Name: (A)의 유지 보수 노랑 초파리 인구 케이지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 학습하세요 Drosophila melanogaster 인구 케이지 유지 보수 방법을. 효율적으로 배아와 유충을 수집하여 생화학 및 분자생물학 실험에 필요한 DNA, RNA, 단백질을 대량 생산할 수 있습니다.

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우리는 Yixian Zheng (Carnegie Institution of Washington, Baltimore, MD)에게 초기 설정에 대한 원본 프로토콜과 도움을 주시고 원고를 비판적으로 읽어 주신 Lei 연구소 구성원에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립당뇨병연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

1.주기 시작 : 시드 배아를 참고 : 사이클은 이전 사이클에서 수집 된 자료의 1.5 g (배아 및 / 또는 일부 첫번째 령 애벌레로 구성된 혼합물)로 시작합니다. 이 자료는 번데기 단계까지 활성 효모의 혼합물로 플라스틱 용기 (특정 재료 / 장비의 표 참조)에 배치됩니다. 용기는 유충이 탈출 할 수 있도록 피하기 위해 뚜껑을 생물학적 배아의 혼합물 및 유충의 도입 후 종료됩니다. 이 공기 순환을 허용하기 위해 뚜껑에 구멍을 만드는 것이 필요하다. 구멍을 통해 유충 탈출을 피하기 위해, 폼 플러그가 사용된다. 마지막으로, 표백제로 더럽거나 염색 옷을 입지 않도록,이 섹션뿐만 아니라 전체 프로토콜뿐만 아니라 장갑과 실험실 코트를 착용하는 것이 좋습니다. <ol><li> 플라스틱 용기를 설정합니다. <ol><li> a의 플라스틱 용기 뚜껑에 면도날 세 개의 사각형 구멍을 확인2.2 cm를 pproximately. 폼 플러그 (50 X 55mm, DXL)에 대한 엄격한 규격을 확인하고 각 구멍에 하나의 폼 플러그를 배치하기 위해 각 구멍의 네 모서리에 테이프 (3/4 인치 라벨 테이프)를 추가합니다. </li><li> 플라스틱 포장과 플라스틱 용기의 내부를 커버. 이 막 위에, 플라스틱 용기의 바닥면을 커버 층을 추가한다. 손가락으로면 눈물. </li></ol></li><li> 플라이 음식을 준비합니다. <ol><li> 500㎖의 비이커에 탈 이온수 333 ML을 추가합니다. 자기 바 비커를 교반하면서, 주식 솔루션 (각각 99.96 %와 85 %)에서, 프로피온산의 167 μL와 인산 1.08 ml를 추가합니다. </li><li> 천천히 큰 덩어리를 방지, 활성 건조 효모의 77.5 g을 추가합니다. 건조 효모를 용해 후, 자당의 38.8 g을 추가합니다. 참고 : 바로이 구성 요소를 추가 한 후, 발효 시작하기 때문에 자당은 지난 성분을 추가 할 수 있어야합니다. </li></ol></li><li> 즉시 수크로오스를 용해 후 부어면 위에 음식, 그리고 균일하게면을 커버해야합니다. 식품을 오염 실험실에서 탈출 파리 않도록 뚜껑을 플라스틱 용기를 닫는다. </li><li> 70 % 에탄올 5 ㎖과 이전 사이클에서 수확 된 배아 (되지 dechorionated) 1.5 g을 재현 탁. 절반이 필터 논문에서 잘라 내기 및 주걱 또는 다양한 팁 전송 피펫을 사용하여 4 개에 균일하게 생물학적 혼합물을 배포 (필요한 경우 절단). 불린면의 상단에있는 필터 종이를 놓고 뚜껑을 닫습니다. 마지막으로, 번데기 단계까지 플라스틱 RT (24ºC)에서 용기와 습도 (35 %)을 품어. 주 : 플라스틱 용기는 습기 챔버에 배치되어서는 안된다, 그렇지 않으면이 박테리아의 성장을 촉진 할 것이다. </li></ol> 배아에서 파리로 : 사이클의 2 연속. 참고 :주기의이 부분 9 일 후 성인 파리가 등장 할 때까지 하루 1 플라스틱 용기에 배치 된 배아에서 간다번데기에서. 이러한 팔일 동안 아무것도 수행되지 있지만 배아 우화까지 초파리주기의 다음 단계로 진행하는 것이 정확하게 감시 되어야만한다. 애벌레가 죽어가는이 시간 동안 블랙 터닝 시작하면 폼 플러그가 너무 빡빡하지 않은 그 적절한 환기가되어 있는지 확인합니다. 이 기간은 이전 사이클에서 플라이 인구 케이지를 청소하는 좋은 시간이다. <ol><li> 성인 여성이 즉석 식품 (3 단계 참조)로 증착 한 후 관찰 배아는 1 차 령 유충 (24)의 주위에 시간이된다. 그 결과 유충은 성장과 2 차 및 3 차 령 유충에 두 번 털갈이 4 일 동안 1 단계에서 제조 된 플라이 음식에서 공급됩니다. </li><li> 플라이 인구 케이지를 청소합니다. <ol><li> 파리의 활동을 둔화 적어도 30 분 동안 4 ºC에서 케이지를 놓습니다. 케이지의 한 쪽을 덮고 그물을 제거하고, 빠른 움직임, 큰 생물 학적 플라스틱으로 개방 측 캡가방. 가방에 케이지의 내용을 따르십시오. </li><li> 생물 학적 가방은 여전히​​ 케이지의 한면을 덮는으로, 수직으로 아래로 생물 학적 가방면 싱크대 위에 케이지를 놓습니다. 조심스럽게 탈출 파리를 방지하고 생물 학적 폐기물 용기에 폐기 할 수있는 비닐 봉투를 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 작은 구멍을 만드는 싱크대에 파리를 씻어 물 케이지의 내부를 씻어 충분히 상단 그물을 엽니 다. 천천히 구멍의 크기를 증가시키고 케이지 안에 모든 플라이를 제거한다. </li><li> 케이지 물과 비누로 모두 그물을 청소합니다. 그물이 아직 젖어있는 동안 건조 깨끗한 케이지의 양쪽을 확보하고, 마지막으로 케이지에 고집에서 단계 1.1.2에서 제조 된 플라스틱 필름을 방지하는 실험실 담그는 종이, 안에 넣어. 이제 케이지는 다음 사이클에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol></li><li> 나흘 초기 설정 후 애벌레 번데기를 관찰합니다. 유충은 4 일 이상이 단계에서 유지됩니다. 참고 : During이 단계는 번데기는 플라스틱 용기 내부의 전체면의 표면을 커버합니다. </li><li> 첫 번째 파리가 등장 번데기 단계에서와 전에, 플라스틱 용기를 열고 깨끗한 인구 케이지 안에 실험실 술고래 종이 위에 모든 번데기로면을 포함하는 플라스틱 필름을 배치합니다. 이중 매듭 그물을 닫고 플라스틱 용기와 다음주기의 뚜껑을 청소합니다. 참고 : 뚜껑에 부착 번데기가 폐기 및 고온 가압 멸균 또는 우화하기 전에 동결에 의해 파괴해야합니다. </li></ol> 3. 성인 파리. 주 : 번데기의 사일가 번데기에서 등장 할 첫 번째 파리를 무대 후. 24 내 - 48 시간 모든 파리는 eclosed해야합니다. 사이클이 부분에서는 재생에 적합한 환경을 만드는 목적으로 그들에게 음식을 제공하는 것이 중요하다. <ol><li> 당밀 트레이를 준비합니다. <ol><li> 1 L 플라스크에 탈 H 2 O의 556.25 ㎖, 당밀 90 ㎖, 한천 22 g에 겸용. 멋진 30 분 대한 교반 막대와 오토 클레이브 95 % EtOH로 10 % Tegosept의 9.25 ml를 추가합니다. </li><li> 21 X 14.5 cm의 고기 트레이에 혼합물을 부어. 17 트레이 - 볼륨 (15)을 커버하기에 충분히 있는지 확인하십시오. 응고 및 건조를 방지하기 위해 플라스틱 필름으로 각 트레이를 충당하기 위해 20 분 - 10 기다립니다. 1 L 플라스크의 몇몇은 동시에 제조 될 수있다. 필요한 때까지 플라스틱에 싸여 4 ºC에서 당밀 트레이를 저장합니다. </li></ol></li><li> 성인 파리와 케이지 내부 습식 효모으로 덮여 당밀 트레이를 추가합니다. <ol><li> 플레이트를 추가하기 전에 30 분 동안 추운 방에 4 ºC에서 케이지를 놓습니다. </li><li> 비커에 넣고 탈 H 2 O 200 ㎖를 추가하고 숟가락으로 교반하면서 천천히 건조 효모를 붓는다. 혼합물은 약 ​​파리는 음식에 갇히지 않도록 땅콩 버터의 일관성이되면 건조 효모를 첨가 중지합니다. 참고 :이 음식 솔루션이 커버하기가 매우 어려울 것이다, 그렇지 않으면 응고 허용하지 않는 것이 중요합니다당밀은 트레이 및 수확 과정 (4.3 절 참조) 동안 계란의 압축을 풉니 다. </li><li> 하나 당밀 트레이에서 플라스틱 필름을 제거하고 숟가락이나 주걱을 사용하여 신선한 준비 젖은 효모의 층으로 그것을 커버. 전체 표면이 포함되어 있는지 확인합니다. </li><li> 케이지가 추운 방에있는 동안, 그물을 열고 조심스럽게 케이지에 젖은 효모와 당밀 트레이를 추가 할 수 있습니다. 그물을 닫고 실온에서 케이지를 놓습니다. 참고 : 삽입시 빈 고기 트레이와 함께 접시를 커버하는 것이 유용 할 수 있지만, 당밀 트레이에 파리의 접근을 차단하지 않도록 할 수있다. </li></ol></li><li> 너무 건조 얻을 수있는 효모를 방지하기 위해 48 시간 - 식품 판 매 (24)을 변경합니다. 성인 파리는 탈수에 매우 민감하다. </li></ol> 사이클 4. 끝 : 배아를 수확 참고 : 최고의 비행 출산율이 3 - 우화 후 5 일. 따라서이 기간 동안 수확이 최고의 배아 수율을 얻을 것이다. 후 원하는 컬렉션은 공단입니다테드는주기가 끝났습니다. 파리 희생과 같이 청소 케이지 단계 2.2에서 지정해야합니다. <ol><li> 일반적으로 2 일 파리 우화 후, 섹션 3.2.5에 설명 된대로 새 당밀은 케이지에 신선한 젖은 음식 트레이를 소개합니다. 손가락의 도움으로, 계란 성막의 수율을 증가시키기 위해, 가능한 한 습윤 효모의 표면이 불규칙하게. 오래 된 음식 트레이가 케이지에있는 경우, 새로운 판을 추가하기 전에, 조심스럽게 제거하고 생물 학적 가방에 폐기. 수율을 증가시키기위한 또 다른 끝은 모든 계란 식품에 배치 될 수 있도록면 층을 제거하는 것이다. RT에서 케이지를 유지한다. </li><li> 작은 하얀 점으로 배아를 관찰한다. 참고 : 달걀 수집 할 준비가 된 것입니다. 플라이 케이지의 일상적인 유지 보수를 들어, 이일 수집은 권장되는 시간입니다. 이 컬렉션은 주로 배아 거의 1 차 령 유충이 포함됩니다. 다양한 이거에 대한 수확 배아의 전형적인 수율에 대한 대표적인 결과보기ction 시간을 가리 킵니다. </li><li> 배아를 수확 <ol><li> 약 30 분 동안 차가운 방에 케이지를 놓습니다. 섹션 1에서 설명한 바와 같이 그 동안 다음 사이클의 플라스틱 용기와 플라이 음식을 준비합니다. </li><li> 8 L 오토 클레이브 트레이에서 총 용​​량의 ¼하고 10 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가 물을 추가합니다. 케이지가 추운 방에있는 동안주의 깊게 당밀 플레이트를 제거하고 생물 학적 가방 안에 넣습니다. </li><li> 가방에서 트레이를 제거하고 오토 클레이브 트레이에 세제 용액에 (탈출 파리를 방지하기 위해) 빨리 잠수함. 생물 학적 가방을 닫고 생물 학적 용기에 넣어. 파리는 세제를 포함하지 않는 물에서 익사하지 않습니다. </li><li> 당밀 떨어져 배아 및 효모를 씻어 큰 페인트 브러시와 증류수 총을 사용합니다. 생물 학적 상자에 접시와 당밀을 폐기하십시오. </li><li> 세 체 세트 (아래에 굵은 체 위에 30, 40 중간에, 100)을 통해 조심스럽게 솔루션을 붓는다. 세척 덩어리 오n은 증류수 총을 가진 최상위은 덩어리가 남아 있지 않을 때까지. 참고 : 성인 날아와 3 차 령 유충이 체 (30)에 유지됩니다. <ol><li> 증류수로 오토 클레이브 트레이를 씻어하고 체를 통해 헹굼 물을 부어. 효모 덩어리가 남아 있으면 상단 체를 반복 처리를 제거합니다. 1 차와 2 차의 령 유충의 모든의 대부분은 체 (40)에 남아있게됩니다. </li></ol></li><li> 두 번째 체를 제거합니다. 세 번째 (아래) 체의 황색 물질은 배아 작은 1 차 령 유충의 혼합물이다. 체의 한쪽면에 모든 계란을 이동 증류수 총을 사용합니다. 주걱으로 그들을 수집하고 무게. </li><li> 이러한 사이클 동안 배아의 수집 수율은 / 유충은 7 사이에 13 g의 범위이다. 새로운 사이클 (섹션 1) 시작이 물질의 1.5 g을 사용합니다. 추가 처리를 위해 배아의 나머지 부분을 사용하거나 폐기 할 수있다. </li></ol></li></ol> 제 1 항에있어서,처리 주 : 인구의 계속을 위해 사용되지 않은 배아는 대안 적 실험에 즉시 사용하거나 할 수는 -80 ºC에서 동결 할 수 있습니다. 두 옵션의 경우, 배아 먼저 dechorionated해야 할 수도 있습니다. <ol><li> dechorionation를 들어, 50 % 표백제 용액에서 2 분 동안 배아를 씻어 증류수로 철저히 씻어. </li><li> 종이 타월로 단단히 눌러 배아 먼저 건조를 동결 한 후 15 또는 50 ML 원뿔 튜브에, 주걱의 도움으로, 그 무게 및 배치합니다. 마지막 몇 초 동안 액체 N 2 원뿔형 튜브 잠수함. </li></ol>

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저자는 공개할 것이 없습니다.

재료 하나의 1.5 g로 시작하는 사이클 당 7, 13 g 사이에 수집 된 배아의 수율을 얻을 수 있습니다. 이러한 물질의 양을 얻기 위하여는 플라이주기의 모든 단계에 적합한 배양 조건을 유지하는 것이 중요하다. 가장 중요한 파라미터는 각각 24 ºC 35 %이어야한다 온습도이다. 이러한 두 파라미터는 랩의 정상적인 환경에서 일정하게 유지 될 수 없다면, 하나의 가능성은 인큐베이터 또는 환경 챔버로 즉시 케이지를 배치하는 것이다. 다른 프로토콜은 생산 계란 9, 10의 수율을 높이기 위해 70 %의 습도도 일정하게 24 시간 명암주기를 권장합니다. 그러나 약 35 %의 습도를 유지하는 세균 오염을 방지하고,이 프로토콜의 목적은 인구 케이지의 유지가되기 때문에, 파리는 실험실의 정상적인 광 환경에서 유지된다. 또 다른 중요한 점은 디를 유지하는 것입니다성인에 sturbances는 가능한 한 낮게 날아갑니다. 다른 플라이에서 교차 오염을 방지하기 위해 비행 공간에서 별도의 위치에 케이스를 유지하는 것이 바람직 할 수있다. 그들의 순수성을 유지하기 위해 그들은 많은 인구 케이지 (14)에 뚜렷한 이상 짝짓기 행동을 나타낼 수있다 매우 어렵 기 때문에 형질 전환 및 돌연변이 초파리의 큰 인구의 배양은하지 않는 것이 좋습니다. 한 가지 문제점은 대량 초파리 배양하면서 음식에 대해 경쟁하기 때문에 제조 계란의 수율을 감소 진드기 및 / 또는 몰드와 같은 다른 생물체의 존재이다. 이를 방지하기 위해서는 깨끗하고 모든 장비를 유지 케이지, 그물을 씻는 물과 비누, 모든 사이클 후 일회용 재료 (발포 플러그) 폐기와 함께 상자를 비행하는 것이 매우 중요합니다. 스텝 플라이 음식을 준비 할 때 증가하는 금형을 줄이기 위해, 프로피온산 인산 습식 효모에 첨가당밀을 준비 1.2 Tegosept 단계 3.1 트레이. 시간이 짧고 재료는 즉시 세척 할 수없는 경우 그러한 -20 ˚C에서 플라스틱 상자 또는 자체로 장소 물질에 때때로 도움이됩니다. 배아는 즉시 상자에 파종 마지막 수거 일 끝나는 때부터 15 일 - 전체 콜렉션주기 (14)에서 발생합니다. 이 기간 동안,이 프로토콜 섹션에서 자세한 인구 플라이 케이지의 유지 보수 (그림. 2)에 필요한 모든 단계를 기억하기 위해 일정을 구성하는 것이 좋습니다. 성인 초파리 등장까지 계란, 시딩있는 일로부터, 단지 플라스틱 상자를 검사 할 필요가 있고, 번데기가 발생하면 케이지 내부에 이들을 배치. 배아는 새로운 사이클 시딩까지 3 일 - 그 후, 파리 매 2를 공급해야한다. 전체 프로토콜에서 가장 긴 날은 새로운주기를 시작하는 배아의 수집 및 시드 중입니다. 에이오일 성인 우화 후, 마지막으로 이일 이후 감소 - 프로토콜에 댓글 S, 최고의 계란 생산량은 3입니다. 이것은 계란의 수확이 수행 될하는 일을 선택하기 위해 우리에게 약간의 유연성을 제공합니다. 어떤 이유로 수집 배아 수율 원하는 개시 량 (1.5 g)보다 작은 경우, 하나는 항상 새로운 당밀 트레이를 추가하고 더 알 다음날 수집 할 수있다. 일정한 컬렉션 들어, 평행이 케이지를 유지하도록 권장되고, 배아의 높은 양이 요구되는 경우에, 또한 큰 케이지를 사용하는 것이 가능하다. 단시간 컬렉션을 수행하는 경우, 수율을 증가시키는 하나의 방법은 아침에 알을 낳는 버스트를 활용하는 것이다. 다양한 발달 단계의 대량 수집 많은 장점이있다. 예를 들어, 인구 케이지에서 수집 된 배아는 면역 분석 6-8, 대량 collectio 매우 성공적으로 사용되어왔다해리 유충에서 애벌레 조직, n은 3C 실험 4 및 RNA 준비 (15)에 대해 아주 좋은 소스로 보여 주었다, 성인 파리에서 헤드는 칩 실험 (16)을 위해 이용되고있다. 또한, 성인은 종종 조직 배양 플라이 (17)를 추출 할 필요가있다. 케이지의 가장 유망한 애플리케이션 중 하나는 병원체, 생물학적 분자, 화학 물질 및 전리 방사선의 노출에 반응하여 유전자 전 사체, 단백질 대사 산물의 분석 및 선별을 허용 높은 처리량 검정법을위한 재료를 제공하는 것이다. 이러한 대규모 분석에서 많은 개인이 필요하고, 여기에 설명 된 플라이 인구 케이지는 분석 및 18 스크리닝 초파리 생활주기의 다른 단계 동안 물질의 다량을 얻기 위해 매우 도움이 될 수있다.

유전 적, 생화학 적 접근 방식을 결합하는 능력은 초파리에게 생화학 및 분자 생물학 연구 1-3에 특히 적합한 유기체했다. 이러한 연구들은 성인 초파리에서, 또한 유생 4, 5 및 번데기 배아 6-8에서뿐만 아니라 생체 재료의 많은 양을 필요로한다. 제품을 다량을 얻기 위해, 연구진은 &quot;인구 케이지를&quot;비행로 알려진 대형 컨테이너를 사용하여 배양 파리 있습니다. 이 케이지 탈출 파리없이 케이지 내의 음식의 도입을 허용하기 위해 양쪽에 순으로 덮여 플라스틱 실린더로 구성된다. 이 케이지는 9-11 제이나 (특정 재료 / 장비의 표 참조) 회사에서 구입 할 수있다. 파리 많은 성장이 시스템을 사용하는 주요 장점은 과일의주기 (12)는 모든 파리 재 발전하는 방식으로 제어 될 수 있다는 비행latively 방식으로 동기화. 이 동기는, 새로운 배아 시드 유충 / 파리를 공급하고 정확한 시간에 성인 파리를 희생함으로써 달성된다. 동기화 된 플라이 인구를 사용하여 개발 연구 (13)에 특히 유용합니다. 몇 파리에서 새로운 인구 케이지의 시작 증폭 9-11의 많은 사이클을 요구하는 시간 소모적 인 과정이다. 심지어 플라이 문화 병 또는 minicages 같은 큰 용기를 사용하여, 전체 프로세스는 몇 달 동안 지속될 수 있습니다. 단계를 소비하는이 시간을 피하기 위해, 많은 초파리 실험실은 정기적으로 같은 새장을 유지한다. 이미 설립 인구 케이지에서 배아 컬렉션에서 시작하는 새 케이지를 시작하는 것이 가장 편리합니다. 일반적으로 대부분의 실험실이 원고 플라이 인구 새장을 유지하기 위해 상세한 프로토콜을 제공합니다 같은 오레곤 R 또는 광저우 S. 등의 야생형 인구 케이지를 유지한다.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Beckton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Curity 실용적인 면봉</td><td>Kendall</td><td>2287</td><td></td></tr><tr><td>건조 효모</td><td>Affymetrix</td><td>23540</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>1001-085</td><td></td></tr><tr><td>폼 튜브 플러그</td><td>Jaece</td><td>L800-D2</td><td>50mm 직경 x 55mm 길이</td></tr><tr><td>플라이 인구 케이지</td><td>플라이스터프</td><td>59-116</td><td>9&프라임; 지름 x 14.4&프라임; 길이. 케이지용 그물이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>고기 트레이</td><td>Genpak</td><td>1002S (#2S)</td> <td>8.25 x 5.75 x 0.5 인치</td></tr><tr><td>당밀</td><td>할머니&acute; s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 용기</td><td>Rubbermaid</td><td>4022-00</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 필름</td><td>Glad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific S</td><td>93326</td><td>독성. 화학 후드</td></tr><tr><td>프로피온산</td><td>Fisher Scientific</td><td>A258-500</td><td>독성 핸들. 화학 후드</td></tr><tr><td>핸들 스테인리스 스틸&nbsp; 체 #100</td><td>VWR</td><td>57324-400</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸&nbsp; 체 #40</td><td>VWR</td><td>57324-272</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸&nbsp; 체 #30</td><td>VWR</td><td>57324-240</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>MP</td><td>152584</td><td></td></tr><tr><td>Tegasept</td><td>LabScientific</td><td>FLY5501</td><td></td></tr><tr><td>트리톤-X100</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

(a)의 유지 보수<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 인구 케이지

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

많은 양의 DNA, RNA, 단백질 및 기타 세포 구성 요소가 생화학 및 분자 생물학 실험에 필요한 경우가 많습니다. 초파리의 짧은 수명 주기로 인해 배아, 유충, 번데기 및 성충 파리에서 동기화된 방식으로 저렴한 경제적 비용으로 많은 양의 물질을 수집할 수 있습니다. 많은 수의 파리를 번식시키기 위한 주요 전략은 파리 개체군 케이지를 사용하는 것입니다. Drososphila 커뮤니티에서 유용하고 일반적인 이 도구는 원하는 발달 단계의 균일성에 따라 정기적으로 밀리그램에서 수십 그램의 배아를 생산하는 효율적인 방법입니다. 개체군 케이지는 설치하는 데 시간이 많이 걸릴 수 있지만 몇 달 동안 케이지를 유지 관리하면 시간이 훨씬 단축되고 단기간에 생물학적 물질을 빠르게 수집할 수 있습니다. 이 논문은 이전 주기에서 수확된 물질 1.5g으로 시작하여 Drosophila melanogaster 개체군 케이지의 유지 관리를 위한 상세하고 유연한 프로토콜을 설명합니다.

플라이 케이지 인구의 유지는 플라이주기에 기초한다. 따라서, 플라스틱 용기 (그림 1A)를 배아 및 유충의 초기 생물학적 혼합물을 배치 한 후 수정란이 더 이상 2 일 이상에서 애벌레가되고 애벌레가 4 일 동안 성장할 것입니다, 상대적으로 (다른 령 애벌레 단계를 통해 동기화 ) 그림 1B를 참조하십시오. 애벌레는 3 차 령 애벌레 단계를 완료 한 후 그들은 번데기와 덮개 (그림 1C)의 내부 표면에 일부와 플라스틱 용기 안쪽면의 표면을 커버합니다. 파리의 변태 과정을 마칠 때까지이 번데기 기간은 다음 4 일 동안 이동합니다. 이 기간 동안은 강하게 케이지에 파리를 전송하는 것이 좋습니다. 애프터 (10) - 첫 번째 성인 파리는 일 9시 eclose 시작합니다주기 (그림 1D)의 하루 (11) 모두에 의해 개시는 번데기에서 등장 할 것이다. 오일 우화 (15 일 13) 후 마지막으로 (7 일 우화 후) 하루 17 감소 - 배아 컬렉션의 최고 수율은 3 얻을 수있다. 따라서, 하루 13에서 신선한 음식의 마지막 트레이를 추가하고 하루에 15에서 계란 (그림 1E와 F)를 수집하는 것이 좋습니다. 이것은 배아의 최대 개수를 수집 할 수 있습니다. 6 개의 연속 사이클 모음의 수율은 사이클마다 1.5 g의 출발 물질을 수거 배아의 수율을 감소시킬 것이다 결과적으로 음식이 너무 건조 당할 수 수집 전에 제 여분 하루. 표 1 쇼 추가하고,도 2 전체 사이클 수집을위한 권장 일정입니다. 재료는 이일에 수확60; 기간은 주로 배아로 구성되어있다. 그러나 유충 소수도 존재한다. 비동기 성 어느 정도 예상되기 때문에 케이지 유지 보수 목적이 유충은 문제가되지 않습니다. 그럼에도 불구하고 일부 생화학 실험이 배아의 순도는 매우 중요하지만, 동시에 이러한 실험을 수행하기 위해 계란을 다량를 수집 할 필요가있다. 이 때문에 여러 단편 연속 콜렉션 빠르게 실온에서 음식과 함께 새로운 플레이트를 추가 한 후,이 방법으로 얻을 수있는 수율 및 순도의 평가를 제공하기 위해, 1 시간 및 3 시간에서 수행 하였다 (표 2 및도 3) . 1 시간 연속 컬렉션은 매우 낮은 수율 (14.5 mg)을하지만 수집 때마다 증가 배아의 수량하지만 마지막에 시작했다. 파리는 음식을 변경하지만 나중에 acclimating의 과정에서 강조되는에 처음에는 낮은 수율이 원인 일 수 있습니다. 한편, 더 LAR 없다VAE 짧은 모음 높은 순도를 수득 것을 보여주는 다섯 연속 콜렉션 (도 3A)에서 관찰되었다. 면이 케이지로부터 제거되지 않으면, 이전 시점에서 애벌레 가능성이 남아 신선한 플레이트 증가 들어갈 것이다. 면이 제거 된 경우에도 항상 유충 케이지 측에 걸어하고 수집하는 동안 음식을 입력한다. 3 시간 연속 컬렉션의 경우, 수율은 840에서 약 1 시간 컬렉션에서 얻은 수익률보다 10 배 이상 1,250 ㎎,였다. 이들 태아의 순도 100 % (도 3B) 근방이었다. 가끔 유충 관찰되었다. 일부 개발 연구는 수집 된 배아에 대한 매우 엄격한 동기화를 필요로한다. 동기화 순도를 높이기 위해, 조건이 적합하지 않은 경우, 여성이 더 성숙 계란을 유지하고 입금 할 수 있기 때문에 첫 컬렉션 판을 폐기하는 것이 좋습니다조건은 신선한 플레이트의 도입으로 개선 m. 또한 그것은 나이가 성인 파리 (&gt; 육일가​​) 덜 동기화 된 배아를 생산하는 것을 아는 것이 중요합니다. 높은 정밀도로 동기화의 정도를 확인하기 위해 수집 된 배아의 DAPI 염색을 권장합니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig1.jpg" /> 그림 1. 플라이 인구 케이지의 초파리 melanogaster의 수명주기는. 사이클의 (A) 개시는 플라스틱 상자 용기에 배아의 1.5 g을 시드. 참고로, 하판에 여과지의 길이가 8.5 cm이다. (B) 유충 비교적 오일 순환 개시 후 동기화 성장. 일에서 8 (C)는, 파리의 대부분은 번데기 단계에있다. B (B &#39;)와 C의 낮은 패널<html> (C &#39;)는 상단 패널에 표시된 영역의 배율입니다. (D) 성인 파리 10 일주기 시작 후 번데기에서 등장. (E) 성인 즉석 식품 15 일째에, 황색 물질 배아를 수집하는 프로세스를 시작하기 전에 모집단 케이지 안에 파리 수정란이다. 100 굵은 체의 하단에 수집 (F) 태아 (몇 유충), 전체 케이지주기 후. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53756/53756fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig2.jpg" /> 그림 2. 전체 사이클 컬렉션 일정. 그림 2는 완전한 사이클 수집을위한 권장 일정을 보여줍니다.<html> t = &quot;_ 빈&quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/53756/53756fig3.jpg" /> 그림 1 시간, 3 시간 연속 컬렉션의 3. 순도. 1 시간 (A)과 음식의 새로운 트레이를 추가 한 후 3 시간 (B)에서 수집 된 배아의 대표 이미지입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53756/53756fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table><tbody><tr><td> 사이클 수 </td><td> 수율 (g) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> (2) </td><td> 9.5 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 12.7 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> (10) </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 7.1 </td></tr></tbody></table>&quot;FO : 유지-together.within 페이지를 =&quot;ntent. 1 &quot;은&gt; 여러 사이클 컬렉션 표 1. 수율 표 1은 1.5 g의 출발 물질 6 연속 사이클 컬렉션의 수율을 보여줍니다 각주기에서 마지막. 음식의 트레이 날 (13)에 첨가하고, 수확은 하루에 15에서 이루어졌다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 컬렉션 # </td><td> 모음의 길이 (시간) </td><td> 수율 (mg)을 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 14.5 </td></tr><tr><td> (2) </td><td> 1 </td><td> 21.6 </td></tr><tr><td> 삼 </td><td> 1 </td><td> 56.1 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 1 </td><td> 160.1 </td></tr><tr><td> (5) </td><td> 1 </td><td> 106.1 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 삼 </td><td> 960 </td></tr><tr><td> (2) </td><td> 삼 </td><td> (840) </tD&gt; </tr><tr><td> 삼 </td><td> 삼 </td><td> 1,250 </td></tr></tbody></table> 표 2. 1 시간, 3 시간 연속 컬렉션의 수율. 표 2는 새로운 당밀 판을 배치 한 후 새로운 음식과 3 연속 컬렉션 3 시간을 추가 한 후 1 시간 5 연속 컬렉션의 수율을 보여줍니다.

이 원고는 파리 개체군 케이지를 사용하여 정기적으로 Drosophila melanogaster 개체군을 배양하기 위한 자세한 프로토콜을 보고합니다.

(A)의 유지 보수<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 인구 케이지

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...

본 논문에서 우리는 초파리 개체군 케이지를 유지하기 위한 상세하고 유연한 프로토콜을 설명합니다. 이는 수 밀리그램에서 수십 그램의 배아, 유충, 번데기 및 성체 초파리를 정기적으로 생산할 수 있는 효율적인 방법입니다. 이렇게 수집된 초파리들은 생화학 및 분자생물학 실험에 필요한 다량의 DNA, RNA, 단백질 및 기타 유사 성분을 얻기 위한 공정에 투입됩니다.개체군 케이지를 설치하는 데 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 하지만 수개월 동안 케이지를 유지하면 시간을 절약할 수 있으며, 짧은 기간 내에 생물학적 재료를 빠르게 수집할 수 있습니다. 먼저, 플라스틱 용기 뚜껑에 2x2 cm 크기의 정사각형 구멍 세 개를 뚫어 플라스틱 용기를 준비합니다.폼 플러그가 단단히 고정될 수 있도록 각 구멍의 네 모서리에 3/4인치 라벨링 테이프를 붙입니다. 그런 다음 각 구멍에 폼 플러그를 하나씩 넣습니다. 용기 내부를 플라스틱 랩으로 덮습니다.이 필름 위에 솜 층을 추가하여 플라스틱 용기의 바닥을 덮고, 넘치는 부분의 솜은 떼어냅니다. 다음으로, 500ml 비커에 333 milliliters의 탈이온수를 넣어 초파리 먹이 준비를 진행합니다. 화학 후드 내에서 마그네틱 바를 이용해 용액을 교반하며, 스톡 용액으로부터 167 microliters의 프로피온산과 1.08 milliliters의 인산을 첨가합니다.큰 덩어리가 생기지 않도록 주의하며 활성 건조 효모 77.5 grams를 천천히 넣습니다. 건조 효모를 용해시킨 후, 마지막으로 sucrose 38.8 grams를 넣습니다. sucrose가 용해된 직후, 신선한 배지를 솜 위로 붓습니다.탈출한 파리가 먹이를 오염시키는 것을 방지하기 위해 플라스틱 용기의 뚜껑을 닫기 전, 솜을 고르게 덮으십시오. 이전 주기에서 얻은 가장 단단한 id nondi coronated 배아 1.5 g을 현수합니다. 거름종이 두 장을 반으로 자르고, 스패출러를 사용하여 생물학적 혼합물을 네 조각 위에 고르게 분배합니다.적신 솜 위에 여과지를 올리고 뚜껑을 닫습니다. 마지막으로 플라스틱 용기를 번데기 단계가 될 때까지 배양합니다. 배아가 1령 유충이 되는지 관찰하십시오.결과적으로 생성된 유충은 효모 혼합물을 먹으며 성장하고, 두 번의 탈피를 거쳐 2령 및 3령 유충이 됩니다. 성장 기간 동안, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 상세히 설명된 대로 초파리 개체군 케이지를 청소하십시오. 초기 설정 4일 후, 유충이 번데기가 되는 것을 관찰하십시오.유충은 이 단계에서 4일 더 머무르게 됩니다. 첫 번째 파리가 출현하기 전, 플라스틱 용기를 열고 모든 번데기가 들어 있는 솜이 담긴 플라스틱 필름을 깨끗한 집단 케이지 내부의 실험실 흡수지 위에 놓습니다. 미리 준비한 당밀 혼합물을 마그네틱 바를 이용하여 30분 동안 자동 교반합니다.혼합물을 냉각시키고 당밀 혼합물에 Tegosept 용액을 첨가합니다. 다음으로, 혼합물을 21x14.5 cm 육류 트레이에 붓습니다. 16개의 트레이를 채울 수 있는 충분한 부피인지 확인하십시오.당밀이 응고될 때까지 최대 20분 동안 기다리고, 건조를 방지하기 위해 각 트레이를 플라스틱 필름으로 덮습니다. 그 후 사용 시까지 트레이를 4 degrees Celsius에서 보관합니다. 비커에 200 milliliters의 탈이온수를 넣고, 숟가락으로 저으면서 건조 효모를 천천히 붓습니다.혼합물이 피넛 버터 정도의 점도에 도달하면 드라이 이스트 추가를 중단하여 초파리가 먹이에 달라붙는 것을 방지하십시오. 당밀 트레이 하나에서 플라스틱 필름을 제거하고, 숟가락이나 스패튤라를 사용하여 갓 준비한 습성 이스트 층으로 덮어줍니다. 표면 전체가 완전히 덮였는지 확인하십시오.초파리가 더 이상 날지 않도록 케이지를 4°C의 냉장실에 최대 30분 동안 둡니다. 케이지가 냉장실에 있는 동안 망을 열고, 젖은 효모가 담긴 당밀 트레이를 케이지 안에 조심스럽게 넣습니다. 망을 닫고 케이지를 상온에 둡니다.우화 2일 후, 신선한 습식 먹이가 담긴 새로운 당밀 트레이를 케이지에 넣어줍니다. 산란량을 늘리기 위해 습식 효모의 표면을 최대한 불규칙하게 만듭니다. 케이지는 실온에서 유지합니다.배아가 작은 흰색 점으로 보일 때 수집할 준비가 된 것입니다. 배아를 수확하려면 케이지를 저온실에 최대 30분 동안 두어 파리를 진정시키십시오. 다음 주기를 위한 플라스틱 용기와 파리 먹이를 준비하십시오.다음으로, 8L 오토클레이브 트레이에 전체 용량의 4분의 1까지 물을 채우고 10% Triton X-100 1mL를 추가합니다. 케이지가 콜드룸에 있는 동안 몰라세스 플레이트를 조심스럽게 꺼내 바이오해저드 백 안에 넣습니다. 백에서 트레이를 꺼내 오토클레이브 트레이 내의 세제 용액에 빠르게 담근 후, 바이오해저드 백을 닫고 이를 바이오해저드 폐기물 함에 넣습니다.증류수 건을 사용하여 당밀에서 배아와 효모를 씻어냅니다. 플레이트와 당밀은 바이오하자드 폐기물 상자에 버립니다. 용액을 3단 체 세트에 조심스럽게 붓습니다.증류수 건을 사용하여 상단 층의 덩어리들이 더 이상 남지 않을 때까지 씻어냅니다. 오토클레이브 트레이를 증류수로 헹구고, 헹굼물을 체에 붓습니다. 상단 체를 제거합니다.대부분의 1령 및 모든 2령 유충은 40번 체에 남게 됩니다. 두 번째 체를 제거하십시오. 세 번째 체에 남은 노란색 물질은 배아와 작은 1령 유충의 혼합물입니다.증류수 건을 사용하여 모든 알을 체의 한쪽으로 몰아줍니다. 그다음 스패튤라로 알을 모아 무게를 잽니다. 새로운 사이클을 시작하려면 1.5 g을 사용하십시오.남은 배아는 추가 공정에 사용하거나 폐기하십시오. 1.5 g의 출발 물질로부터 6회 연속 사이클을 수집하였으며, 사이클당 평균 10 g의 배아와 유충을 얻었습니다.새 먹이를 추가한 1시간 후의 5회 연속 수집량과, 새로운 당밀 플레이트를 배치한 3시간 후의 3회 연속 수집량이 제시되어 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 초파리(Drosophila melanogaster) 집단을 플라이 팝퓰레이션 케이지(fly population cage)를 사용하여 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

maintenance-of-a-drosophila-melanogaster-population-cage

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

과학자들은 초파리 수명 프로토콜을 사용하여 다양한 실험 조건이 파리의 수명에 어떤 영향을 미치는지 측정하고 그 과정에서 생존 곡선을 생성하여 실험 결과를 정량화합니다. 샘플 프로토콜은 17-α-에티닐에스트라디올(EE2)과 같은 다양한 농도의 내분비 교란 물질 화학 물질(EDC)에 대한 노출이 수명에 미치는 영향을 연구하기 위해 적용되는 분석을 특징으로 합니다.

Drosophila melanogaster의 수명 프로토콜: 파리 수명의 차이를 식별하기 위한 생존 곡선 생성

초파리 melanogaster의는 자발적인 운동 활성 등의 행동에 영향을 미치는 유전 적 또는 환경 적 조작을 공부에 유용하다. 여기에서 우리는 적외선 빔과 자발적인 운동 활성을 정량화하는 데이터 분석 소프트웨어와 함께 모니터를 활용하는 프로토콜을 설명합니다.

의 자발적인 운동 활성의 결정<em&gt; 초파리</em

기계감각에 영향을 미치는 새로운 돌연변이를 식별하기 위해 MARCM 방법에 의해 생성된 돌연변이 클론에서 파리 강모의 촉각 자극에 대한 행동 반응을 측정하는 분석을 설계했습니다. 이 기술의 결합을 통해 그렇지 않으면 치명적일 수 있는 기계민감성 돌연변이를 식별할 수 있습니다.

의 Mechanosensation에 대한 행동 분석 클론의 MARCM은 기반<em&gt; 초파리</em

무균 및 무균 조건에서 초파리 melanogaster의를 양육하는 방법이 제공된다. 플라이 배아는, 차아 염소산 나트륨에 dechorionated 멸균 다이어트에 무균 적으로 전송하고, 밀폐 용기에 양육된다. 박테리아와식이 요법과 배아를 접종은 무균 협회에 이르게하고, 세균의 존재는 전신 초파리 균질 도금에 의해 확인된다.

과일 비행을 양육<em&gt; 노랑 초파리</em&gt; 무균 및 무균 조건에서

이 프로토콜에는 구두 노출 및 감염 세균성 병원 체, 과일 파리 초파리 melanogaster 하 고 전염 성 박테리아 헛간 창 자 감염을 다음의 수를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 비행 생존 다음 구강 세균 감염에 면역 돌연변이의 효과 설명 합니다.

세균성 감염 및 Shedding 초파리 melanogaster 에

이 절차의 전체 목표 설정, 유지 및 연구 설정에서 Eristalis tenax 의 포로 인구를 새로 것입니다.

양육 및 조사 연구에 대 한 Eristalis tenax Hoverflies의 유지 보수 장기

내분비 파괴 물질 (EDC)은 유기체와 자연 환경에 심각한 문제를 나타냅니다. 드로소필라 멜라노가스터는 생체 내에서 EDC 효과를 연구하는 이상적인 모델을 나타낸다. 여기에서, 우리는 Drosophila에 있는 내분비 중단을 조사하는 방법을 제시합니다, fecundity에 EDC 효력을, 비옥, 발달 타이밍 및 비행의 수명을 해결하.

초파리 멜라노가스터에서 내분비 장애를 테스트하는 방법

이 프로토콜은 배아에서 성인에 이르기까지 모든 발달 단계에서 Drosophila의 생존 가능성을 평가하기 위해 고안되었습니다. 이 방법은 상이한 유전자형 또는 성장 조건의 생존 가능성을 결정하고 비교하는 데 사용될 수 있다.

초적혈구 멜라노가스터의생존능력을 배아에서 성인으로 평가하는 직접적이고 간단한 방법

이 문서에서 우리는 세번째 instar Drosophila의 유충에서 중추 신경계를 해부하다하는 방법을 보여줍니다.

Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

에서 복잡한 운전하는 동작의...

성인 Drosophila Melanogaster의 로코의 고해상도 비디오 추적

학습하세요 Drosophila melanogaster 인구 케이지 유지 보수 방법을. 효율적으로 배아와 유충을 수집하여 생화학 및 분자생물학 실험에 필요한 DNA, RNA, 단백질을 대량 생산할 수 있습니다.

(A)의 유지 보수

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