Name: 단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 학습하세요 HepG2 세포주에서 FISH를 이용한 단일 핵 수준 LINE-1 레트로트랜스포지션 분석 방법. 이 기술은 정확한 레트로트랜스포지션 비율 측정과 유전체 안정성 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 미국 국립환경보건과학연구소(National Institute of Environmental Health Sciences, ES014443 및 ES017274)와 아스트라제네카(AstraZeneca)의 KSR 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

주 : 달리 명시되지 않는 한 모든 단계는 실온에서 수행한다. 개별 시약을 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 시약 섹션을 참조하십시오. 1. 레이블 L1 프로브 참고 : 프로브는 화학 물질 또는 PCR 라벨로 표시 할 수 있습니다. <ol><li> 화학 표시 <ol><li> 에티 디움 브로마이드 (0.5 μg의 / ㎖)를 추가 한 후 용융 할 때까지 전자 레인지에 트리스 - 아세테이트 - EDTA (TAE) 버퍼, 열에서 0.7-1 % 아가로 오스 겔을 겔 냉각 할 수 있도록합니다. 젤 트레이에 붓고 빗을 추가하고 젤은 실온에서 응고 할 수 있습니다. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 1 시간 동안 37 ° C에서 CY3 또는 FITC와 SNeo 프로브 (1-2 μg의)를 레이블. 참고 : SNeo는 S는 레트로 트랜스의 전체 사이클 이후 표현 네오 마이신 유전자를 pliced이다. 프로브의 크기는 1000 ~ BP이다. SNeo는 PCR 어떤 벡터 또는 genom에서 증폭 될 수있다IC에서 DNA. 스트렙 타비 딘 - CY3 / FITC 표지 시약에 대한 자세한 내용은 재료 및 시약의 표를 참조하십시오. </li><li> 각 웰에 1 배의 DNA 로딩 버퍼, 부하 표지 SNeo 프로브 솔루션을 혼합하고 15 ~ 20 분 동안 75 ~ 100 볼트에서 실행합니다. </li><li> 울트라 바이올렛 (UV) 조명기를 사용하여 검사 밴드를 시각화. SNeo 프로브의 크기가 조절 될 수 있고 잠금 핵 산 (LNA)도 (도 2)를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 컷 용해하고 제조자의 프로토콜에 따라 PCR 클린 - 업 키트를 사용하여 겔로부터 SNeo 프로브를 정제 클린 블레이드 겔로부터 SNeo 프로브를 표지. 주의 : 커버 보호 방패 (즉, 실험실 코트와 UV 맑은 얼굴 마스크)와 함께 신체의 모든 노출 부분보기 및 젤을 절단 할 때. PCR 제품을 정화 젤에 정보 소재의 테이블과 시약을 참조하십시오. </li><li> 다시 실행 SNeo 5 μL은 0.7 % 아가로 오스 겔에 미 표지 SNeo 프로브와 프로브를 표시 사기 위해 (1.1.1 참조)기업 규모의 증가와 신호 강도의 감소 (도 2). </li><li> 클레아 자유 H 2 O. 260 nm에서 흡광도를 측정하여 SNeo 표지 프로브의 양을 정량화 10 NG로 SNeo 프로브 희석 / μL 분취 -20 ° C에서 보관 씩. </li></ol></li><li> PCR 라벨 (프로브 라벨에 대한 대체 방법) <ol><li> SNeo 특정 프라이머를 결합 (5&#39;-ggatagcattgggagatatacct-3 &#39;와 5&#39;-attgaacaagatg gattgcacgc-3&#39;) 하나의 튜브에 PCR 시약 : 13.6 μL 클레아 무료 H 2 O; 0.1 μL dATP를,의 dCTP, dGTP의 (10 ㎚); 0.05 μL dTTP를 (10 ㎚); 0.05 μL의 dUTP를 비오틴 / dUTP를-FITC / CY3 (10 ㎚); 4 μL 버퍼 5 배 태그를 이동; 0.4 μL는 태그 중합 효소를 이동; 1 μL SNeo 템플릿 (10 NG). PCR 시약에 대한 자세한 내용은 재료 및 시약의 표를 참조하십시오. </li><li> 샘플의 총 수를 곱하여 각 시약의 양을 조정한다. </li><li> 다음 PCR 사이클 매개 변수를 사용하여들 증폭 및 레이블 SNeo 프로브합니다 : 2 분 95 ° C; 30 초, 30 초 동안 62 ° C, 60 초, 72 ° C, 95 ° C의 35주기; 2 분 72 ° C; 무기한 4 ° C에서 잡으십시오. 주 : 소둔 온도가 조절 될 수 있거나, 다른 구배 PCR 프로브 최적의 어닐링 온도를 결정하기 위해 완료 될 수있다. </li><li> 섹션 1.1.1, 부하로 0.7-1 % 젤을 확인하고 섹션 1.1.4에서와 같이 프로브 밴드를 시각화. </li><li> 잘라 내기 및 섹션 1.1.5에서와 같이 표시 SNeo 프로브를 정화. </li><li> 다시 실행 SNeo 5 μL (그림 2 참조) 크기의 증가와 신호 강도의 손실을 확인하기 취소 표지 SNeo 프로브와 프로브를 표시. </li><li> 클레아 자유 H 2 O. 260 nm에서 흡광도 측정에 의해 표시된 SNeo 프로브의 양을 정량화 10 NG로 SNeo 프로브 희석 / μL 분취 </li></ol></li></ol> 2. 준비 염색체 스프레드 <ol><li> 벡터 백본을 표현 안정적인 클론을 생성 (contro표준 선택 방법을 사용 리터) 또는 레트로 트랜스 관할 L1. 비 에피 솜 기자가 전사 연구와 연구 결과의 상관 관계를하는 데 사용 된 반면 12, 16, 에피 솜 벡터도 사용될 수있다. 안정적으로 제어 또는 L1 벡터 전체 성장 미디어 (필요에 따라 만든 접시 크기 조정에 10cm 접시 당 1 × 10 6 세포를) 발현하는 세포를 성장. 인 HepG2 세포, RPMI-1600, 10 % FBS 및 하이 그로 마이신 200 ㎍ / mL로 사용한다. 37 ° C에서 70 %의 합류에 문화를 성장 5 % CO 2. 주 : 성장 배지의 선택은 세포 형태에 따라 달라진다. 여기에서 사용되는 플라스미드는 하이 그로 마이신 및 네오 마이신 모두 선택 카세트를 가지고 있음을 감안할 때, 클론의 안정적인 선택도 하이 그로 마이신에서 선택한 후 네오 마이신으로 수행 될 수 있지만, 네오 마이신의 양은 각 세포 유형에 대해 허용 레벨을 설정하기 위해 최적화 될 필요가있다. </li><li> 문화 매체에 colcemid (0.4 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 90 분 metaph에서 세포를 체포하는 동안 품어ASE. 다른 세포 유형을 사용하는 경우, 경험적으로 최적의 중기 체포 colcemid와 노출 시간 (60 분, 90 분, 120 분)의 최적 농도를 결정한다. </li><li> 워시 세포는 세포 3-5 ml의 0.25 % 트립신 용액을 첨가하고, 세포를 분리하기 위해 5 분 동안 배양하여 1X 둘 베코 PBS (DPBS)를 Trypsinize 10 mL로 2 배. 10 % FBS를 함유 배지의 동일한 양의 트립신을 비활성화한다. </li><li> 4 ° C에서 1,000 XG에서 2 분 동안 세포를 원심 분리기 세포 펠렛에서 매체를 기음과 DPBS로 세포를 씻어. 세포를 다시 일시 DPBS 200㎕를 떠나는 모든 대기음 DPBS. 확인 세포를 잘 혼합하고, 모든 덩어리가 분산되어있다. 혼합 덩어리를 분산하고 텍싱을 피하기 위해 깜박임 또는 부드러운 피펫을 사용합니다. </li><li> 저장성 용액 5 ㎖를 추가 (즉, 75 밀리미터의 KCl)는 수평으로 15 ML 튜브를 회전시키면서 37 ° C 드롭 현명한에 미리은 예열 20 분 동안 37 ° C에서 품어. 재료 및 Reagen의 표를 참조하십시오취득 및 저장성 용액을 제조하는 방법에 대한 자세한 내용은 TS. </li><li> 각 세척 후 세포를 다시 일시 중단 저장성 용액을 약 200 μl를 떠나 2.5 배 - 5 4 ° C에서 분 반복 120 XG에 원심 분리기 세포는 2.4 단계를 반복합니다. 3 세척의 끝에서, 펠렛은 눈에 띄게 흰색과 부어 있는지 확인하십시오. </li><li> Carnoy 정착액 솔루션 200 μL의 펠렛을 다시 중단하고는 1 : Carnoy 정착액 솔루션 8, 1시 16분 희석 : 2, 1 : 4, 1. 위의 약 1cm에서 건조 깨끗한 슬라이드에 각 희석의 10 μl를 삭제하고 즉시 30 초 동안 끓는 물에서 뜨거운 증기로 확산없는면을 노출. Carnoy 정착액 솔루션을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오. </li><li> 0.1 μg의 /으로 상온에서 얼룩 스프레드를 건조 ml의 훽스트-33342 코 플린 항아리에서 15 ~ 20 분간 침지하여 씻어 DPBS와 배. 의 Hoechst-33342 솔루션을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오. </li> &lt;리&gt;보기는 40X 배율에서 형광 / 위상차 현미경에 펼쳐집니다. 확산 제제를 최적화 한 후, 스프레드는 훽스트-33342로 염색 할 필요가 없다. 보기 결과 섹션에서 설명한 바와 같이 확산 및 분리 품질을 결정하기 위해 10 배 배율에서 위상차 현미경 확산 (도 3 참조). </li><li> 선택하고 슬라이드의 반대편에 다이아몬드 포인트 마커 좋은 스프레드 동그라미 (즉, 확산이없는 쪽). </li><li> 저장 한 달에 최대 -20 ° C에서 펼쳐집니다. 습기에 노출되지 않도록 할 것. </li></ol> 제자리 하이브리드 3. 형광 (FISH) <ol><li> 스프레드 안정화 및 탈수 주 : -20 ° C에 저장된 경우 평형 중기 염색체 실온으로 퍼진다. 취득 및 시약을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오. <ol><li> 부화 중기 염색체 200 ㎕의 RNA 분해 효소 A의 확산으로37 ℃에서 1 시간. </li><li> 워시 각각 10mM의 HCl 용액으로 세척 한 다음 5 분 동안 두 배-SSC 완충액 슬라이드. </li><li> 탈 H 2 O로 씻어 5 분마다 2 배-SSC 버퍼로 두 번 씻어, 37 ° C에서 10 분 동안 1 % 펩신과 확산을 품어. </li><li> 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드와 스프레드을 품어 5 분마다 두 배 SSC 버퍼에 씻어. </li><li> 70 %, 80 %, 95 % 에탄올 : 에탄올 시리즈에서 2 분 동안 항온 처리에 의해 확산 탈수. </li><li> 공기 건조 슬라이드. </li></ol></li><li> 하이브리드는 L1 라벨이 지정된 레트로 트랜스 프로브와 스프레드 (즉, SNeo) 주의 : 직접 표지 된 프로브의 경우, 항상 빛에 가까이하지 말 것. 취득 및 시약을 만드는 방법에 대한 자료 및 정보 용 시약의 표를 참조하십시오. <ol><li> 10 분 동안 72 ° C에서 하이브리드 버퍼에 SNeo 30 ng의 열을 추가하고 실온에서 2 분 동안 멋진. </li><li> 전자에 SNeo 프로브 솔루션의 30 μl를 추가ACH 확산, 커버 슬립으로 커버 고무 시멘트와 가장자리를 밀봉. 더 거품 형성을 확인하지 않습니다. </li><li> 점차적으로 37 ℃로 온도를 삭제하고, 37 ℃에서 어두운 가습 실에서 하룻밤 부화, 히트 블록을 5 분 동안 72 ° C에서 슬라이드를 가열한다. </li></ol></li><li> 세탁보기 (또는 이차 항체의 추가) 주의 : 직접 표지 된 프로브의 경우, 항상 빛에 가까이하지 말 것. 주 : 재료 및 준비하는 방법에 대한 자세한 내용은 시약의 표를 참조하십시오. 전체 염색체의 확산을 충당하기에 충분한 볼륨의 사용을 권장합니다. coverslip에 추가 할 때 여분의 볼륨이 손실됩니다 것을 기억하십시오. <ol><li> 커버 슬립을 제거하기 위해 2 배 SSC 버퍼에 슬라이드를 담가. </li><li> 5 분 동안 45 ° C에서 2 배-SSC 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 5 분, 2 배 45 ° C에서 세척 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 분 동안 45 ° C에서 0.1X SSC 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오. </li><li>10 분 동안 45 ° C에서 2 배 SSC 버퍼에 침지하여 슬라이드를 씻으십시오. 참고 : 장소 수조에 추천 버퍼를 포함하는 코 플린 항아리는 45 ° C까지 온도를 조정합니다. </li><li> 실온으로 냉각 슬라이드 및 검출 완충액 슬라이드 평형. </li><li> 직접 표지 된 프로브를 들어, 3.4.10 단계로 건너 뜁니다. </li><li> 간접 표지 프로브를 들어, 20 ~ 30 분 동안 버퍼를 차단하는 블록 DPBS에 배를 씻는다. </li><li> 1 시간 동안 (버퍼를 차단하는 예를 들어, 5 μg의 / ㎖의 스트렙 타비 딘 - FITC, 또는 αCY3) 차 항체의 50 μL에 품어. </li><li> 두 번 5 분 동안 2 배 SSC에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 분 동안의 Hoechst-33342 용액 (0.1 μg의 / ㎖) Counterstain과. 참고 :이 염색이 프로브와 공동 현지화 염색체를 염색하기위한 것입니다. </li><li> 장착 매체의 드롭을 추가 DPBS 배에 씻어 커버 슬립을 배치하고 매니큐어와 가장자리를 밀봉. </li><li> 40X mA에서 형광 현미경을 사용하여 L1의 레트로 트랜스 분석gnification. </li></ol></li></ol>

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저자는 잠재적 경쟁 이익을 선언합니다.

이러한 전체 게놈 시퀀싱, 역 PCR 및 남부 블롯 같은 방법론은 L1의 레트로 트랜스을 연구하기 위해 사용되어왔다. 이 방법은 L1 삽입은 게놈 내에서 발생하는 곳의 위치에서 매우 가치가 있지만, 그들 모두에 대한 혼란 문제는 순서를 재 조립하기에 실리 프로그래밍의 필요성이다. 여기에 설명 된 FISH 방법은 특히 배양 된 세포에서의 이소성 L1 레트로 트랜스의 분석을 요구하는 시험의 경우에는, 이러한 방법을 보충하도록 설계된다. 접근법은 레트로 트랜스 이벤트 양적 질적 평가를 위해 사용되는 핵 간기에 적용될 수있다. 이 방법론은 이소성 L1 삽입 부위 (16)를 결정하는데 사용 이후에 실리 서열 정렬 방법의 정확도를 제공합니다. 반복적 서열 정렬 의한 단독 중합체의 형성 모호 할 수있는 동안 반복 sequenCES는 반복 서열의 과소 대표 결과 템플릿의 프라이머 증폭 중에 손실 될 수 있습니다...

인간의 긴 산재 핵 요소-1 (라인-1 또는 L1) 레트로 트랜스 메커니즘을 관통 게놈 내에서 전파 &quot;복사 및 붙여 넣기&quot;자율 이동 요소입니다. 일반적인 인간의 L1은 ~ 6킬로바이트 길고 프로모터 역할을하는 5&#39;UTR (번역되지 않은 지역)으로 구성되어, 두 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF를) L1 -ORF1 및 L1 -ORF2 및 폴리 -A와 3&#39;UTR . 코일 코일 도메인, RNA 인식 모티브와 C 터미널 도메인, L1 -ORF2 단백질이 효소를 가지고있는 동안, 효소 및 시스테인이 풍부한 도메인 1,2,3,4,5 역 : 꼬리 L1 -ORF1 단백질은 세 가지 영역이 있습니다. L1 -ORF2는 레트로 트랜스 1,2,6 모두 필요 단백질, 효소 활성을 제공하지만 L1 -ORF1는 핵산 샤페론 활성을 나타낸다. L1의 레트로 트랜스의주기는 L1의 5&#39;UTR에서 전사로 시작 </EM&gt; RNA 중합 효소 II, 전위 세포질로, 번역에 의해 bicistronic mRNA를. 세포질에서, L1 -ORF1 나타낸다 하나는 다른 RNA를 패키지화 그 자체 RNA 패키지화 시스 - 결합 또는 트랜스 - 결합 (즉, SINE은 / SVAS / 가유)는 L1 -ORF2p 7와 리보 입자 (RNP)을 형성 할 8. 즉 프라이밍 역전사 효소에 의해 사용 턴이고, 기 (9) 및 3 &#39;말단에서 DNA으로서 합성 된 RNA를 역 - RNP들에는 L1 -ORF2p 닉스 게놈 DNA (gDNA를)의 효소 활성은 OH를 노출 핵으로 이동시키다. 역 합성 중에 DNA의 두번째 가닥 서명 L1 삽입 서열 (예 TTTTAA)라는 목표 부위 중복 (TSD) 9,10 형성 채워진다 태거 나누기 만들 원래 닉 사이트 7-20 혈압 새김된다. 이 과정은 대상 주요 역 전사 (TPRT)로 알려져 inserti에 이르게된다삽입 된 시퀀스의 양쪽 끝에서 TSDs와 L1 / 다른 DNA를 전체 또는 절단 된 사본에. L1의 레트로 트랜스도를 통해 매개되는 것으로 나타났다 비 동종 최종 합류 일부 세포 유형 11 TPRT처럼. 우리의 연구에서 사용 된 L1의 레트로 트랜스 벡터가 아닌 에피 솜과 태그 L1 -ORF1 &amp; 2P 결합 CMV-L1-5&#39;UTR 프로모터에 의해 구동 (그림 1) (12)로 구성되어 있습니다. 이 구조의 이전 버전 효모 및 인간의 세포 배양 13,14,15를 사용하여 연구에 기재되어있다. 3 &#39;말단이 접합 및 통합 후 네오 마이신의 발현을 유도하기 위해 반대 방향으로 배치하여 5&#39;및 3 &#39;에있는 두 가지 CMV 프로모터는 벡터의 끝납니다. 3 &#39;말단에서의 레트로 트랜스 표시 카세트 L1 -ORFs에 네오 마이신 유전자 삽입 안티센스 구성 및 글로브에 의해 두 부분으로 분리하여 비활성 렌더링접합 기증자 (SD)과 접합 수용체 (SA) 사이트 (그림 1)과 인트론있다. 염색체 내로 통합되면, L1은 bicistronic mRNA의 비활성 마이신 mRNA에 구성된의 mRNA를 생산하는 일반 프로모터로부터 전사된다. RNA 프로세싱 동안에, 글로빈 인트론은 완전히 기능 네오 마이신 유전자를 복원하는 네오 마이신 유전자에서 접합된다. 하이브리드의 mRNA는 시스의 RNP로 포장이 TPRT를 사용하여 전체 길이 또는 절단하거나 삽입 등의 게놈에 통합되어 핵으로 전좌된다. 여기에서 우리는 하나의 핵 수준에서 L1의 -retrotransposiition 패턴과 삽입 속도를 추적하기 위해 특별히 접합 네오 마이신 유전자 (SNeo)에 지시 프로브와 현장 하이브리드 (FISH)에서 형광을 사용하는 방법을 설명합니다. 효율성과 검출 특이도는 탐지하는 능력 레트로 트랜스와 무능 구조 및 프로브를 사용하여 확인 하였다요법 SNeo 또는 ​​인트론 접합 (16) 글로빈 네오 마이신합니다. 이 방법은 복수의 삽입, 콜로니 저항 양호한 클론 확장으로서 세포 배양 계 레트로 트랜스 분석법의 단점 중 일부를 차지한다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Labeling Probes</td></tr><tr><td>Go Tag DNA polymerase</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>GO Tag 10x 무색 버퍼</td><td>Promega</td><td>M3178</td><td></td></tr><tr><td>개별 dNTP</td><td>Sigma</td><td>DNTP10</td><td>dATP, dGTP, dCTP의 농도를 2&nbsp; mM 및 dTTP는 1.5&nbsp; 뉴클레아제가 없는 물에 있는 mM.</td></tr><tr><td>dUTP-16-비오틴(0.5&nbsp; mM)</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-FITC (0.5&nbsp; mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>dUTP-CY3 (0.5&nbsp; mM)</td><td>Sigma</td><td>GEPA53022</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH 라벨링 키트</td><td>MIRUS</td><td>MIR3625</td><td></td></tr><tr><td>MIRUS FISH 라벨링 키트</td><td>MIRUS</td><td>MIR3225</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin PCR Clean-Up kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1410/0030</td><td>NucleoSpin PCR 클린업 키트</td>PCR 기계</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 대신 모든 PCR 세척 시약을 사용할 수 있습니다.<tr><td>아가로스</td><td>시그마</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Preparing chromosome spreads</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>15212-012</td><td>Colcemid를 성장 배지에 직접 첨가하여 최종 농도 0.4&nbsp; &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>1&nbsp; M KCl</td><td>시그마</td><td>P9541</td><td>희석 1&nbsp; M KCl 솔루션에 75&nbsp; Hypotonic Solution을 만드는 mM 솔루션</td></tr><tr><td>Carnoy Fixative Solution</td><td></td><td></td><td>3 부피의 메탄올과 1 부피의 아세트산을 혼합하여 Carnoy Fixative Solution을 만듭니다. 매번 신선하게 만드십시오.</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>시그마</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Hoechst-33342를 PBS에 용해시켜 최종 농도 1&nbsp; mg/ml입니다.</td></tr><tr><td>다이아몬드 포인트 마커</td><td>Thermo Scientific</td><td>750</td><td></td></tr><tr><td>서리 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>2951-001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>R001100</td><td>detech cell을 위해 Trypsin에서 세포를 5분 동안 배양하고 동일한 부피의 완전한 배지로 비활성</td></tr> 상태로 세포를 배양합니다.<tr><td>커버 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>히트 블록</td><td></td><td></td><td>이러한 목적으로 모든 히트 블록을 사용할 수 있지만 가열 슬라이드에 장착된 블록이 권장됩니다.</td></tr><tr><td>비커(600&nbsp; ml)</td><td>Sigma</td><td>CLS1003600</td><td>비커에 물을 채우고 끓일 때까지 가열한 다음 뜨거운 증기를 사용하여 염색체를 터뜨립니다.</td></tr><tr><td>니콘 현미경</td><td>니콘</td><td>125690</td><td>모든 현미경을 사용하여 스프레드 품질을 볼 수 있습니다.</td></tr><tr><td colspan = "4 ">< 강> 시약 및 재료 FISH< / 강></td></tr> <tr><td>시트르산 삼 나트륨</td><td>시그마</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>크로라이드</td><td>나트륨 시그마</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>포름 아미드</td><td>시그마</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>트윈 -20</td><td>시그마</td><td>F1379</td><td></td></tr><tr><td>Detran 황산염</td><td>시그마</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>시그마</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>생명 기술&nbsp;</td><td>15632-011</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>HCl (N)</td><td>Sigma</td><td>38283</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>시그마</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma</td><td>P6887</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드 (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst-33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td>Hoechst-33342를 PBS에 용해시켜 최종 농도 1&nbsp; mg/ml입니다.</td></tr><tr><td>고무 시멘트/사이토본드 씰란트&nbsp;</td><td></td><td>2020-00-1</td><td></td></tr><tr><td>Seven Coplin Jars</td><td>Thermo Scientific</td><td>107</td><td></td></tr><tr><td>어두운 가습 챔버</td><td>시그마</td><td>CLS2551</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬라이드</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td></td></tr><tr><td>건조 디지털 히트 블록</td><td>VWR</td><td>13259</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x 식염수-구연산나트륨 (20x SSC)</td><td></td><td></td><td>NaCl 175g과 88.2&nbsp; 분자 등급 H2O 800ml가 함유된 시트르산 삼나트륨 g. pH 7로 조정하면서 저어줍니다. 모든 염이 용해되면 부피를 1L로 조정하고 0.22 &마이크로를 통해 필터링합니다. m 여과지. 4 &deg;C에 보관하십시오.</td></tr><tr><td>1&nbsp; mg/ml의 Rnase 20x</td><td></td><td></td><td>SSC 버퍼를 2x SSC 버퍼로 희석합니다. RNase A를 2x SSC 완충액에 용해시켜 최종 농도 1&nbsp; mg/ml입니다. 매번 새로운 솔루션을 만드십시오.</td></tr><tr><td>1% 펩신</td><td></td><td></td><td>펩신(W/V)을 10mM HCl에 용해시켜 1% 용액의 최종 농도로 만듭니다. 매번 신선하게 만드십시오.</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 (4% PFA)</td><td></td><td></td> <td>PFA 4.0 g을 연기 후드에 넣고 1xPBS 50 ml를 첨가하여 60&nbsp로 가열합니다. &데그; C를 교반하면서 모든 PFA가 용해되고 용액이 투명해질 때까지 NaOH 방울로 pH를 조정합니다. 볼륨을 100&nbsp; ml, 0.22 &micro를 통한 필터; m 종이를 여과하고 -5&nbsp에서 20ml 분취액을 보관하십시오. &deg;C. 37에서 PFA의 해동 분취량 &deg; 후속 사용을 위해 10-15분 동안 C. 파라포름알데히드의 양에 따라 필터 크기를 조정합니다.</td></tr><tr><td>세척 완충액</td><td></td><td></td><td>100ml의 포름아미드(20%)와 2.5ml의 20x SSC를 결합하고 1.0M HCl로 pH 7로 조정한 다음 분자 등급 H2O로 부피를 500ml로 가져옵니다.</td></tr><tr><td>혼성화 완충액</td><td></td><td></td><td>은 2x SSC 완충액에 50% 포름아미드, 10% 덱스트란 설페이트, 0.1% SDS 및 300ng/ml 연어 정자 DNA를 결합합니다. 포름 아미드의 양은 염색 분류가 얼마나 집중되어 있는지를 결정합니다. 금액을 적정하십시오.</td></tr><tr><td>검출 버퍼:</td><td></td><td></td><td>20x SSC 버퍼를 4x로 희석하고 0.2% Tween-20을 추가하여 검출 버퍼를 만듭니다.</td></tr><tr><td>블로킹 버퍼</td><td></td><td></td><td>: 5% 소 혈청 알부민(BSA)과 0.2% Tween-20을 4x SSC 버퍼에 결합합니다.</td></tr><tr><td>탈수 용액</td><td></td><td></td><td>은 70%, 80% 및 95% 에탄올 용액을 만듭니다.</td></tr></tbody></table>

단일 핵 수준에서 line-1 레트로 트랜스 분석

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 또는 L1)은 인간 게놈에 존재하는 DNA의 약 17%를 차지합니다. L1s의 대다수는 5' 절단으로 인해 비활성 상태이지만 이러한 요소 중 ~80-100개는 후전위 능력을 유지하고 RNA 중간체를 통해 게놈 전체의 다른 위치로 전파됩니다. 더 오래된 L1은 게놈의 풍부한 AT 영역을 표적으로 하는 것으로 여겨지지만, 더 새롭고 더 활동적인 L1의 염색체 표적은 잘 정의되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기에서는 단일 핵 수준에서 L1 삽입 패턴과 이소성 L1 혼입 속도를 추적하는 데 사용할 수 있는 FISH(Fluorescence in situ hybridization) 방법론에 대해 설명합니다. 이 실험에서는 이소성 L1을 안정적으로 발현하는 HepG2 세포에서 L1 역전이를 추적하기 위해 플루오레세인 이소티오시아네이트/시아닌-3(FITC/CY3) 표지 네오마이신 프로브를 사용했습니다. 이 방법론은 독성에 의해 제기되는 역전위 속도 추정의 오류를 방지하고 단일 핵에 여러 삽입의 발생을 설명합니다.

L1의 레트로 트랜스 벡터의 개략도는도 1에 제시되어있다. 벡터는 센스 방향의 글로빈 인트론에 의해 중단 및 SD 및 SA 사이트에서 끼워 L1의 ORF에 안티센스 방향 네오 마이신 유전자로 구성된다. 안정적으로 염색체에 통합하면, L1의 mRNA가 결합 된 CMV 및 L1-5&#39;UTR 프로모터 (그림 1)에서 전사한다. RNA 프로세싱 동안에, 글로빈 인트론은 네오 마이신 유전자에서 접합된다. 신자유 L1 RNA는 패키지 전좌와 전체 길이 또는 절단 삽입 중 하나로 게놈에 통합되어 있습니다. 나타낸 바와 같이, L1은 접합의 레트로 트랜스 네오 마이신 (도 1)에 특이적인 프로브를 이용하여 FISH에 의해 추적 될 수있다. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

여기에서 우리는 안정적으로 합성 LINE-1을 표현 인 HepG2 세포주의 염색체 스프레드에서 하나의 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스을 추적하기 위해 FISH 방법을 사용한다.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 형광 인시튜 하이브리드화(fluorescence in situ hybridization, FISH)를 사용하여 단일 핵 수준에서 L-1 역전이율과 패턴을 시각화하고 분석하는 것입니다. 이 방법론의 주요 장점은 실험자가 역전이율과 패턴을 과대 또는 과소 평가하는 것을 방지할 수 있다는 점이며, 다른 방법론과 병행할 때 단일 핵 수준에서 L-1 역전이를 연구할 수 있게 해준다는 것입니다. 오늘 이 절차를 수행하는 사람은 연구실의 시니어 펠로우인 Pasano Bojang 박사입니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 TAE 버퍼로 0.7%에서 1% 아가로스 겔을 준비한 후, 제조사 프로토콜에 따라 CY3 또는 FITC를 사용하여 SNeo 프로브를 표지하고 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이션합니다. 표지된 SNeo 프로브 용액을 1X DNA 로딩 버퍼와 혼합하여 아가로스 겔의 웰에 로딩합니다. 그런 다음 75에서 100 V로 15분에서 20분 동안 겔을 전기영동합니다.UV 조사기를 사용하여 프로브 밴드를 확인합니다. 깨끗한 블레이드로 겔에서 라벨링된 SNeo 프로브를 절취합니다. 그 후 제조사의 프로토콜에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 SNeo 프로브를 가용화 및 정제합니다.정제 후, 0.7% agarose gel에서 SNeo 표지 프로브 5 µL를 표지되지 않은 SNeo 프로브와 함께 다시 전기영동하여 크기 증가와 신호 강도 감소를 확인합니다. 표지된 SNeo 프로브의 양을 정량하기 위해 260 nm에서 흡광도를 측정하고, nuclease-free water를 사용하여 SNeo 프로브를 10 ng/µL의 소량 분주액으로 희석합니다. 이 분주액들을 -20 °C에서 보관하십시오.역전사 이동 능력이 있는 L-1 또는 벡터 백본을 발현하는 안정적 클론을 생성한 후, 대조군 또는 L-1 벡터를 안정적으로 발현하는 HepG2 세포를 배양합니다. 배양 배지에 0.4 micrograms per milliliter의 colcemid를 첨가합니다. 그리고 세포를 중기(metaphase)에서 정지시키기 위해 90분 동안 배양합니다.1X Dulbecco's PBS(또는 DPBS) 10 milliliters를 사용하여 세포를 2회 세척합니다. 그 다음 0.25% trypsin 용액을 첨가하고 5분 동안 배양합니다. trypsin을 불활성화하기 위해 10% FBS가 포함된 배지를 첨가했습니다.다음으로, 세포를 15 milliliter 튜브로 옮기고 1,000 Gs, 4 °C에서 2분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 세포 펠릿에서 배지를 흡입하여 제거하고 DPBS를 사용하여 세포를 세척합니다. DPBS 200 microliters만 남기고 모두 흡입한 후, 튜브를 톡톡 치거나 부드럽게 피펫팅하여 세포가 뭉침 없이 잘 섞이도록 재현탁합니다.튜브를 수평으로 회전시키면서, 예열된 저장액 5 mL를 한 방울씩 첨가하고 37 °C에서 20분 동안 배양합니다. 세포를 120 ×g, 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 저장액 200 µL만 남기고 모두 제거합니다.고정액으로 3회 세척하며, 세척 단계 사이에는 세포에 약 200 microliters의 고정액을 남겨둡니다. 3회 세척 후, 펠릿이 육안으로 보기에 하얗게 부풀어 올랐는지 확인합니다. 그런 다음, 200 microliters의 Carnoy 고정액으로 펠릿을 재부유시키고, 이 고정액을 사용하여 재부유된 세포를 다음과 같이 희석합니다.각 희석액 10 µL를 깨끗하고 건조한 슬라이드 위 약 1 cm 높이에서 떨어뜨린 후, 즉시 슬라이드의 도말되지 않은 면을 끓는 물의 뜨거운 증기에 30초 동안 노출시킵니다. 상온에서 도말물을 건조시킨 후, DAPI가 포함된 봉입제로 염색하고 커버슬립을 덮습니다. 배양 후, DPBS를 사용하여 슬라이드를 3회 세척합니다.스프레드를 관찰하려면 40배율의 형광 대비 현미경을 사용하십시오. 스프레드 제작 과정을 최적화한 후에는 별도의 염색 과정이 필요하지 않습니다. 상태가 좋은 스프레드를 표시하려면 슬라이드의 반대편에 다이아몬드 포인트 마커를 사용하여 표시하십시오.중기 염색체 도말 표본을 안정화하고 탈수시키기 위해, 시료에 RNase A 200 µL를 처리하고 37 °C에서 1시간 동안 배양합니다. 2X SSC로 슬라이드를 5분씩 2회 세척하고, 10 mM HCl로 시료를 헹굽니다. 그 후 도말 표본에 1% pepsin을 첨가하고 37 °C에서 10분 동안 배양합니다.탈이온수로 슬라이드를 헹군 후, 2X SSC를 사용하여 샘플을 5분씩 두 번 세척합니다. 그런 다음 도말 표본에 4% paraformaldehyde를 첨가하고 10분 동안 배양한 후, 2X SSC 버퍼로 두 번 더 세척합니다. SSC 세척 후, 다음의 에탄올 시리즈에서 샘플을 각각 2분 동안 배양하여 도말 표본을 탈수시킵니다.30 ng의 SNeo를 하이브리드화 완충액에 첨가하고 72 °C에서 10분 동안 가열한 후, 실온에서 2분 동안 냉각합니다. 그 다음, 각 도말 시료 위에 SNeo 프로브 30 µL를 피펫으로 분주하고 커버 슬립으로 시료를 덮습니다. 고무 시멘트를 사용하여 가장자리를 밀봉하며, 이때 기포가 생성되지 않도록 주의합니다.슬라이드를 72 °C의 히팅 블록에서 5분 동안 유지하십시오. 그 후 온도를 37 °C까지 서서히 낮추십시오. 37 °C의 습윤 챔버 내 암소에서 하룻밤 동안 배양하십시오.2차 항체를 적용하려면, 먼저 슬라이드를 2X SSC 버퍼에 담가 커버 슬립을 제거합니다. 그런 다음 슬라이드를 45 °C의 2X SSC에 5분 동안 담가 세척한 후, 샘플을 세척 버퍼로 옮겨 45 °C에서 5분씩 2회 세척합니다. 이어서 슬라이드를 45 °C의 0.1X SSC 버퍼에 10분 동안 담급니다.그 다음 슬라이드를 45 °C의 2X SSC 버퍼에서 10분 동안 세척합니다. 슬라이드를 상온으로 식힌 후, 직접 표지 프로브의 경우 2X SSC를 사용하여 슬라이드를 5분씩 2회 세척합니다. 검출 버퍼에서 상온으로 10분 동안 평형화합니다. 그 후 DAPI가 포함된 마운팅 용액을 첨가하고 샘플을 10분 동안 대조 염색합니다.커버슬립을 덮고 매니큐어를 사용하여 가장자리를 밀봉합니다. 마지막으로, 40배 배율의 형광 현미경을 사용하여 L-1 역전사 이동을 분석합니다. 여기에서 보여주는 것과 같이, 희석액을 준비하고 각 전이의 밀도, 분포 및 핵으로부터의 거리를 평가하여 중기 염색체 도말의 밀도를 결정했습니다.후속 분석을 위해 고르게 분포된 저밀도 도말 표본을 선택하였습니다. 이 이미지들은 Hoechst 염료 DAPI로 염색된 염색체 도말 상태를 나타내며, 도말 품질은 염색체의 길이, 도말의 원형도 및 염색체 간 거리를 기준으로 평가되었습니다. 세포를 저삼투압 용액에서 짧은 시간 동안 배양한 경우, 염색체 도말이 단단하게 엉켜 개별 염색체를 시각화하기 어려웠습니다.그러나 저장액에서의 배양 시간이 길어지면 핵의 파열, 염색체의 흩어짐 및/또는 염색체 손실이 발생했습니다. colcemid 배양 시간을 늘리면 중기 세포의 수는 증가했으나 염색체의 응축이 일어났습니다. 여기에 제시된 바와 같이, colcemid에서 90분, 37 °C의 저장액에서 20분간 배양하고 고온 증기를 사용하여 세포를 파열시키는 것이 고품질의 도말 표본을 제작하기 위한 최적 조건인 것으로 나타났습니다.본 실험에서는 SNeo를 표적으로 하는 프로브를 사용하여 L-1 역전사 전이 여부를 확인하기 위해 염색체 도말 표본을 염색하였습니다. 프로브에는 FITC와 CY3가 모두 표지되었으며, 이를 통해 두 경우 모두 L-1 역전사 전이가 야생형 L-1을 발현하는 세포에서만 관찰됨을 보여주었습니다. 이 실험에 숙달되면, 특히 하이브리드화 시간을 2~4시간으로 단축하고 기술적으로 정확하게 수행할 경우 실제로는 6~8시간 이내에 완료할 수 있습니다.본 기술을 수행할 때는 오염을 방지하기 위해 충분히 세척하고, 하이브리다이제이션 시간을 최적화하며, dNTP 프로브를 화학적으로 표지하는 것이 중요합니다. 삽입 위치의 염색체 위치와 같은 추가적인 질문에 답하기 위해서는 L-1 시퀀싱 및 G-banding과 같은 추가 기술을 수행할 수 있습니다. 이 영상을 시청하고 나면 L-1 프로브를 표지하고, 염색체 도말을 수행하며, 형광 인 시튜 하이브리다이제이션(fluorescence in situ hybridization) 기술을 이용하여 L-1 레트로트랜스포지션의 패턴과 비율을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술은 L-1 retrotransposition의 패턴뿐만 아니라 L-1 삽입 부위 연구의 토대를 마련했습니다. 독성 물질, 생물학적 시약 및 자외선을 다룰 때는 장갑과 보호 장구를 착용하는 등의 주의 사항을 준수하는 것이 필수적이라는 점을 유념해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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여기에서, 우리는 궤적 특정 수준에서 라인 1 발현을 식별 하기 위해 생물 학적 접근법 및 분석을 제시 한다.

RNA 차세대 염기 서 열 분석 및 생물 정보학 파이프라인은 궤적 특이 수준에서 발현 된 라인-1s를 식별 한다

이 문서는 활성 LINE-1 레트로트랜스포종의 활성을 모니터링하고 주어진 게놈에서 드 노보 역변도를 매핑하는 간단한 PCR 기반 분석방법을 간략하게 설명합니다. MCF7 세포주를 사용하여, 우리는 이 방법을 22q12.1에 위치한 LINE-1의 활성을 검출하기 위해 어떻게 적용될 수 있는지를 본원에서 입증한다.

장거리 역PCR에 의한 핫 LINE-1의 역변도 활성 감지

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

학습하세요 HepG2 세포주에서 FISH를 이용한 단일 핵 수준 LINE-1 레트로트랜스포지션 분석 방법. 이 기술은 정확한 레트로트랜스포지션 비율 측정과 유전체 안정성 연구에 필수적입니다.

단일 핵 수준에서 LINE-1 레트로 트랜스 분석

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