의 사체 프로파일 링 생체 제작 소 착상 전 배아

이 비디오의 전반적인 목표는 7일째 소 배아에서 적은 양의 총 RNA를 사용하여 2색 맞춤형 소 배열을 사용하여 최적화된 기술 절차를 제공하는 것입니다. 이 방법은 생산량이 많은 젖소의 배아 손실과 관련된 주요 질문과 착상 전 발달 중인 배아의 유전자 발현과 관련된 배아 품질에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 단일 배아에서 추출한 총 RNA의 피코그램 수준을 사용하여 유전자 발현을 연구할 수 있다는 것입니다.

이 방법은 생체 내에서 생산된 소의 착상 전 배아의 생존에 영향을 미치는 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이는 또한 체외 배아 생산과 같은 생식 기술을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시작하려면 컬럼 기반 피코 스케일 RNA 추출 키트의 마이크로 원심분리 튜브에 스냅 냉동 소 배아를 준비합니다.

튜브에 10마이크로리터의 용해 완충액을 추가하고 배아를 섭씨 42도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 800배 G.Pipette 250마이크로리터의 컨디셔닝 버퍼로 튜브를 정제 컬럼 필터 멤브레인에 2분 동안 원심분리하고 실온에서 5분 동안 컬럼을 배양합니다. 수집 튜브를 16, 000회 G에서 1분 동안 원심분리하여 컬럼 사전 조정을 마칩니다.

용해 완충액과 배아의 혼합물에 10 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하고 잘 섞는다. 그런 다음 혼합물을 정제 컬럼에 로드합니다. 100배 G에서 2분 동안 컬럼을 원심분리한 다음 16, 000배 G에서 30초 동안 원심분리합니다.

란에 첫번째 세척 완충액의 100개 마이크로리터를 추가하고, 8, 1 분 동안 000배 G에 분리기를 추가하십시오. DNase 키트를 사용하여 5마이크로리터의 원액과 35마이크로리터의 완충액을 혼합하고 닫힌 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 그런 다음 DNase 혼합물을 정제 컬럼 멤브레인에 로드하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.

40마이크로리터의 첫 번째 세척 버퍼를 컬럼에 추가하고 15초 동안 8, 000회 G로 원심분리합니다. 그런 다음 두 번째 세척 버퍼 100마이크로리터를 추가하고 1분 동안 원심분리합니다. 란에 두번째 세척 완충액의 다른 부분을 추가하고, 16, 000 시간 G.Transfer에 2 분 동안 정화 란을 다른 마이크로 분리기 관에 추가하고, 란 막에 용출 완충액의 11 마이크로리터를 적재하십시오.

실온에서 1분 동안 컬럼을 배양합니다. 1, 000 시간 G, 그리고 16, 000 시간 G.Check에 또 다른 분 동안 1 분 동안 란을 원심분리기 용출된 RNA의 질 그리고 양 그 후에 저장하고, 그 후에 부정적인 80 섭씨 온도에 있는 표본을 저장하십시오. 증폭 키트를 사용하여 100피코그램의 고품질 RNA를 증폭합니다.

형광 기반 정량 분석을 통해 증폭된 aRNA의 크기 범위를 평가합니다. 그런 다음 분광 광도법으로 aRNA의 농도를 측정합니다. 표준 키트를 사용하여 형광 표지를 위해 증폭된 aRNA 2마이크로그램을 준비합니다.

암실에 오존 상자를 설정하고 오존 수치가 0.001ppm으로 감소할 때까지 기다립니다. 조명 위에 암실 필터를 놓습니다. 그런 다음 샘플을 오존 상자로 가져오고 시아닌 5 염료 및 라벨링 버퍼를 각각 2 마이크로 리터씩 첨가합니다.

안전한 조명 아래에서 샘플에 RNase free water를 추가하여 총 20 μlit의 부피를 얻습니다. 샘플을 부드럽게 혼합한 다음 섭씨 85도의 열순환기에서 튜브를 15분 동안 배양합니다. 얼음 위에서 샘플을 1분 동안 식힌 다음 샘플을 탈수합니다.

RNA 추출 키트로 표지 및 증폭된 aRNA를 세척합니다. 적절한 유형의 분광계를 사용하여 표지되고 증폭된 aRNA의 농도를 측정합니다. 시아닌 3 염료로 표지된 증폭된 aRNA의 두 번째 샘플을 준비합니다.

aRNA 샘플을 섭씨 영하 80도에서 최대 3일 동안 보관합니다. 각각 825 나노그램의 Cy3 및 5 표지 aRNA를 결합합니다. 여기에 블로킹 버퍼와 단편화 버퍼를 추가합니다.

혼합물을 섭씨 60도에서 15분 동안 배양한 다음 얼음에서 1분 동안 식힙니다. 55마이크로리터 혼성화 완충액을 추가하고 기포를 도입하지 않고 잘 혼합합니다. 혼합물을 1분 동안 11, 300회 G로 원심분리한다.

100마이크로리터의 샘플을 어레이 슬라이드에 로드하고 혼성화 챔버에서 슬라이드를 밀봉합니다. 섭씨 65도에서 17시간 동안 샘플을 하이브리드화하면서 분당 10회 회전합니다. 오존 제거 안정화 및 건조 용액을 준비합니다.

어레이를 세척하고 오존 노출을 최소화하기 위한 예방 조치를 취한 다음 안정화 및 건조 용액에 30초 동안 담그십시오. 어레이 표면이 건조하고 먼지가 없는지 확인하십시오. 어레이를 어두운 곳에 보관하십시오.

마이크로어레이 스캐너를 켜고 스캔할 준비가 될 때까지 기다립니다. 그런 다음 바코드가 왼쪽에 있는 어레이를 로드합니다. 스폿 분석을 수행하고 데이터를 GPR 파일로 저장하십시오.

통계 분석 소프트웨어에서 데이터를 정규화하고 분석합니다. 양의 스폿 선택 임계값을 계산하고 혼성화된 신호와 배경 신호의 플롯을 확인합니다. 배열 내에서 Loess 정규화를 수행한 다음 배열 정규화 사이에 분위수를 수행합니다.

정규화된 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. 마이크로어레이 데이터 저장소의 모든 양성 신호를 사용하여 선택한 고유 유전자의 ID 목록을 만들 수 있습니다. ID 목록을 단백질 분류 및 분석 데이터베이스에 업로드하여 bos taurus를 유기체로 선택하고 기본 통계적 과대 대표 테스트를 수행합니다.

2 라운드 증폭 후 단편은 크기가 매우 유사하고 품질이 좋습니다. 이 방법에 의하여 성공적으로 확대는 aRNA의 적어도 천 배 증가를 산출해야 한다. 고품질 마이크로어레이 이미지는 두 채널 모두에서 스폿 강도가 높고 배경 강도가 낮습니다.

배경 강도가 너무 높으면 신호 해상도가 나빠집니다. 반점의 약 46%는 배경 위에 있었으며, 배반포에서 발현된 6,765개의 고유한 RNA 전사체가 분리되었습니다. 통계적 과대 대표 테스트는 상위 10개 유전자 온톨로지 용어가 활성 세포 분열 과정을 나타내는 것으로 나타났습니다.

이 기술의 개발을 통해 동물 생식 분야의 연구자들은 배아 유전자 발현을 탐구하고 다양한 요인이 발달 중인 배아에 어떤 영향을 미치는지 평가할 수 있게 되었습니다. 이 기술은 돼지와 같은 다른 중요한 종에서도 개발되었습니다. 이 절차에 따라 정량적 PCR과 같은 다른 방법을 사용하여 마이크로어레이 결과를 검증할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 배아에서 RNA를 추출하는 방법과 RNA를 증폭하고 라벨링하여 2색 마이크로어레이 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.