쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 희소돌기아교세포 전구세포를 분리 및 배양하고 실험적 요인에 대응하여 희소돌기아교세포 형성을 정량화하는 것입니다. 효율적인 희소돌기아교 형성은 척수 손상, 신생아 저산소증, 횡단성 척수염 및 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환을 포함한 수많은 연구 분야의 치료 목표입니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 수의 OPC를 분리하기 위한 프로토콜과 여러 실험 조건에서 동시에 희소돌기아교 형성을 결정할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 결합한다는 것입니다.

이 절차를 시작하려면 가열된 비드 살균기를 사용하여 모든 해부 장비를 소독하십시오. 그런 다음 50ml 원뿔형 튜브에 15-20ml의 PBS를 추가합니다. 원뿔형 튜브를 얼음 위에 놓고 해부하는 동안 깍둑썰기된 피질 조직을 잡는 데 사용합니다.

다음으로, 광학 현미경으로 해부하는 데 사용할 10cm 페트리 접시에 차가운 PBS를 추가합니다. 새끼 쥐를 희생한 후 작은 가위를 사용하여 정중선을 따라 귀 뒤의 피부를 자릅니다. ᆞ 피부 덮개를 벗 깁니다.

다음으로, 뇌간에서 눈까지 정중선을 따라 두개골을 자릅니다. 그리고 기저 피질의 구조를 보존하기 위해 너무 깊게 자르지 않도록 주의하십시오. 그 후, 작은 수술용 가위를 대공에 삽입하여 소뇌보다 아래쪽에 있는 두 개의 측면 절단을 만듭니다.

후각구 앞쪽의 눈 사이를 추가로 절개합니다. 두개골의 각 절반을 조심스럽게 벗겨냅니다. 뇌 전체를 제거하고 차가운 PBS로 채워진 10cm 페트리 접시에 넣는다.

해부 광학 현미경으로 미세한 수술 겸자로 후각구와 소뇌를 제거합니다. 복부 표면이 보이도록 뇌를 뒤집습니다. 그런 다음 가는 직선 겸자를 사용하여 피질과 시상하부 사이에 닫힌 집게 끝을 뇌의 약 2/3 깊이까지 배치하여 무딘 해부를 수행합니다.

집게가 제자리에 놓이면 집게를 열고 다른 반구에 대해 절차를 반복합니다. 그런 다음 시상하부와 중뇌 영역에서 피질을 괴롭힙니다. 시상하부, 시상하부, 중뇌를 제거하려면, 중뇌를 뒤쪽 표면에 대고 뇌의 앞쪽 끝을 향해 벗겨냅니다.

그런 다음 전방 연결을 끊습니다. 미세하게 구부러진 해부 겸자를 사용하여 해마를 제거하고 피질과의 연결을 끊습니다. 그런 다음 바깥쪽 대각선 동작으로 기저 피질에서 긁어내어 남은 선조체를 제거합니다.

피질의 복부 표면에서 혈관과 수막을 제거합니다. 다음으로, 등쪽 표면이 보이도록 뇌를 뒤집습니다. 후각구가 위치한 기저 피질에서 수막을 벗겨냅니다.

총 3-4마리의 새끼 쥐에 대해 절차를 반복합니다. 그리고 절개된 모든 피질을 페트리 접시에 넣습니다. 1mm x 1mm 덩어리가 될 때까지 멸균 된 면도날로 자릅니다.

그런 다음 얼음에 다시 넣기 전에 접시를 PBS로 헹구어 티슈를 수집합니다. 이제 피펫 컨트롤러에 부착된 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 10회 내지 15회 피펫팅을 통해 또는 조직 조각의 크기가 줄어들고 용액이 흐려질 때까지 조직을 기계적으로 해리합니다. 다음으로, 샘플을 섭씨 37도의 조직 배양 인큐베이터에 연속 회전으로 15분 동안 다시 넣습니다.

그런 다음 각 샘플에 10ml의 PBS를 추가하고 50ml 튜브 위에 놓인 40마이크로미터 기공 필터를 통해 균질액을 여과합니다. 그런 다음 PBS 1-2ml로 필터를 헹굽니다. 모든 균질화 샘플을 하나의 50ml 원뿔형 튜브에 모으고 전체 세포 수를 얻습니다.

세포 계수를 수행한 후 균질액을 15밀리리터 원추형 튜브로 균등하게 분할하고 300gs에서 10-12분 동안 원심분리합니다. 각 LS 컬럼을 5밀리리터의 컬럼 버퍼를 추가하여 프라임합니다. 그리고 15 밀리리터 원뿔형 튜브를 통해 흐름을 수집합니다.

컬럼 버퍼가 상부 챔버를 완전히 통과하면 각 컬럼에 1000마이크로리터의 세포 현탁액을 적용하고 세포가 중력에 의해 통과할 수 있도록 합니다. 그런 다음 각 컬럼을 제거하고 15ml 원추형 튜브에 넣습니다. 5ml의 컬럼 버퍼를 추가하고 빠른 속도로 컬럼을 통해 버퍼를 밀어 결합하여 결합된 셀을 제거하고 컬럼에서 분리합니다.

세포를 도금하기 위하여는, OPC 증식 매체로 60에 그(것)들을 묽게 하십시오, milliliter 당 000의 세포. 24웰 플레이트의 각 검은색 투명한 바닥 웰 측면을 따라 500마이크로리터의 세포를 피펫팅합니다. 8자 동작을 사용하여 플레이트를 수평으로 흔들어 세포를 혼합합니다.

이 절차에서는 200마이크로리터 피펫 팁을 유리 파스퇴르 피펫 위에 올려 놓고 흡인 중에 웰이 손상되지 않도록 합니다. 그런 다음 세포가 건조되지 않도록 한 번에 한 처리 그룹씩 배양 웰의 배지를 흡인합니다. 그 후, 1 밀리리터 피펫을 사용하여 웰 측면을 따라 500 마이크로 리터의 트리트먼트 마스터 믹스를 천천히 첨가하십시오.

배양물을 배양하고 2-3일마다 새로운 처리 배지로 완전한 배지 교환을 수행합니다. 원하는 치료 기간이 끝나면 배지를 흡인합니다. 400마이크로리터의 PFA를 웰 측면에 천천히 첨가하여 세포를 고정합니다.

그리고 접시를 실온에서 20분 동안 배양합니다. 20분 후 PFA를 흡인하고 500마이크로리터의 멸균 D-PBS를 천천히 첨가하여 세포를 세척합니다. 세탁을 두 번 더 반복하고 최종 세척을 흡인하지 마십시오.

이제 플레이트를 실온으로 가져오고 웰을 흡인하고 5% NGS와 0.1% Triton x-100이 포함된 250마이크로리터의 D-PBS를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 부드럽게 궤도를 흔들어 배양합니다. 5% NGS를 함유하는 D-PBS에 마우스 단클론 항 MBP 항체 및 토끼 다클론 항 올리그2 항체를 희석하여 1차 배양 용액을 준비합니다.

그런 다음 1차 항체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 16-18시간 동안 부드러운 안와 흔들기로 배양합니다. 플레이트를 세척하는 동안 NGS 5%를 함유하는 D-PBS에 항마우스 680과 항토끼 800 항체를 희석하여 2차 배양액을 준비합니다. 다음으로, 최종 세척을 흡인하고 250마이크로리터의 2차 배양 용액을 추가합니다.

플레이트를 빛으로부터 보호하고 부드러운 궤도 흔들기로 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 700나노미터 및 800나노미터 형광 방출을 감지할 수 있는 이미징 시스템을 사용하여 플레이트를 스캔합니다. 시작점으로 초점 오프셋을 3으로, 감도를 MBP의 경우 1점 5, 액틴의 경우 5점 0, olig2의 경우 3점 5로 설정합니다.

신호 과다 노출을 방지하기 위해 필요에 따라 감도 값을 조정합니다. 이 회로도에서 DIFS 분석은 PLL 코딩 배양 용기에 도금된 갓 분리된 A2B5 양성 rat OPC로 시작합니다. 이러한 배양액은 밀리리터 PDGFAA당 20나노그램의 존재 하에서 3일 동안 증식한 다음 0일차에 새로운 PDGF가 없는 배지에서 실험 인자로 처리됩니다.

치료 매체는 2일차에 완전히 보충됩니다. 그리고 세포는 4일째에 4%의 파라포름알데히드로 고정됩니다. 여기서, 올리그2 및 MBP에 대한 면역세포화학은 Dapi를 핵 카운터 염색으로 사용하여 0일차와 4일차에 대표 배양액에 대해 수행되었습니다.

이러한 배양물은 0일과 4일에 범 희소돌기아교세포 계통 세포 마커인 Olig2에 대한 구성적 염색을 나타냅니다. 반면, 성숙한 희소돌기아교세포 마커 MBP에 대한 염색은 4일째가 되어서야 뚜렷하게 나타났습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 희소돌기아교 형성에 대한 실험 요인의 효과를 정량화하기 위해 A2B5 양성 쥐 OPC를 정제, 배양 및 구별하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

희소돌기아교형성을 촉진하는 요인의 확인은 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환 연구와 특히 관련이 있습니다. 일단 숙달되면 여기에 설명된 기술은 이러한 요인을 식별하고 궁극적으로 더 나은 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.