Name: 쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: 배우세요 쥐 희소 돌기 아교 세포 전구체 분리 및 배양 방법과 이중 적외선 형광 스캔을 이용한 oligodendrogenesis 정량화 기술입니다. 이 프로토콜은 척수 손상 및 탈수초성 질환 연구에 활용됩니다.

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; 건강의 국립 연구소 : 스폰서 부여 허가 번호 : R37 NS041435.

<ol><li>Rowitch, D. H., Kriegstein, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+genetics+of+vertebrate+glial-cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental genetics of vertebrate glial-cell specification.</a> Nature. 468 (7321), 214-222 (2010).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Dawson, M. R. L., Polito, A., Levine, J. M., Reynolds, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-expressing+glial+progenitor+cells%3A+an+abundant+and+widespread+population+of+cycling+cells+in+the+adult+rat+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">NG2-expressing glial progenitor cells: an abundant and widespread population of cycling cells in the adult rat CNS.</a> Mol Cell Neurosci. 24 (2), 476-488 (2003).</li>
<li>Goldschmidt, T., Antel, J., König, F. B., Brück, W., Kuhlmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+capacity+of+the+MS+brain+decreases+with+disease+chronicity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Remyelination capacity of the MS brain decreases with disease chronicity.</a> Neurology. 72 (22), 1914-1921 (2009).</li>
<li>Duncan, I. D., Brower, A., Kondo, Y., Curlee, J. F., Schultz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remyelination+of+the+CNS+leads+to+functional+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Extensive remyelination of the CNS leads to functional recovery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6832-6836 (2009).</li>
<li>Nishiyama, A., Chang, A., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+glial+cells%3A+a+novel+glial+cell+population+in+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropath+Exp+Neur%22%5BJournal%5D)">NG2+ glial cells: a novel glial cell population in the adult brain.</a> J Neuropath Exp Neur. 58 (11), 1113-1124 (1999).</li>
<li>Baracskay, K. L., Kidd, G. J., Miller, R. H., Trapp, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-positive+cells+generate+A2B5-positive+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">NG2-positive cells generate A2B5-positive oligodendrocyte precursor cells.</a> Glia. 55 (10), 1001-1010 (2007).</li>
<li>Ffrench-Constant, C., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+bipotential+glial+progenitor+cells+in+adult+rat+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proliferating bipotential glial progenitor cells in adult rat optic nerve.</a> Nature. 319 (6053), 499-502 (1986).</li>
<li>Popko, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+deficient+mice%3A+expression+of+myelin+basic+protein+and+generation+of+mice+with+varying+levels+of+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin deficient mice: expression of myelin basic protein and generation of mice with varying levels of myelin.</a> Cell. 48 (4), 713-721 (1987).</li>
<li>Bourre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+profile+and+basic+protein+measurements+in+the+myelin+range+of+particulate+material+from+normal+developing+mouse+brain+and+from+neurological+mutants+%28Jimpy%3B+quaking%3B+Trembler%3B+shiverer+and+its+mld+allele%29+obtained+by+zonal+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Density profile and basic protein measurements in the myelin range of particulate material from normal developing mouse brain and from neurological mutants (Jimpy; quaking; Trembler; shiverer and its mld allele) obtained by zonal centrifugation.</a> J Neurochem. 35 (2), 458-464 (1980).</li>
<li>Baxi, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+thyroid+hormone+%CE%B2+receptor+agonist+enhances+human+and+rodent+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">A selective thyroid hormone β receptor agonist enhances human and rodent oligodendrocyte differentiation.</a> Glia. 62 (9), 1513-1529 (2014).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1044-1051 (2007).</li>
<li>Warringa, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrocortisone+stimulates+the+development+of+oligodendrocytes+in+primary+glial+cultures+and+affects+glucose+metabolism+and+lipid+synthesis+in+these+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Hydrocortisone stimulates the development of oligodendrocytes in primary glial cultures and affects glucose metabolism and lipid synthesis in these cultures.</a> Brain Res. 431 (1), 79-86 (1987).</li>
<li>Tosic, M., Torch, S., Comte, V., Dolivo, M., Honegger, P., Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triiodothyronine+has+diverse+and+multiple+stimulating+effects+on+expression+of+the+major+myelin+protein+genes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Triiodothyronine has diverse and multiple stimulating effects on expression of the major myelin protein genes.</a> J Neurochem. 59 (5), 1770-1777 (1992).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quetiapine+facilitates+oligodendrocyte+development+and+prevents+mice+from+myelin+breakdown+and+behavioral+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quetiapine facilitates oligodendrocyte development and prevents mice from myelin breakdown and behavioral changes.</a> Mol Psychiatry. 13 (7), 697-708 (2008).</li>
<li>Mei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropillar+arrays+as+a+high-throughput+screening+platform+for+therapeutics+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Micropillar arrays as a high-throughput screening platform for therapeutics in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 20 (8), 954-960 (2014).</li>
<li>Deshmukh, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+approach+to+the+treatment+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A regenerative approach to the treatment of multiple sclerosis.</a> Nature. 502 (7471), 327-332 (2013).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-based+modulation+of+endogenous+stem+cells+promotes+functional+remyelination+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-based modulation of endogenous stem cells promotes functional remyelination in vivo.</a> Nature. 522 (7555), 216-220 (2015).</li>
<li>Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+glial+cells+during+CNS+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Defining glial cells during CNS development.</a> Nat Rev Neurosci. 2 (11), 840-843 (2001).</li>
<li>O'Meara, R. W., Ryan, S. D., Colognato, H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+enriched+oligodendrocyte+cultures+and+oligodendrocyte%2Fneuron+myelinating+co-cultures+from+post-natal+murine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Derivation of enriched oligodendrocyte cultures and oligodendrocyte/neuron myelinating co-cultures from post-natal murine tissues.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Dugas, J. C., Emery, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+precursor+cells+from+rat+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte precursor cells from rat cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (8), 745-758 (2013).</li>
<li>Fletcher, J. M., Lalor, S. J., Sweeney, C. M., Tubridy, N., Mills, K. H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+in+multiple+sclerosis+and+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cells in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Clin Exp Immunol. 162 (1), 1-11 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

여기에 제시된 프로토콜은 쥐 개 OPC를 분리하고 실험적인 요인에 반응하여 체외 oligodendrogenesis의 정량화를위한 ​​빠르고 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. 긍정적 인 선택을 사용 가능한 순수 개 OPC의 높은 수율은 실험 목적에 직접 사용됩니다. 이 방법은 1 주일 기간에 분리 배양, 분화 단계를 간소화하고, 고정 된 세포는 편리하게 분석 감도의 손실없이 몇 주 동안 4 ℃에서 저장 될 수있다. 스캐너 계 형광 분석법으로 큰 장점은 데이터 수집 및 분석을 크게 전통적인 카메라 기반 현미경 기술에 비해 신속한된다는 것이다. 현미경 OPC 분화 유도제를 식별하는 높은 처리량 스크린에 성공적으로 사용되었지만, 그것은 토륨 수백 촬상 시퀀스 프로그래밍, 데이터 수집 몇 시간 분석을 필요로하기 때문에, 데이터 수집은 본질적 느리다이미지 파일, 및 사용자 정의 알고리즘 ousands 정규화 또는 분석 18,19 개별 균체를 구별한다....

포유 동물의 중추 신경계 (CNS)의 효율적인 신경 전도는 희소 돌기 아교 세포에 의한 축삭의 수초가 필요합니다. 개발하는 동안, 희소 돌기 아교 세포는 개발 전뇌 신경 관 (1)의 심실 영역에서 마이그레이션 생각되는 희소 돌기 아교 세포의 전구 세포 (개 OPC)의 풀에서 발생한다. 마이그레이션 개 OPC는 성숙 myelinating 희소 돌기 아교 세포로 분화 한 후 효율적인 임펄스 전파를 용이하게 할뿐만 아니라 영양 지원 2 축삭을 제공 할뿐만 아니라. 성인 CNS는 모든 셀 3의 약 5-8%를 포함하는 회색과 흰색 물질 전반에 걸쳐 분산 개 OPC의 풍부한 인구를 유지한다. 탈수 초성 모욕에 따라, 개 OPC는 부상의 사이트로 마이그레이션 증식, 노출 축삭에 분실 또는 손상된 미엘린 수초를 대체하는 차별화. 그러나, 일부 질병 / 부상 설정에서,이 공정은 비효율적 인 것으로 판명되거나 완전히 4 실패 할 수있다. 동안만성 탈수 초화는 증상 (5)을 완화 할 수있다 질환, 효율적인 oligodendrogenesis 및 재유 수화의 부담에 추가 할 생각된다. 따라서 oligodendrogenesis에 실험 인자의 효과를 결정하기 위해 시험 관내 연구 OPC에 관심있다. 희소 돌기 아교 세포 분화의 상이한 단계로 통찰 단계 특정 세포 마커의 식별에 의해 가능하게되었다. 자기 갱신 초기 전구 세포, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (α)의 발현 (PDGFRα)에 의해 정의되는, 신경 / 신경교 항원이 (NG2)과 A2B5 6-8. OPC를 자신의 분화 과정을 개시하고, 세포주기로부터 탈퇴, 그들은 이러한 마커의 발현을 하향 조절 및 고리 뉴클레오티드 3&#39;- 포스 (CNPase) 및 희소 돌기 아교 세포를 포함 O4 premyelinating 나타내는 단백질을 발현하기 시작한다. 마지막으로, 더 성숙한 oligodendroc으로 분화, 킬로바이트는 미엘린 관련 당 단백질 (MAG), 테오 단백질 (PLP), 및 미엘린 염기성 단백질 (MBP)을 포함하여 수초 관련 단백질의 발현을 특징으로한다. MBP는 세포 내 주변 막 단백질과 수초의 주요 구성 요소입니다. MBP 결핍 마우스는 CNS의 수초 크게 떨림, 경련 및 조기 사망 9,10 선도 저하되는 심각한 표현형을 개발한다. 수초에서 MBP의 중요한 역할은 생체 외 및 생체 (11) 모두 희소 돌기 아교 세포 분화 마커로서의 사용하게되었다. MBP 정량은 몇 가지 다른 방법을 사용하여 달성 될 수있다. RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 다른 치료 요법에서 MBP 수준의 정량화를 허용합니다. 면역 세포는 현미경 카메라 기반 방식이 사용되는 경우도있을 수있는 양적 질적 일반적인 접근법이다. 이 시스템은 안정적이고 근본적인 있지만희소 돌기 아교 세포 분화 연구는 이들이 각각의 약물 선별에서 이들의 사용을 제한하는 고유 단점을 갖는다. 우선, RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 필요한 기본 OPC에 량이 동시에 검사 할 수있는 변수의 수를 감소시킨다. 면역 세포에 대한 세포의 요구 사항이 훨씬 낮은 반면 정량화가 목표 인 경우, 상당한 시간이 각 실험에 전념해야합니다. 다수의 이미지를 캡쳐 한 후 실험적 분석을 용이하게 정량한다. 이러한주의 사항은 높은 처리량 평가를 필요로 연구에 고려해야 할 중요한 장애물이된다. 크게 필요한 세포의 수 및 정량 분석​​을 완료하는 데 시간을 모두 줄이면서 여기에서 우리는, 면역 세포 및 수초의 정량 웨스턴 블롯 방법론 모두에서 근본적인 측면을 활용하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Dissection Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS without Ca2+ and Mg2+</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>10 cm 폴리스티렌 페트리 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>0857512</td><td></td></tr><tr><td>광 해부 현미경</td><td>Motic</td><td>SM2-168</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation 재료</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>Dissociation Tube Rotator</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Enzymatic Dissociation Kit</td></tr><tr><td>PBS with Ca2+ and Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x</td></tr><tr><td>40 &mu; m 세포 여과기</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>A2B5 컬럼 정제&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-A2B5 Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-864</td><td>비드 결합 A2B5 항체</td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>자기 선택 컬럼</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>PBS(Ca2+ 및 Mg2+</td><td>Corning</td><td>20-030-CV</td><td>1x 포함</td></tr><tr><td>소 세럼 알부민&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>0.50%</td></tr><tr><td><강한>배양 재료</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>PeproTech Inc</td><td>100-13A</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Hybri-Max 100 ml</td></tr><tr><td>Triiodothyronine&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6397</td><td>45 nM</td></tr><tr><td>클레마스틴 푸마르산염 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>SML0445-100MG</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>케티아핀 헤미푸마레이트 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>Q3638-10MG</td><td>1&mu; M</td></tr><tr><td>N- 아세틸 시스테인</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>A9165</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8783</td><td>60 ng/ml</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P1524</td><td>10 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>푸트레신</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7505</td><td>16 & g/ml</td></tr><tr><td>나트륨 셀레나이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5261</td><td>40 ng/ml</td></tr><tr><td>하이드로코르티손</td><td>시그마-알드리치</td><td>H0135</td><td>50 ng/ml</td></tr><tr><td>d-비오틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>B4639</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마-알드리치</td><td>I6634</td><td>5 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>Apo-Transferrin</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1147</td><td>100 & g/ml</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4161</td><td>100 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>미량 원소 B</td><td>코닝</td><td>25-022-Cl</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>생명 기술</td><td>17504044</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>생명 기술</td><td>15140122</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>뚜껑이 있는 24웰 블랙 Visiplate</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-605</td><td>조직 배양 등급</td></tr><tr><td>Immunocytochemistry and Quantification</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>100-13A</td><td>4%</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>78787</td><td>0.10%</td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>005-000-121</td><td>5%</td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 MBP</td><td>Biolegend</td><td>SMI-99P</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항 Actin</td><td>Santa Cruz Biotecnology</td><td>SC-7210</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>토끼 다클론 항 Olig2</td><td>Millipore</td><td>AB9610</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>염소 항 마우스 680RD</td><td>Licor</td><td>926-68070</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>염소 항 토끼 800CW</td><td>Licor</td><td>926-32211</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 염소 안티 마우스</td><td>Life Technologies</td><td>A11032</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 토끼</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td>1:1,000 희석</td></tr><tr><td>DAPI로 골드 안티페이드 연장</td><td>Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Ca2+ and Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>라이코 오디세이 Clx 적외선 이미징 시스템</td><td>라이코</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

효율적인 희소돌기아교 형성은 척수 손상, 신생아 저산소증, 다발성 경화증 및 횡단성 척수염과 같은 탈수초성 질환을 포함한 여러 연구 분야의 치료 목표입니다. 수초화는 중추 신경계 내에서 빠른 충동 전파를 촉진할 뿐만 아니라 기저 축삭에 영양 지원을 제공하는 데 필요합니다. 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)는 희소돌기아교세포 분화를 촉진하거나 억제할 수 있는 요인을 식별하는 데 도움이 되도록 체외에서 연구할 수 있습니다. 현재까지 이 프로세스를 평가하는 데 사용할 수 있는 많은 방법은 많은 수의 세포를 필요로 하여 한 번에 조사할 수 있는 조건의 수를 제한하거나 노동 집약적인 정량 분석 방법을 사용했습니다. 여기에서는 여러 조건에서 동시에 희소돌기아교 형성을 결정하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법과 함께 많은 수의 고순도 OPC를 분리하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. OPC는 P5-P7 신생아 쥐 피질에서 분리하고 분화 전 3일 동안 체외에서 성장합니다. 분화 4일 후, 이중 적외선 형광 스캐닝 분석을 사용하여 희소돌기아교 형성을 평가하여 미엘린 단백질의 발현을 결정합니다.

A2B5 양성 자성는 OPC를 컬럼 분리 시스템을 이용하여 양성 세포의 선택을 통해 분리된다. 분리 과정 이전에, 전체 뇌 P5와 P7 사이에 래트 새끼로부터 제거된다. 전뇌 성공적 두개골로부터 분리되면, 후각 전구 및 소뇌 미세 수술 집게 (도 1A)를 사용하여 제거된다. 대뇌 피질 조직을 분리하기 위해 시상 하부, 시상과 중뇌는 조심 해부 (그림 1B)에 의해 절제된다. 다음으로, 해마와 줄무늬는 구부러진 수술 집게 (- D 그림 1C)를 사용하여 제거된다. 분리 과정은 효율적 수막염 및 섬유 아세포 세포를 제거하지만, 수막 및 혈관이 (도 1E)를 제거 할 때의 효소 소화가 향상된다. 마지막으로, 1mm X 1mm의 조직 블록도 (후속 조직 해리 단계에 대한 준비가되어 있습니다URE ...

희소돌기아교세포는 중추신경계의 수초세포입니다. 이 프로토콜은 쥐 피질에서 전구체인 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리 및 배양하는 방법과 실험 요인에 따라 체외에서 희소돌기아교 형성을 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 정량적 방법을 설명합니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

이 절차의 전반적인 목표는 쥐의 희소돌기아교세포 전구세포를 분리 및 배양하고, 실험적 요인에 반응하여 나타나는 희소돌기아교세포 생성 정도를 정량화하는 것입니다. 효율적인 희소돌기아교세포 생성은 척수 손상, 신생아 저산소증, 그리고 횡단성 척수염 및 다발성 경화증과 같은 탈수초성 질환을 포함한 수많은 연구 분야에서 치료 목표가 됩니다. 이 기술의 주요 장점은 대량의 OPC를 분리하는 프로토콜과 여러 실험 조건에서의 희소돌기아교세포 생성을 동시에 결정할 수 있는 빠르고 신뢰할 수 있는 방법을 결합했다는 점입니다.이 절차를 시작하려면, 가열 비드 멸균기를 사용하여 모든 해부 도구를 멸균하십시오. 그런 다음, 50 mL 원심 분리 튜브에 15~20 mL의 PBS를 넣습니다. 원심 분리 튜브를 얼음에 배치하고, 해부 과정 동안 절단된 피질 조직을 보관하는 용도로 사용하십시오.다음으로, 광학 현미경 하에서 해부를 진행할 10 cm 페트리 접시에 차가운 PBS를 넣습니다. 새끼 쥐를 안락사시킨 후, 작은 가위를 사용하여 귀 뒤쪽의 피부를 정중선을 따라 절개합니다. 그리고 피부 플랩을 뒤로 젖혀 벗겨냅니다.다음으로, 뇌줄기에서 눈 방향으로 정중선을 따라 두개골을 절개합니다. 이때 하부 피질의 구조를 보존하기 위해 너무 깊게 절개하지 않도록 주의하십시오. 그 후, 대후두공에 소형 수술용 가위를 삽입하여 소뇌 하단에 두 개의 외측 절개를 실시합니다.후각구 전방의 양 눈 사이를 추가로 절개합니다. 두개골의 각 절반을 조심스럽게 뒤로 젖혀 벗겨냅니다. 뇌 전체를 적출하여 차가운 PBS가 채워진 10 centimeter 페트리 접시에 넣습니다.해부 현미경 하에서 미세 수술용 핀셋을 사용하여 후각구와 소뇌를 제거합니다. 뇌를 뒤집어 복측 표면이 보이게 합니다. 그런 다음, 미세 직선 핀셋을 사용하여 닫힌 핀셋 끝을 피질과 시상하부 사이에 넣고 뇌 깊이의 약 3분의 2까지 둔성 박리를 수행합니다.포셉이 제자리에 위치하면 이를 벌린 후, 반대쪽 반구에 대해서도 동일한 절차를 반복합니다. 그 후, 피질을 시상하부 및 중뇌 영역으로부터 조심스럽게 분리합니다. 중뇌의 후면을 잡고 뇌의 전단 방향으로 벗겨내어 시상하부, 시상 및 중뇌를 제거합니다.그 후, 전방 연결 부위를 절단합니다. 정교한 굽은 박리 겸자를 사용하여 해마를 제거하고 피질과의 연결을 끊습니다. 그런 다음, 하부 피질에서 바깥쪽 대각선 방향으로 긁어내어 남은 선조체를 제거합니다.피

preparation-rat-oligodendrocyte-progenitor-cultures-quantification

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 문서는 성숙 oligodendrocytes (OLs)를 생산하는 차별화 기본 문화에 murine oligodendrocyte 전구체 세포 (OPCs)의 풍부한 인구를 유도하는 방법을 설명합니다. 또한,이 보고서는 생산 기술에 대해 설명합니다 murine 마우스 등의 루트 신경절의 뉴런 (DRGNs)의 neurite 침대에 마우스 OPCs을 심는 공동 문화 myelinating.

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

기본, 인간 태아 뇌 유래, multipotential 전구 세포는 세포 분열 따위에 의해...

인간 태아 뇌에서 전구 - 파생 Oligodendrocyte 문화 시스템

이 비디오는 쥐의 망막에서 망막 신경절 뉴런(RGN)을 분리하고 후각 외피 신경교세포(OEG) 세포와 공동 배양하는 절차를 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 신경 손상 후 OEG의 신경 재생 잠재력을 연구할 수 있습니다.

망막 신경절 뉴런과 후각 외피 신경교세포의 공동 배양

이 비디오는 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 희소돌기아교세포로 분화하고 배근신경절(DRG) 뉴런과 공동 배양에서 수초화를 유도하는 프로토콜을 보여줍니다. OPC는 수초화를 조절하는 신호 단백질을 인코딩하는 렌티바이러스 벡터로 형질전환됩니다. 형질도입된 OPC는 DRG 뉴런과 공동 배양되어 희소돌기아교세포로의 분화 및 신호 단백질 유도 수초화를 평가합니다.

희소돌기아교세포 전구세포에 대한 체외 형질도입 유도 수초화 분석

출처: Schott, J. T.,  et al. 이중 적외선 형광 스캐닝을 사용한 쥐 희소돌기아교 전구 배양 및 희소돌기아교 형성의 정량화 준비.J. Vis. 특급. (2016). 이 비디오는 전구세포(OPC)와 희소돌기아교세포의 분화를 평가하기 위해 이중 형광 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 쥐 새끼 뇌에서 분리. 이 프로세스에는 세포 고정, 1차 및 형광단 접합 2차 항체로 특정 마커 라벨링, 형광 이미징을 사용하여 시각화하는 것이 포함됩니다. 미엘린 염기성 단백질(MBP)과 희소돌기아교세포 전사 인자 2(Olig2)를 모두 발현하는 분화된 희소돌기아교세포를 식별하여 Olig2만 발현하는 미분화 전구세포와 구별합니다.

분화된 희소돌기아교세포를 식별하기 위한 이중 형광 이미징

출처: Portela-Lomba, M., et. al. 성인 축삭 재생의 체외 모델로서 Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons with Olfactory Ensheathing Glia의 공동 배양. J. Vis. 특급. (2020). 이 비디오는 불멸의 인간 후각 외피 신경교세포와 공동 배양된 축삭 절제술된 쥐 망막 신경절 뉴런(RGN)에서 축삭 재생의 이미징 및 정량화를 보여줍니다. RGN은 붉은색 솜씨와 녹색 축삭돌기가 있는 면역 표지되어 있습니다. 이미지는 epifluorescence microscope를 사용하여 캡처되었으며 축삭 및 축삭 재생 지수가 있는 뉴런의 비율은 이미징 소프트웨어를 사용하여 정량화되었습니다.

Imaging and Quantification of Axonal Regeneration in Axotomized Rat Retinal Ganglion Neurons

우리는 생체 외에서 문화에 대 한 셀의 신속 하 고 특정 격리 수 있는 기본 마우스 oligodendrocytes의 immunomagnetic 절연을 설명 합니다.

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

본 명세서에서, 우리는 올리고엔드로시트의 정제 및 공동 배양 실험에 사용될 수 있는 올리고엔드로시테 컨디셔닝 배지의 생산을 위한 효율적인 방법을 전시한다.

공동 문화 실험을 위한 올리고엔드로시테 및 올리고엔드로시테-컨디셔닝 배지 생성

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

배우세요 쥐 희소 돌기 아교 세포 전구체 분리 및 배양 방법과 이중 적외선 형광 스캔을 이용한 oligodendrogenesis 정량화 기술입니다. 이 프로토콜은 척수 손상 및 탈수초성 질환 연구에 활용됩니다.

쥐 희소 돌기 아교 세포 전구 문화의 준비 및 Oligodendrogenesis의 정량화 이중 적외선 형광 스캔을 사용하여

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