CD146의 분리 + 주민 폐 중간 엽 기질 세포

이 절차의 전반적인 목표는 효소 분해, 밀도 구배 분리, 플라스틱 부착 및 비드 분류의 조합을 사용하여 쥐 폐에서 분리된 CD146 양성 상주 중간엽 기질 세포 또는 MSC를 체외 특성화하는 것입니다. 이 방법은 폐 MSC가 질병에서 어떻게 감염되고 면역 조절 및 조직 복구에 어떻게 기여하는지에 대한 폐 질환 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 빠르고 재현 가능하며 다양한 종의 실험 동물 또는 조직에 쉽게 적용할 수 있다는 것입니다.

절차의 첫 번째 단계를 시연하는 것은 제 연구실의 연구원인 Arul Vadivel이 맡을 것입니다. 흉부에서 폐를 제거하려면 작은 집게로 기관을 잡고 수술용 가위를 사용하여 흉부 쪽의 기관을 분리합니다. 그런 다음 흉부에서 폐 패키지를 부드럽게 빼내면서 흉곽을 따라 등쪽의 결합 조직을 잘라냅니다.

횡격막을 따라 절단하여 대동맥과 식도에서 폐를 절단하고 거즈를 사용하여 폐 조직에 남아 있는 혈액을 부드럽게 제거합니다. 가위를 사용하여 기관과 기관지를 제거하고 35ml의 차가운 CPDA 항응고제와 PBS가 들어 있는 50ml 튜브에 폐엽을 조심스럽게 넣어 혈액과 부스러기를 제거합니다. 5분 후, 35ml의 멸균 실온 PBS가 들어 있는 새로운 50ml 튜브로 폐를 옮깁니다.

그리고 부드럽게 뒤집어 구연산염을 제거합니다. 5분 후, 피루브산 나트륨과 포도당이 보충된 35ml의 멸균 실온의 Dulbecco의 PBS가 들어 있는 새로운 50ml 튜브로 폐를 헹구고 부드럽게 뒤집습니다. 그런 다음 폐를 다른 50밀리리터 튜브로 옮기고 메스를 사용하여 조직을 튜브 벽에 대고 잘게 다집니다.

최대 세포 수율을 보장하기 위해 조직을 매우 작은 조각으로 자르는 것이 매우 중요합니다. 또한 강력한 세포 생존력을 보장하기 위해 신속하게 작업해야 합니다. 모든 조직이 다진 후 갓 준비한 효소를 튜브에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다.

그런 다음 적절한 소화 기간 동안 섭씨 38도에서 부드럽게 교반하여 조직 조각을 배양합니다. 배양이 끝나면 200마이크로리터의 멸균 여과 EDTA로 분해를 중지합니다. 조직 슬러리에 FBS가 보충된 PBS 20ml를 추가하고 전체 현탁액을 100미크론 세포 여과기를 통해 새로운 50ml 튜브에 통과시킵니다.

그런 다음 분해 튜브와 세포 여과기를 10ml의 FBS/PBS로 헹구고 여과된 샘플로 세척을 당깁니다. 셀을 두 번 회전시킨 후 두 번째 펠릿을 4mm의 실온 FBS/PBS에 재현탁합니다. 그리고 45도 이상의 각도로 3ml의 밀도 구배 매체 위에 세포를 천천히 층을 이룹니다.

세포 현탁액과 밀도 구배 매질 사이의 45도 이상의 각도로 두드리면 세포가 구배 매질과 혼합되는 순전한 힘이 방지되어 층이 생성될 수 있으며, 혼합이 발생하더라도 밀도 구배가 발생하지 않습니다. 원심분리로 세포를 분리하고 간기를 수집합니다. 그런 다음 폐 MSC를 10ml의 멸균 PBS로 세척하고 펠릿을 도금을 위해 예열된 완전한 폐 MSC 배양 배지에 재현탁합니다.

CD146 양성 세포 집단을 100 마이크로리터의 마그네틱 비드당 10 마이크로그램의 비오틴화된 2차 항체로 먼저 코팅하기 위해, 멸균 조건에서 2밀리리터의 멸균 원형 바닥 크라이오 바이알에 넣습니다. 회전하는 시료 혼합기에서 비드와 항체를 실온에서 30분 동안 30RPM으로 배양합니다. 그런 다음 항체 접합 비드를 BSA 보충 PBS 1.5ml에 재현탁시키고 비드를 3밀리리터의 둥근 바닥 유세포 분석 튜브로 옮깁니다.

크라이오 바이알을 1.5ml의 BSA/PBS로 추가로 헹구고 비드로 세척제를 당겨 넣습니다. 모든 비드가 튜브의 뒤쪽 벽에 부착되고 용액이 투명해질 때까지 2분 동안 튜브를 적절한 자석에 놓습니다. 그런 다음 상등액을 제거하고 BSA/PBS 3밀리리터로 비드를 두 번 더 세척합니다.

보충제를 섭취하지 않은 PBS로 MSC를 세 번 헹굽니다. 마지막 세척 후 순한 비 트립신 용액으로 섭씨 37도에서 10분 동안 세포를 처리합니다. 모든 세포가 분리되면 새로운 폐 MSC 배양 배지를 추가하고 세포를 스핀 다운합니다.

PBS와 BSA에 펠릿을 재현탁하고 세포를 계수합니다. 그런 다음 CD146 1차 항체가 들어 있는 3밀리리터 튜브로 세포를 옮기고, 튜브를 덮고, 15RPM과 섭씨 4도의 회전 샘플 믹서에서 세포를 배양합니다. 배양이 끝나면 3ml의 PBS와 BSA로 세포를 두 번 세척하고 2차 항체 접합 비드 3mm에 두 번째 펠릿을 재현탁합니다.

섭씨 4도의 회전 시료 혼합기에서 30분 후 튜브를 자석에 놓고 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 음성 세포를 천천히 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, 자석에서 튜브를 제거한 상태에서 BSA가 보충된 PBS 3ml에 세포를 재현탁시키고 선택 과정을 4회 더 반복합니다. 마지막 음성 세포 제거 후 예열 배양 배지에서 CD146 양성 폐 MSC를 세척합니다.

마지막으로, 비드 접합 세포를 신선한 폐 중간엽 기질 세포 배양 배지에 재현탁하고 적절한 크기의 배양 플라스크에 평방 센티미터당 5, 000 세포를 배치합니다. 3-5일간의 배양 후 플라스틱 순응도는 CD90에 대한 밀도 구배 분리 계면 모집단을 풍부하게 합니다. CD73입니다. 및 CD 146 양성 폐 MSC.

더욱이, 이러한 세포는 약 30%의 집락 형성 단위 효율을 가질 수 있으며, 이는 세 가지 고전적인 MSC 계통을 따라 분화되는 골수 또는 기타 MSC 하위 집합에 대해 일반적으로 보고되는 것보다 훨씬 높습니다. CD146 양성 하위 모집단에서의 양성 선택은 표면적으로 MSC 관련 표면 마커 발현 세포의 비율이 더 높은 것으로 입증된 바와 같이 폐 MSC가 고도로 농축된 세포 집단을 초래합니다. 이러한 세포는 또한 CD146 선택 전에 얻은 총 중간엽 세포 집단과 비교하여 특히 연골형성 계통 세포에서 상당히 높은 집락 형성 잠재력과 더 강력한 분화 반응을 보여줍니다.

주목할 점은 이러한 폐 MSC는 매우 적은 수의 실제 지방 세포를 형성하며, 이는 폐 발달과 폐포 유형 2 세포 지지에 중요한 lipofibroblast 계통을 반영할 수 있는 작은 지질 소포로 채워진 더 많은 방추체 모양의 세포를 나타냅니다. 이 기술을 숙달하면 6일에서 10일 이내에 CD146 양성 폐 MSC를 얻을 수 있지만 수율은 동물의 연령과 종에 따라 다릅니다. 이 절차를 시도하는 동안 세포의 생존력을 보존하기 위해 빠르게 작업하는 것이 중요합니다.

이 절차에 따라 혼합 림프구 반응 또는 상처 치유 SA와 같은 다른 방법을 수행하여 T 세포 증식을 억제하고 상처 치유를 지원하는 MSC의 효율성에 대한 추가 질문에 답할 수 있습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 효소 분해, 밀도 구배 분리, 소성 부착 및 비드 분류를 사용하여 CD146 양성 폐 MSC를 분리하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.