Name: 에 수용성 화합물로 SCA1 마우스 치료가 아닌 것은 - 특히 미토콘드리아 기능 향상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: 학습하세요 SCA1 마우스에서 수용성 미토콘드리아 활성제의 치료 효과를 평가하는 행동 및 조직학적 분석 방법을. 이 기법은 소뇌 퇴행성 질환 연구에 활용됩니다.

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형질전환 마우스를 아낌없이 선물해 주신 미네소타 대학의 Harry Orr 박사님께 감사드립니다. 또한 이전 실험을 수행한 Skidmore College 졸업생인 Monica Villegas, Porter Hall, Mitchell Spring, Nicholas Toker, Jenny Zhang, Chloe Larson 및 Cheyanne Slocum에게도 감사드립니다. 또한 이러한 방법의 개발에 자금을 지원해 주신 Skidmore College에 감사드립니다.

<ol><li>Stucki, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+impairments+contribute+to+Spinocerebellar+ataxia+type+1+progression+and+can+be+ameliorated+by+the+mitochondria-targeted+antioxidant+MitoQ%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ.</a> Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).</li>
<li>Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+mitochondrial+dysfunctions+in+the+brain%2C+from+mice+to+men%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Modeling mitochondrial dysfunctions in the brain, from mice to men.</a> J Inherit Metab Dis. 35 (2), 193-210 (2012).</li>
<li>Breuer, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+OXPHOS+dysfunction+in+the+development+of+neurologic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial OXPHOS dysfunction in the development of neurologic diseases.</a> Neurobiol Dis. , (2012).</li>
<li>Hroudová, J., Singh, N., Fizar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunctions+in+neurodegenerative+diseases%2C+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunctions in neurodegenerative diseases, relevance to Alzheimer's disease.</a> Biomed Res Int. 2014, 175062(2014).</li>
<li>Burright, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCA1+transgenic+mice%2C+a+model+for+neurodegeneration+caused+by+an+expanded+CAG+trinucleotide+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SCA1 transgenic mice, a model for neurodegeneration caused by an expanded CAG trinucleotide repeat.</a> Cell. 82 (6), 937-948 (1995).</li>
<li>Clark, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cell+expression+of+a+mutant+allele+of+SCA1+in+transgenic+mice+leads+to+disparate+effects+on+motor+behaviors%2C+followed+by+a+progressive+cerebellar+dysfunction+and+histological+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Purkinje cell expression of a mutant allele of SCA1 in transgenic mice leads to disparate effects on motor behaviors, followed by a progressive cerebellar dysfunction and histological alterations.</a> J Neurosci. 17 (19), 7385-7395 (1997).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Deng-Bryant, Y., Singh, I. N., Carrico, K. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+tempol%2C+a+catalytic+scavenger+of+peroxynitrite-derived+free+radicals%2C+in+a+mouse+traumatic+brain+injury+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of tempol, a catalytic scavenger of peroxynitrite-derived free radicals, in a mouse traumatic brain injury model.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1114-1126 (2008).</li>
<li>Vaishnav, R. A., Singh, I. N., Miller, D. M., Hall, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+peroxidation-derived+reactive+aldehydes+directly+and+differentially+impair+spinal+cord+and+brain+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Lipid peroxidation-derived reactive aldehydes directly and differentially impair spinal cord and brain mitochondrial function.</a> J Neurotrauma. 27 (7), 1311-1320 (2010).</li>
<li>Matthews, R. T., Yang, L., Browne, S., Baik, M., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+administration+increases+brain+mitochondrial+concentrations+and+exerts+neuroprotective+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 administration increases brain mitochondrial concentrations and exerts neuroprotective effects.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (15), 8892-8897 (1998).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+of+creatine+in+a+transgenic+mouse+model+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects of creatine in a transgenic mouse model of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 20 (12), 4389-4397 (2000).</li>
<li>Ferrante, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+effects+of+coenzyme+Q10+and+remacemide+in+transgenic+mouse+models+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Therapeutic effects of coenzyme Q10 and remacemide in transgenic mouse models of Huntington's disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1592-1599 (2002).</li>
<li>Hersch, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creatine+in+Huntington+disease+is+safe%2C+tolerable%2C+bioavailable+in+brain+and+reduces+serum+8OH2%27dG%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Creatine in Huntington disease is safe, tolerable, bioavailable in brain and reduces serum 8OH2'dG.</a> Neurology. 66 (2), 250-252 (2006).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+with+coenzyme+Q10+and+creatine+produces+additive+neuroprotective+effects+in+models+of+Parkinson%27s+and+Huntington%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Combination therapy with coenzyme Q10 and creatine produces additive neuroprotective effects in models of Parkinson's and Huntington's diseases.</a> J Neurochem. 109 (5), 1427-1439 (2009).</li>
<li>Yang, X., Dai, G., Li, G., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+Q10+reduces+beta-amyloid+plaque+in+an+APP%2FPS1+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Coenzyme Q10 reduces beta-amyloid plaque in an APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Mol Neurosci. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Sandhir, R., Mehrotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+supplementation+is+effective+in+improving+mitochondrial+dysfunctions+induced+by+3-nitropropionic+acid%2C+implications+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quercetin supplementation is effective in improving mitochondrial dysfunctions induced by 3-nitropropionic acid, implications in Huntington's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (3), 421-430 (2013).</li>
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<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantiative+measurement+of+motor+inco-ordination+in+naive+mice+using+an+acelerating+rotarod%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod.</a> J Pharm Pharmacol. 20 (4), 302-304 (1968).</li>
<li>Luong, T. N., Carlisle, H. J., Southwell, A., Patterson, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+motor+balance+and+coordination+in+mice+using+the+balance+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of motor balance and coordination in mice using the balance beam.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Servadio, A., Koshy, B., Armstrong, D., Antalffy, B., Orr, H. T., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+the+ataxin-1+protein+in+tissues+from+normal+and+spinocerebellar+ataxia+type+1+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of the ataxin-1 protein in tissues from normal and spinocerebellar ataxia type 1 individuals.</a> Nat Genet. 10 (1), 94-98 (1995).</li>
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</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

설명 된 바와 같이 이러한 방법을 사용하는 경우, 이들은 검출 및 소뇌 신경 퇴행성 질환의 마우스 모델에서 산화 적 인산화 매개 미토콘드리아 기능 부전을 경감 할 수있다. 결합 된 생화학 적 및 행동 분석은 소뇌 신경 퇴행성 질환의 병리에 미토콘드리아 기여의 정도를 결정하기위한 다각적 인 방법입니다. 신진 대사를 자극하고 미토콘드리아 기능을 강화하기 위해 숙신산과 쥐를 치료함으로써, 우리는 소뇌 행동 적자와 소뇌 변성의 구조를 표시 할 수 있습니다. 여기서 제시된 방법론은 소뇌 신경 퇴행성 질환의 치료에 잠재적 인 수용성 대사 표적 다양한 화합물을 시험하는데 사용될 수있다. 숙신산은 케이지 식수를 통해 간단한 배달을 허용하고 보충 식품 펠렛의 작성을 필요로하지 않습니다 0.75 ㎎ / ㎖의 물에 쉽게 용해된다. 다른 수용성화합물은 용이 프로토콜로 대체 될 수있다. 수용성없는 대사 표적 화합물을 사용하는 경우, 우리의 방법은 용이하게 보충 식품 펠릿 <sup class="xre...

미토콘드리아의 전자 전달계를 이용하여 산화 적 인산화 (OXPHOS)를 통해 생성 된 미토콘드리아 ATP의 대부분과, 아데노신 삼인산 (ATP), 세포 에너지의 필수 조효소의 주요 생산자이다. 뇌는 높은 신진 대사 요구와 신경 활동에 전력을 공급하기위한 산화 적 인산화에 대한 의존도를 부여, 미토콘드리아 기능 장애에 매우 민감하다. 그 결과, 미토콘드리아 장애는 노화 과정 트리거 (1) 및 다수의 신경 퇴행성 질환은 2, 3, 4의 병인에 연루되어있다. 따라서 미토콘드리아는 신경 퇴행에 대한 매력적인 치료 대상이되는 것을 다음과 같습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 미토콘드리아의 연구를위한 모델 신경 퇴행성 질환과 같은 척수 소 뇌성 실조증 유형 1 (SCA1)의 사용을 채택리터 부전과 미토콘드리아 - 표적으로 한 치료의 개발. SCA1 다른 뇌 영역의 조롱박 소뇌의 뉴런과 뉴런의 진보적 인 변성을 트리거 ataxin-1 유전자 산물의 폴리 글루타민 (polyQ) 반복 확장 돌연변이에 의해 발생합니다. 조롱박 세포 특이 적 프로모터의 제어하에 polyQ 돌연변이 ataxin-1 유전자를 발현합니다 (SCA1 마우스로 지정) 여기서 사용 된 트랜스 제닉 마우스 선은 SCA1 5 조롱박 세포 성분의 표적 분석을 허용한다. SCA1 마우스는 점진적 조롱박 세포의 퇴화를 받아야하고 운동 실조증 보행 (6)을 개발한다. 미토콘드리아 복잡한 기능 장애 및 미토콘드리아 타겟 치료 효능은 분자 및 행동 분석의 배터리로 평가 될 수있다. 복잡한 미토콘드리아 장애는 소뇌 조직 안에서 변화된 산소 소비량을 검출 호흡 분석하여 생체 측정전자 전달계 기판 및 억제제 (7)의 존재. 호흡 분석은 이전에 투과성이 조직, 미토콘드리아 분리하고, 전체 조직 7, 8, 9로 사용되어왔다. 이들은 예컨대 투과 전자 현미경 또는 면역 형광 염색법과 같은 형태 학적 데이터 수집 방법과 달리 미토콘드리아 기능의 직접적인 평가를 허용한다. 전체 조직보다는 격리 미토콘드리아의 사용은 분리 과정 중에 발생할 수 7 건강한 미토콘드리아 바이어스 선택을 방지한다. 도시 된 바와 같이 프로토콜에 적응되면, 호흡 분석은 소뇌 신경 퇴행성 질환 상태에서 미토콘드리아 기능 장애를 검출하기위한 유용한 방법이다. 대사 비특이적 활성제 퇴행성 diseas의 형질 전환 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 부전을 추론하는데 사용될 수있다전자 및 새로운 치료법의 개발에 도움. 퀘르세틴 보효소 Q10과 크레아틴 모든 환자 및 신경 퇴행성 질환 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16의 동물 모델에서 신경 퇴행성 질환의 병리를 개선하는 것으로 나타났다. 여기에서 우리는 신진 대사를 자극하고 신경 퇴행성 질환에서 미토콘드리아의 기능을 높일 수있는 새로운 신진 대사 활성화, 숙신산을 제시한다. 활성제가 혈액 뇌 장벽을 가로 지르는 것을 보장하기 위해, HPLC 처리 된 마우스는 17 신경 조직에 배달을 검출하도록 사용 하였다. 숙신산과 같은 대사 표적 수용성 화합물의 치료 효과를 평가하기 위해, 행동 패러다임과 immunopathological 연구 전지가 사용될 수있다. 뒤소뇌 신경 퇴행성 질환, 풋 프린트 활주로 분석, 빔 분석 및 가속 회전로드 분석에서 발견 된 모터 조정 적자에 전자는 행동 병리학 6, 18, 19의 구조를 검색하는 데 사용됩니다. 이러한 조치는 소뇌 조직 6, 20, 21의 정의 소엽 내에서 분자 (조롱박 세포 돌기의 아버 길이로 정의) 층의 두께 및 조롱박 세포 소마 수를 평가하여 소뇌 cytoarchitecture의 immunopathological 평가로 보충된다. 여기에서 우리는 대사 대상으로 수용성 화합물 검출 및 미토콘드리아 기능 장애의 치료를위한 여러 신경 병리학 및 행동 방법을 제시한다. 우리는 SCA1의 트란에 미토콘드리아 기능 장애를 분석하는 미토콘드리아 호흡의 생체 분석을 사용sgenic 마우스입니다. 더욱이, 우리는 질병 증상과 병리 더 SCA1 질병 진행에서 미토콘드리아 기능 부전을 연루 수용성 미토콘드리아 부스터 숙신산 향상되어 있음을 보여준다.

<table><tbody><tr><td>아데노신 디 포스페이</td>트 <td>시그마 Aldrich</td><td>A2754</td><td>ADP</td></tr><tr><td>아스 코르 베이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마 Aldrich</td><td>A2153</td><td>BSA</td></tr><tr><td>4 ', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>디지토닌</td><td>시그마 Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>디티 오 트레이톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>D0632</td><td>DTT</td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>시그마 알드리치</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>글루타메이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>1446600</td><td></td></tr><tr><td>말레이트</td><td>시그마 알드리치</td><td>6994</td><td></td></tr><tr><td>만니톨</td><td>시그마 알드리치</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마 알드리치</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>칼륨-락토바이오네이트</td><td>바이오 설탕</td><td>69313-67-3</td><td></td></tr><tr><td>로테논</td><td>시그마 알드리치</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마 알드리치</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>숙신산</td><td>시그마 알드리치</td><td>S3674</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetramethyl-p-phenylenediamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U0631</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 마운팅 매체</td>Vector <td>Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>11NQ 항체 (안티 아탁신-1 )</td><td></td><td></td><td>Servadio, et al. 1995, PMID: 7647801</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-mouse secondary 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-11015</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anti-rabbit secondary 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin 항체 (goat)</td><td>Santa Cruz</td><td>C-20</td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>형질전환 마우스 제어</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>A02</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>SCA1 마우스</td><td>Harry Orr, Ph.D.</td><td>B05</td><td>Burright, et al. 1997, PMID: 9217978</td></tr><tr><td>야생형 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESM-100L microtome</td><td>ERMA</td><td></td><td>Sledge microtome</td></tr><tr><td>Fluoview FV1200 Confocal Microscope</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol-gelatin slides</td><td>FD Neuro Technologies</td><td>PO101</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 주사기</td><td>Sigma Aldrich</td><td>VCAT 80465</td><td></td></tr><tr><td>OXYT1 Oxytherm 전극 제어 장치</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P.T.F.E. 종이</td><td>Cole-Parmer</td><td>UX-08277-15</td><td></td></tr><tr><td>Rotallion Rotarod</td><td>PPP& G</td><td></td><td>정보는 교신자에게 연락:</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td><a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>Cell counter plugin (for ImageJ)</td><td>National Institute of Health(국립보건원)</td><td></td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a></td></tr><tr><td>3P& G Rota-Rod v3.3.3(로타로드 소프트웨어)</td><td>PPP& G</td><td></td><td>Phidget21.dll 정보는 교신저자에게 연락(</td></tr><tr><td>로타로드 소프트웨어에 필요)</td><td>DLL-Files.com</td><td></td><td><a href="https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html">https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html</a></td></tr></tbody></table>

에 수용성 화합물로 sca1 마우스 치료가 아닌 것은 - 특히 미토콘드리아 기능 향상

Treating SCA1 Mice with Water-Soluble Compounds to Non-Specifically Boost Mitochondrial Function

미토콘드리아 기능 장애는 노화 과정에서 여러 유전 척수 소 뇌성 운동 실조증과 소뇌의 진보적 인 변성에 의해 표시 다른 운동 장애를 포함한 신경 퇴행성 질환에 중요한 역할을한다. 이 프로토콜의 목적은 척수 소 뇌성 실조증 유형 1 (SCA1)에서 미토콘드리아 기능 부전을 평가하고, 병의 진행을 느리게하는 수용성 화합물 숙신산 통해 호흡 대사 약물 표적의 효능을 평가하는 것이다. 이 접근은 다른 소뇌 질환에 적용 할 수있다 수용성 요법 숙주에 적응 될 수있다. 미토콘드리아 호흡의 생체 분석을 감지하고 미토콘드리아 기능에서 질병 관련 변경 사항을 정량화하는 데 사용됩니다. 유전 적 증거 (게시되지 않은 데이터)와 SCA1 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애의 단백체 증거, 우리는 수용성 대사 부스터의 치료의 효능을 평가홈 케이지 마시는 물에 직접 화합물을 용해하여 uccinic 산. 혈액 뇌 장벽을 통과하는 약물의 능력은 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC)를 사용하여 추론 될 수있다. 이들 화합물의 효능은 다음 가속 로타로드 (rotarod), 밸런스 빔 테스트 및 공간 분석 등 다양한 행동 패러다임을 사용하여 테스트 할 수있다. 소뇌 Cytoarchitectural 무결성 조롱박 세포핵 및 조롱박 수지상 세포 및 소마 검출 면역 분석법을 이용하여 평가할 수있다. 이러한 방법은 미토콘드리아 장애와 소뇌 신경 퇴행성 질환의 수용성 화합물 치료의 효능을 결정하기위한 견고한 기술이다.

숙신산과 소뇌 미토콘드리아의 약물 학적 타겟팅을 통해 우리는 소뇌 신경 퇴행성 질환 SCA1의 마우스 모델에서 미토콘드리아 기능 장애를 방지 할 수 있습니다. 숙신산 탈수소 효소, 숙신산,의 표준 전자 공여체 치료 (그림 1A) 다음과 같은 치료 및 신경 병리학 적 평가의 두 번째 주 동안 행동 평가의 시작과 함께, 한 달 동안 SCA1 마우스의 홈 케이지 마시는 물에 용해시켰다. 풋 프린트 분석 빔 분석 및 로타로드 (rotarod) 분석 가속에 의해 측정 숙신산 처리 22 SCA1 마우스의 성능을 향상시킨다. 검출 된 행동 개선 (그림 1B-D)를 학습 모터 조정 및 모터를 강화 나타냅니다. 행동의 성능의 구조는 세르의 보존...

척수뇌 운동실조증 1형(SCA1) 및 기타 소뇌 신경퇴행성 질환 치료를 위한 미토콘드리아 표적 수용성 화합물의 효능을 평가하기 위한 생화학적 및 행동 프로토콜을 제시합니다.

에 수용성 화합물로 SCA1 마우스 치료가 아닌 것은 - 특히 미토콘드리아 기능 향상

Mitochondrial dysfunction plays a significant role in the aging process and in neurodegenerative diseases including several hereditary spinocerebellar ...

이 실험의 전반적인 목표는 척추 소뇌 운동 실조증 1형 마우스에서 소뇌 행동 및 조직에 대한 수용성 미토콘드리아 활성제의 치료 효과를 관찰하고 정량화하는 것입니다. 이 방법은 척추 소뇌 운동 실조증 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다: 미토콘드리아 결핍이 질병 병리학에 기여하는지, 수용성 미토콘드리아 활성제에 의해 질병이 지연될 수 있는지. 이 기술의 주요 장점은 숙신산이 식수를 통해 뇌로 직접 전달될 수 있는 FDA 승인 저렴한 수용성 화합물이라는 것입니다.이 기술의 의미는 알츠하이머병과 헌팅턴병을 포함한 여러 신경퇴행성 질환에서 미토콘드리아 산화 인산화 복합체의 결핍이 발견되기 때문에 다른 신경퇴행성 질환의 치료로 확장될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 일관된 결과를 얻기 위해 조정해야 할 수 있는 행동 패러다임의 초기 설정에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 행동 단계가 서면 방법 섹션에서 재현하기 어려울 수 있지만 시각적 기록을 통해 쉽게 복제할 수 있기 때문에 유용합니다.이 절차를 시작하려면 활주로를 침구와 보상 음식이 늘어선 홈 박스를 향해 약간 위쪽 각도로 설정하십시오. 그런 다음 활주로에 흰 종이 한 장을 깔아줍니다. 마우스가 홈 박스에 5분 동안 적응할 때까지 기다립니다.다음으로 단일 주제를 선택하고 왼쪽과 오른쪽 뒷발을 각각 파란색과 빨간색 무독성 수성 페인트로 칠합니다. 그런 다음 피험자를 활주로 시작 부분에 놓고 홈 박스까지 걸어갈 수 있도록 합니다. 피험자가 홈 박스에 도착하면, 트랩 도어를 닫고 1분 동안 홈 박스 안에 머물게 한 후 각각의 홈 케이지로 돌아간다.그런 다음 활주로와 홈 박스를 30% 에탄올로 청소하고 다음 시험을 위해 침구, 보상 음식 및 활주로 종이를 교체하십시오. 동시에 실험 후 활주로 종이를 수집하고 시험을 검사하십시오. 성공적인 발자국 실험은 피험자가 뒤를 돌아보거나 멈추지 않고 금 상자를 향해 걸어가는 최소 5번의 순차적 발자국으로 정의됩니다.이제 6개의 서로 다른 빔이 있는 바 크로스 사양에 따라 빔 장치를 설정합니다. 빔의 한쪽 끝에는 보상 음식이 있는 어두운 가정 상자를 설정합니다. 빔에서 피험자를 훈련시키려면 빔 3으로 장치를 조립하십시오.홈 박스 맞은편에 있는 빔 끝에 피사체를 부드럽게 놓습니다. 그리고 그것이 들보를 가로질러 걸을 수 있게 하십시오. 성공적인 실행을 위해 각 피험자에게 2분 동안 최대 3번의 시도를 허용합니다.이는 빔을 건너 2분 이내에 홈 박스에 들어가는 것으로 정의됩니다. 빔 훈련 4일차에 빔 1로 장치를 조립합니다. 그리고 홈 박스를 설정합니다.장치 앞에 비디오 카메라를 놓고 전체 빔 장치가 비디오에 명확하게 캡처될 수 있는지 확인합니다. 마우스가 빔을 가로지르며 각 시도를 비디오로 녹화하고 빔당 피험자당 성공적인 시도 횟수를 기록하도록 합니다. 이 단계에서는 실험이 시작되기 10분 전에 피험자를 레인 저장소에 적응시킵니다.이 적응 기간 동안 30 % 에탄올로 장치의 각 레인을 청소하는 회전 장치를 준비하십시오. 그런 다음 rotarod 소프트웨어를 엽니다. 시작 설정을 4RPM, 가속 설정을 5분, 최종 속도 설정을 40RPM으로 설정하여 5분 동안 4에서 40RPM까지 일정한 가속을 제공합니다.적응 기간이 끝나면 막대가 4RPM으로 회전하는 동안 피험자를 각각의 레인에 있는 로타로드에 놓습니다. 모든 피험자가 각자의 차선에 들어가면 첫 번째 시도를 시작합니다. 기기 소프트웨어를 사용하여 떨어지는 대기 시간을 기록합니다.보조 타이머를 백업으로 사용할 수 있습니다. 실험이 완료된 후, 피로를 방지하기 위해 다음 실험 전에 각 피험자가 해당 레인 저장소에서 10분 동안 휴식을 취하도록 합니다. 이 절차에서는 썰매 마이크로톰의 온도 조절 상자 튜브를 s를 부착합니다.tage에서 싱크대 수도꼭지로.온도 조절 상자를 사용하여 마이크로톰 스테이지를 섭씨 28도로 냉각합니다. 그런 다음 절편 두께 다이얼을 50마이크로미터로 설정합니다. 다음으로 OTC 용액의 동전 크기 부분을 무대에 두드립니다.OTC가 얼기 전에 집게를 사용하여 중간 시상 절단 표면이 OTC 레이어에서 앞면이 아래를 향하도록 반구를 배치합니다. 반구의 측면 끝이 칼날을 향하도록 조직을 빠르고 부드럽게 배치합니다. 무대보다 우수합니다.여러 층으로 작업하면서 조직 주위에 OTC를 추가하고 다음 층을 추가하기 전에 OTC가 완전히 동결되도록 합니다. 그런 다음 조직 위에 OTC를 얇게 바르고 얼립니다. 그 후, 절단 날에 분포된 동일한 체중의 조직을 절단합니다.훌륭한 아티스트 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 수집합니다. 그리고 하나의 XPBS가 들어 있는 적절하게 라벨링된 웰 플레이트에 넣습니다. 필요한 경우 섹션 사이에서 절단 두께를 50마이크로미터로 재설정합니다.절편 후 플레이트의 각 웰에 있는 PBS를 요소 용액으로 교체합니다. 그리고 접시를 얼음 위에 놓습니다. 준비가 되면 플레이트를 끓는 온도로 설정된 가열 블록으로 옮기고 요소 용액에서 섹션을 끓여서 면역 라벨링을 위한 에피토프의 가림을 해제합니다.끓는 각 단계 사이에 얼음 위의 조직 섹션이 들어있는 플레이트를 식히십시오. 끓인 후 섹션을 세 번 세척하고 현재 용액을 하나의 XPBS로 교체하고 10 분 동안 섹션을 교반합니다. 그런 다음 당나귀 세럼 용액으로 섹션을 막고 실온에서 부드럽게 저어주면서 1시간 동안 혈청에 배양합니다.이제 단면을 염색할 수 있습니다. 라벨이 부착되면 광표백을 줄이기 위해 장착 매체를 사용하여 2% 젤라틴 코팅된 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 뚜껑을 덮고 미끄러져 섭씨 4도에서 밤새 말리십시오.그런 다음 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 명시야 광선 아래에서 소뇌의 기본 균열을 찾습니다. 아미노 분석에서 가장 중요한 단일 단계는 1차 열구 측면에 있는 모듈 5 및 6 A에서 소뇌 조직을 정확하게 찾는 것입니다.염색 패턴과 일관되지 않은 소엽을 분석하면 결과의 변동성을 보장할 수 있습니다. 10X 대물렌즈를 사용하여 DAPI, Alexa Fluor 488 및 Alexa Fluor 594 채널을 스캔하고 순차적으로 자극할 수 있습니다. DM 488559 나노미터 이색성 빔 스플리터와 함께 각각 405 나노미터 다이오드 레이저, 488 나노미터 아르곤 가스 레이저 및 559 나노미터 다이오드 레이저를 사용합니다.그런 다음 SDM 490 및 SDM 560 빔 스플리터와 BA 575675 대역 통과 필터를 각각 사용하여 방출된 빛을 분리하고 수집합니다. 숙신산은 생후 17주부터 4주 동안 SCA1 마우스의 가정용 케이지 음용수에 용해되었습니다. SCA1 마우스는 생후 5주가 되면 운동 실조증 표현형을 나타내기 시작합니다.치료 기간 동안 다음과 같이 행동 평가를 실시했습니다. 17주차 동안의 발자국 분석. 18주차 동안 빔 분석, 19주차 동안 가속 로타로드.생후 20주가 되면 마우스를 희생하고 소뇌 조직을 채취하여 아미노산 병리학 분석, HPLC 분석 및 호흡 분석을 수행했습니다. 다음은 차량 처리된 야생형 게이트, 차량 처리된 SCA1 게이트 및 숙신산 처리된 SCA1 게이트를 보여주는 발자국 분석의 대표적인 데이터입니다. 여기서 빔 분석 데이터는 숙신산 처리를 통한 SCA1 마우스의 빔 성능 향상을 보여줍니다.숙신산 처리는 낙하 대기 시간이 증가한 것으로 나타난 바와 같이 SCA1 마우스의 가속 로타로드 성능을 크게 향상시킵니다. 이 절차를 시도하는 동안, 여러 번의 시도를 통해 각 피험자에게 이 기법을 일관되게 적용해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 미토콘드리아 호흡과 같은 다른 방법을 수행하여 숙신산 전달 후 개선된 개별 산화적 인산화 복합체를 통한 호흡과 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.이 비디오를 시청한 후에는 행동 및 신경 병리학적 분석을 수행하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 소뇌 행동과 세포 구조의 개선을 평가합니다.

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