical actin flow at the immunological synapse provides mechanistic insight into T cell activation, a critical process in immune response modulation. This capability supports target validation by linking cytoskeletal dynamics to receptor signaling outcomes, enabling de-risking of immunomodulatory drug candidates. The method enhances predictive confidence in early discovery by delivering quantitative, sub-diffraction resolution data on protein flow dynamics relevant to synapse formation and stability.
The method integrates into early discovery workflows by providing quantitative imaging readouts that bridge molecular dynamics to functional immune responses, supporting progression from target engagement to phenotypic screening.