Name: CD146의 분리 + 주민 폐 중간 엽 기질 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: 학습하세요 효소 소화, 밀도 구배 분리, 플라스틱 부착 및 CD146+ 자기 비드 선별을 사용하여 쥐 폐에서 거주하는 중간엽 기질 세포(MSCs)를 분리하는 방법을. 이 기술은 폐 질환 연구에서 면역 조절 및 조직 복구 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

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JJPC는 캐나다 보건 연구소(CIHR) 박사후 연구원의 지원을 받습니다. MAM은 독일 국립 학술 재단(German National Academic Foundation - Studienstiftung des Deutschen Volkes)으로부터 성적 장학금을 받았으며 EFCNI(European Foundation for the Care of the Newborn Infant)의 보조금을 받습니다. BT는 CIHR, 캐나다 폐 협회(Canadian Lung Association), 줄기 세포 네트워크(Stem Cell Network) 및 이스턴 온타리오 아동 병원(Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute)의 지원을 받고 있습니다.

모든 절차는 오타와 대학의 동물 관리위원회 (동물 윤리 프로토콜 OHRI-1696)에 의해 승인되었다. 동물 관리 기관은 지침에 따라 수행 하였다. 폐 중간 엽 기질 세포의 분리 (1) <ol><li> 50 ML 튜브에 효소 믹스를 준비 : 30 U 중립 프로테아제에 무게, 2,500 U 콜라게나 I 500 U DNase의 I.이 금액은 성인 마우스 또는 쥐 강아지의 폐 충분. 사용까지 4 ° C에서 분리 및 저장의 날 준비합니다. </li><li> 펜토 바르 비탈 나트륨의 복강 내 주사 하루에 13에서 희생 쥐 새끼 (0.2 ㎖의 65 ㎎ / ㎖). 무의식을 설정 발가락 핀치 반사를 사용합니다. 아래에 설명 된대로 동물의 죽음은, 가슴을 열어 보장된다. </li><li> 아주 조심하지되고, 70 % 에탄올로 동물을 분사하여 피부를 소독 조심스럽게 다이어프램에서 시작 주동이의 측면으로 절단 수술 가위를 사용하여 흉곽을 열폐를 손상시킬 수 있습니다. 가슴에 대한 액세스를 제공하기 위해 흉곽을 절단 대안 지혈 클램프를 사용하여 열려있는 흉곽 확산, 또는. </li><li> 마음을 제거하여 동물에게서 피를 뽑다. 마음을 제거하려면, 작은 집게로 흉선과 마음을 잡고 수술 가위이를 절단. 더 이상 혈액이 절단 된 대동맥과 폐동맥 나오는 않을 때까지 즉시 그 후, 거즈로 피를 흡수한다. </li><li> 다음과 같이 흉부에서 폐를 제거 : 작은 집게로 기관을 보유하고 주동이의 측면에서 수술 가위로 기관을 절단. 부드럽게 가슴에서 폐 패키지를 당기면서, 폐를 무료로 흉곽을 따라 지느러미 측면에있는 결합 조직을 절단. </li><li> 수술 가위로 다이어프램을 따라 절단하여 대동맥과 식도에서 폐를 절단. 이제 폐가 완전히 가슴이없는 것을 거즈로 부드럽게 남아있는 혈액을 제거합니다. </li><li> 쉬르와 기관 및 기관지를 제거학적 위 신중 차가운 35 mL의 30 % 시트르산 - 인산 - 덱 스트로스 아데닌 (CPDA-1) 항응고제를 함유하는 50 ㎖ 튜브에 폐 로브 트랜스퍼 (26.30 g 트리 나트륨 시트 레이트 이수화 물, 3.27 g 아스코르브 산 수화물 2.22 g 모노 나트륨 디 히드로 겐 포스페이트, 31.80 g의 D- 글루코오스는, 1 L의 0.275 g 아데닌은 H 2 O를 정제하여, 멸균 필터 혈액과 이물질을 제거하기 위해 인산 완충 식염수 (PBS)에 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터)를 사용하여 용액. </li><li> 30 % CPDA-1 / PBS에서 5 분간 세정 한 후, 35 mL의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS) (RT)를 함유하는 새로운 50 ㎖ 튜브에 폐를 전송하고, 시트르산을 제거 부드럽게 반전. 포함하는 튜브로 전송 35 ml를 둘 베코의 PBS + 나트륨 - 피루브산 + 포도당 (DPBS ++) (RT). 각 세척 단계는 약 5 분 소요됩니다. 주 : 염화칼슘 이수화 132.4 ㎎, 염화 마그네슘 수화물 100 ㎎, 염화칼륨 (무수) 200m : DPBS ++ 상업적으로 정렬 또는 구성 될 수있는 21 이하g, 1 인산 칼륨 (무수물) 200 ㎎, 염화나트륨 (무수) 8000 ㎎, 인산 나트륨 (무수) 1,144.5 ㎎, D- 글루코스 1,000 ㎎, 피루브산 나트륨 36 mg을 1 L 정제 H 2 O, pH가 7.3. 멸균 필터를 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 용액. </li><li> (37 ° C로 미리 예열) ++의 DPBS 10 ㎖를 첨가하고 용해 될 때까지 조심스럽게 반전 효소 믹스를 녹인다. </li><li> 새로운 50 ㎖ 튜브에 폐를 전송하고 잘게 다진까지 메스를 사용하여 튜브의 벽에 폐 들어온다. 조직에 (10 ㎖ 성인 마우스 / 쥐 강아지 폐 당 효소 믹스 /) 효소 믹스를 추가 단단히 튜브를 닫고 (교반과 함께 38 ° C에서 부화 중 하나를 열 믹서, 진탕 수조 또는 물에 일반 수동 교반 조). 태아 조직 60 분, 청소년 / 성인 조직 90-120 분, 섬유 성 성인 조직 120-150 분 : 기간은 조직의 유형에 따라 달라집니다. </li><li> 가의 양이온 w 킬레이트하여 소화를 중지i 번째 200 μL 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 0.15 M, pH가 7.4. 멸균 필터를 사용하기 전에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 용액). </li><li> 20 mL의 5 % 소 태아 혈청 (FBS) / PBS를 첨가하고 50 ㎖의 새로운 튜브에 100 μm의 셀 스트레이너를 통해 전체 현탁액을 통과한다. 40 ml의 총 부피를 데리고, 10 ml의 5 % FBS / PBS로 튜브와 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> 500 XG, 실온에서 5 분 동안 원심 분리기. </li><li> 40 ml의 5 % FBS / PBS에 재현 탁 (펠렛 명확하게 볼 수 있어야합니다) 상층 액을 제거하고 원심 분리 단계 1.13를 반복합니다. </li><li> 4 ml의 5 % FBS에 재현 탁 / PBS (RT) 위에 조심스럽게 3 ㎖ 밀도 구배 매체 층 (1.073 g / cm 3) 15 ㎖의 튜브 14. 양호한 계면을 얻기 위해서는, 단일 세포 현탁액의 계층화는 매우 낮은 속도에서&gt; 45 ° 각도에서 발생하는 것이 중요하다. </li><li> 900 XG에 원심 분리기 20 분, 중간 (5/10) 가속, 감속 없음, 19 ° C. </li><li> 의에 존재하는 세포를 수집terphase 및 멸균 PBS 10 ㎖에이를 재현 탁. </li><li> 500 XG에 5 분, 21 ° C에 대한 원심 분리기. </li><li> 500ml의 αMEM, 20 % 부피 / 부피 FBS 당 2 밀리몰의 L 글루타민, 상청액을 제거하고 10 ㎖의 세포 펠렛을 재현 탁 예열 완료 L-MSC 배지 (최소 필수 매체 이글 알파 변경 (αMEM) 1 % 부피 / 부피 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 암포 테리 B. </li><li> 반복 원심 분리 단계 1.18. 그 후, 미리 예열 신선한 배지 10ml에 뜨는 및에 resuspend를 제거합니다. </li><li> 이 단계에서 세포의 대부분은, 플라스틱 접착하지 않기 때문에, 고밀도 또는 자동 혈구 세포 카운터 플레이트를 이용하여 세포 수를 계산. 래트 새끼 폐에서 세포가 1-2의 접종 밀도로 충분히 조밀 한 반면 정확한 도금 밀도는 X, 예를 들면, 성인 마우스의 폐의 세포를 105 세포 / cm 2의 시딩 동물의 종 및 나이에 따라 104 세포 / ㎠ </sup&gt;. 0.2 ml의 L-MSC 배양 배지 / cm 2를 사용합니다. </li><li> 배양 L-MSC들 가습 5 % O 2, 5 % CO 2 분위기에서 37 ℃. </li><li> PBS로 한번 세척 한 후 중간 초기 시딩 후 24 시간, 그 후 매 3 일마다 변경합니다. 세포 기원의 동물에 따라 평균 3-5 일이 소요 80-90% 합류, 때까지 배양해야한다. 높은 합류는 섬유 아세포로 분화를 촉진 할 것이다. </li></ol> CD146 + 폐 중간 엽 기질 세포의 2. 선택 <ol><li> 이차 항체와 자석 구슬의 코팅 <ol><li> 멸균 조건 cryovial 코트 환저 10 μg의 차 항체 / 100 μl의 자성 비드의 비율 비오틴 이차 항체와 자성 비드, 2 ㎖의 멸균. 예상 0.5 × 10 6 세포 당 10 μl의 차 항체를 사용하여 100 ㎕의 자기 구슬과 10 μg의 항체의 최소 사용합니다. 주 : 비율을제조 업체 사이에 다를 수 있습니다 구슬의 볼륨 당 사용 tibodies는 선택의 구슬에 대한 제조업체의 지침을 참조하십시오. 이 프로토콜은이 프로토콜의 최적화에 사용 된 구슬과 항체 표 1을 참조하시기 바랍니다. </li><li> RT / 분 (30)의 회전 수 (rpm)에서 30 분 동안 샘플을 회전 혼합기에서 인큐베이션. </li><li> 1.5 ㎖의 멸균 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA)에 비드를 재현 탁 / PBS 및 3 ㎖에 전송 둥근 바닥 튜브 (튜브 유동 세포 계측법). 추가로 1.5 ml의 0.1 % BSA / PBS로 c​​ryovial을 씻어 3 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 해당 자석에 튜브를 삽입하고 모든 비드가 튜브의 후 방벽에 부착되고, 투명한 용액이 유지 될 때까지 2 분을 기다린다. 3 ml의 0.1 % BSA / PBS 두 번에 유출 반복 세척을 제거합니다. </li><li> 빛으로부터 보호 4 ° C에서 3 ml의 0.1 % BSA / PBS에있는 구슬과 저장소를 재현 탁. 후 5 일 이내에 사용하십시오. </li></ol></li><li> CD146 + L-중간 엽 줄기 세포를 표지<ol><li> 부드러운 비 트립신 용액을 사용하여 PBS로 세정 후, 중간 엽 세포를 수확. 참고 : 볼륨은 문화 플라스크의 크기 (0.2 ㎖ / cm 2 중간 또는 PBS)에 따라 달라집니다. <ol><li> 배지를 제거하고 멸균 PBS로 세포를 세 번 씻어. </li><li> 부드러운 비 트립신 용액의 적절한 용적을 추가 (표 1 참조). 세포가 분리 될 때까지 표 1의 용액을 사용하는 경우 대략 배양기에서 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션. </li><li> 500 x g에서 5 분 동안 L-MSC 배지, 원심 분리를 첨가하여 효소를 불 활성화. </li></ol></li><li> 0.1 % BSA / PBS에 재현 탁 세포 상층 액을 제거하고 혈구 또는 자동 세포 계수기와 세포를 계산합니다. 참고 : 0.1 % BSA의 볼륨 / PBS 문화 플라스크의 크기에 따라 달라집니다 : 5 또는 10 ml의 0.1 % BSA / PBS 목표. </li><li> 단계를 반복 2.2.2 3 ml의 0.1 % BSA / PBS (블록되지 않은 세포의 전용 금액을 재현 탁특정 결합 부위 등) 살아있는 세포를 유지합니다. 얼음에 세포를 유지합니다. </li><li> 기본 안티 CD146 항체 바닥 튜브 라운드 3 ㎖를 준비하고 얼음에 보관하십시오. 주 : 셀 전용 량 첨가 차 항체의 농도는 사용되는 항체에 따라 달라진다. 제안 안티 쥐 CD146 항체는 표 1을 참조하십시오. </li><li> 일차 항체와 튜브 단계 2.2.3에서 세포의 총 부피를 추가한다. 닫기 긴밀하게 15 rpm으로, 4 ° C에서 회전 샘플 믹서에 30 분을 품어. </li><li> 500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리기 세포는 3 ml의 0.1 % BSA / PBS에 뜨는 및에 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다. 반복 원심 분리 단계를 포함한다. </li><li> 2.1의 지침에 따라 제조, 15 rpm으로, 4 ° C에서 회전 샘플 믹서에 30 분 배양 된 이차 항체 코팅 구슬을 포함하는 3 ㎖ 용액에 세포를 재현 탁. </li></ol></li><li> CD146 + L-중간 엽 줄기 세포를 선택<ol><li> 자석에 표시 CD146 + L-중간 엽 줄기 세포를 포함하는 튜브를 놓습니다. 양성 세포는 튜브의 후방으로 인출된다. 튜브를 이동하거나 구슬을 건드리지 않고, 천천히 멸균 파스퇴르 피펫 (이 수집하거나 실험 설계에 따라 폐기 될 수 있습니다)와 음성 세포와 상층 액을 수확. </li><li> 자석에서 관을 제거하고 3 ml의 10 % BSA / PBS에 세포를 재현 탁. 단계 2.3.1에 ​​설명 된 선택 절차를 반복합니다. 네 번 이상 (Σ 5 선택 단계). </li><li> 예열 L-MSC 배지에서 CD146 + L-엽 줄기 세포를 재현 탁 및 자석에 반환한다. </li><li> 적절한 크기의 문화 플라스크 (0.2 ㎖ / cm 2)에 L-MSC 문화 매체와 접시에 뜨는,에 resuspend를 제거합니다. 경험적으로, 동일한 크기의 배양 플라스크에서 세포를 플레이트있는 세포 비드 선택 이전에 해제되었다. CD146 + L-엽 줄기 세포의 수, 따라서 도금 밀도 것소스 동물의 연령, 종 및 변형에 따라 달라집니다. 항상 ~ 5,000 세포 / cm 2의 도금 밀도를 목표로하고 있습니다. 주 : 비드 세포 성장을 방해하지 않으며, 세포 증식 점차 사라진다. </li></ol></li></ol> 3. 냉동 세포 <ol><li> 다음 동결 미디어 사용하여, 20 % FBS, 12.5 % (0.9 % NaCl을 10 % pentastarch) 60 % pentastarch 용액 CPDA-1, 2.5 % 염화나트륨 (0.9 %), 5 % 디메틸 술폭 시드 (DMSO) 22. 주 : 모든 재료를 사용할 수있는 경우, 5 % DMSO, 30 % FBS와 65 % αMEM를 함유하는 용액이 좋은 대안이된다. </li><li> 1 ml의 각 크리오 바이알 (cryovial) 0.5 × 106 세포 / ㎖, 분취 액에 재현 탁 된 세포는 냉동 컨테이너를 사용하여 -80 ℃에서 O / N을 고정. </li><li> 다음날 액체 질소 저장 탱크에 전송합니다. </li></ol> 4. 해​​동 세포 <ol><li> 5 분 동안 37 ° C까지 수조에서 세포의 바이 얼을 해동. </li><li> (10) 용액에 재현 탁 세포미리 예열 문화 매체와 500 XG에 5 분, 21 ° C에 대한 원심 분리기. </li><li> 상청액을 제거하고 10 ㎖의 배지에서 세포 펠렛을 재현 탁. 통기 캡 세포 배양 종자 세포 0.2 ㎖ / cm2 배지에서 5,000 세포 / cm 2에서 플라스크를 처리 (예를 들면, 75cm 2 플라스크에 15 mL)을 첨가 하였다. </li><li> 5 %에서 배양 세포 O 2, 5 % 수확 및 / 또는 실험적인 사용을위한 80-90% 합류 할 때까지 CO 2. 오버 포화 상태가 분화를 유도 할 것이다. 5,000 세포 / cm 2에 파종 할 때, L-중간 엽 줄기 세포는 배양 3 ~ 4 일 이내에 80~90%의 포화 상태에 도달합니다. </li></ol>

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차 L-중간 엽 줄기 세포의 분리 및 배양은 더 나은 자신의 기능과 세포 수준에서 다른 세포 집단과의 상호 작용, 폐 개발, 건강과 질병에서의 역할을 이해 할 수있는 기회를 제공합니다. 이들 세포의 특정 단일 마커의 부족이 거의 불가능 반응계에서 이들 세포를 연구 할 수있다 이것은 특히 중요하다. 모든 기본 세포 집단과 마찬가지로, 하나는 이러한 세포들이 (24에서 검토) 문화 (19)에 보관되어 더 이상 자신의 캐릭터를 변경 가능성이 있음을 알아 두셔야합니다. 자연 상태에 가능한 한 가깝게 한 상태에서 L-엽 줄기 세포를 유지하기 위해, 그들은 37 ° C 가습 인큐베이터에서 5 % O 2, 5 % CO 2에서 배양하는 것이 매우 중요하다. 호흡 생리 일반적 분압 돌턴의 법칙에 기초하여, 주위 공기 (21 % O 2)의 산소 분압이 10 ~ 160 mmHg로, 그리고 방울 것을 수락폐포 영공 25-27<...

중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 개발하는 동안, 폐 비롯한 중간 엽 발달 큐의 중요한 원천이며, 거주자 엽 줄기 세포는이 중심에있을 가능성의 후보이다. 또한, 증거는 상주 중간 엽 줄기 세포가 암 1, 2, 3 섬유증을 포함한 성인병에 교란되는 부상하고있다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물이 셀 (4)의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 줄기 세포 항원 1 SCA (1)의 조직 줄기 세포의 다양한 마커로서 마우스에서 확인하고, L-5 엽 줄기 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 불행하게도 갖는다다른 종 6 orthologs은 알려진 바 없음. 연구팀은 폐 조직 또는 유체 중 하나에서 L-중간 엽 줄기 세포의 분리를위한 다른 분리 다양한 방법을보고했다. / CD45 - - / CD90 + 세포 (7), CD31 - / CD45 - / 상피 세포 부착 분자 (는 EpCAM) -이 CD31에 대한 선택 (FACS) 기반 방법 정렬 형광 활성화 세포 다를 / 무서-1 + 세포 8 약제 내성 트랜스 다진 조직 (13) 중 플라스틱 부착 11, 12 및 마이그레이션에 ATP 바인딩 카세트 G (ABCG2) 양성 세포 9 훽스트 33342 염료 유출 10. 본원에 제시된 방법의 장점은 여러 배이다. 부드러운 효소 소화와 밀도 구배 (14)를 사용함으로써, 하나의 중간 엽 줄기 세포를 포함하지만, 상피 세포 또는 내피 세포를 제외 밀도 범위의 모든 세포를 얻는다. 후속 플라스틱 접착 공정 만 mesench 보장ymal 세포는 백혈구를 제거, 준수 문화를 유지. 이들 세포는 CD146을 발현하지 않는 가장 중요하지만, CD146 + 선택 단계는 섬유 아세포의 제거를 허용한다. 세포 부착 분자 CD146의 발현 양 능성과 상관되고, 중간 엽 세포 집단 15-19에서 섬유 아세포를 걸러 좋은 마커 따라서이다. 그것만 엽 줄기 세포뿐만 아니라 lipofibroblasts 5,20에서 발현되지 않기 때문에 이는 선별 마커로서 CD90을 사용 위에 이점이다. 이 세포에 완만으로이 프로토콜에서 우리는 명시 적으로, 자기 비드 선택을 선택했으며, 전체 절차는 무균 상태에서 수행 할 수 있습니다. 가지 방법과 반대로,이 분리 방법의 다른 중요한 이점은 가지 방법에 대해 개월 이상의 대향로 6-10 일 비교적 빠른 점이다. 3 ~ 5 일 초기 격리 후 중간 엽 인구는 CD146 + 실리 준비가<html> ction; 다른 3-5일 후 CD146 + 세포는 실험에 사용될 준비가 이후 사용을 위해 고정 될 수있다. 중간 엽 줄기 세포는 장기간의 체외 배양 (19)의 섬유 아세포으로 transdifferentiate로 문화의 감소 시간은 세포의 품질을 향상시킵니다. 마지막으로 인해 프로토콜의 특성으로 인해 소화 효소와 인큐베이션 시간의 선택을 조정함으로써, 다른 기관계를 단순히 적절한 항체를 선택하는, 또는에 의해 다른 종에이 방법을 적용하는 것이 가능하다. 이 분리 방법의 상세한 프로토콜은 아래와되고, 분리 및 CD146 + 아군 후속 선택의 개략도는 각각도 1a 및 1b에 제공된다. 또한, 세부 사항은이 세포를 냉동과 해동, 계대 포함되어 있습니다. 광고 / 53782 / 53782fig1.jpg &quot;/&gt; . 폐 중간 엽 세포 (A) 및 후속 CD146 + 세포 선택 (B) 분 = 분 격리 그림 1. 개요도; EDTA = 에틸렌 디아민 테트라 아세트산; 2 차 순이 = 차 항체; α-CD146 순이 = 차 항 CD146 항체; - 제가 세포 = CD146 부정적인 세포; + 세포 = CD146 양성 세포를했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53782/53782fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Neutral Protease</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS02104</td><td>격리 당일에 준비하고 4 &deg에 보관하십시오. C 사용</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td>격리 일에 준비하고 4 &deg에 보관하십시오. 사용</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td>까지 <td>C 격리 당일에 준비하고 4°C에 보관하십시오. C 펜</td></tr><tr><td>토바르비탈 나트륨 (안타닐)</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc, Dublin,</td> <td>Ireland-Use</td> <td>0.2 ml for rat ppup 20-30 g; 더 큰 동물은 더 많이 필요할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>둘베코' s PBS + 나트륨-피루브산 + 포도</td>당 <td>생명 기술</td><td>14287-072</td><td>이 D-PBS에 존재하는 칼슘과 마그네슘이 효소 소화를 촉진하기 때문에 이러한 유형의 D-PBS를 사용하는 것이 매우 중요합니다</td></tr>. <tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM (1.073 g/cm3)</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-5446-52</td><td>밀도 그라디언트 미디어. 양호한 간기를 얻으려면 단일 세포 현탁액의 층이 >45°C에서 발생하는 것이 중요합니다. 매우 낮은 속도에서 각도를 이루고 후속 원심 분리는 19°C에서 수행됩니다.</td></tr><tr><td>&알파; MEM</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8042</td><td>웜 37 &deg; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>200 mM L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>100x 항생제-항진균제</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>페니실린/스트렙토마이신/곰팡이존</td></tr><tr><td>M-280 Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>11205D</td><td>마그네틱 비드</td></tr><tr><td>비오틴화 다클론 토끼-안티-마우스 IgG</td><td>Dako, Agilent Technologies</td><td>E0464</td><td>Dynabeads와 함께 사용하는 것이 권장되는 DynaMag5-magnet Life Technologies 12303D 자석에 설명된 항-쥐 CD146 항체와 일치하는 바이오틴화된 2차 항체</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>. 참고: 자석은 제조업체에 따라 선택해야 합니다.' S 선택 자석 구슬의 지침.</td></tr><tr><td>TrypLE 익스프레스&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12605-028</td><td>순한 비 트립신 대체품, 1ml의 TrypLE express/25cm2 표면적을 사용하십시오. 분리 후 10ml L-MSC 배양 배지는 3ml TrypLE</td></tr><tr><td>항쥐 CD146 항체</td>를 비활성화하기에 충분합니다<td>.</td><td>C35841</td><td>12.5 & l per 0.5 x 106 세포</td></tr><tr><td>펜타스타판(펜타스타치 용액)</td><td>Bristol-Myers Squibb Canada</td><td>-</td><td>지역 헌혈 서비스 또는 혈액학과를 통해 얻을 수 있습니다. 또는 0.9% NaCl로 1:1로 희석된 PSI 20% 펜타스타치 용액(Preservation Solutions, PST001)을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Mr. Frosty 냉동 용기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5100-0001</td>은 <td>-80°C에서 밤새 L-MSC를 동결할 때 생존력을 향상시킵니다. 씨</td></tr></tbody></table>

cd146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

중간 엽 기질 세포 (중간 엽 줄기 세포는) 점점 폐 질환을 포함한 질병의 넓은 범위에서 자신의 치료 가능성을 인정 받고 있습니다. 골수 및 외인성 세포 치료를위한 제대혈 중간 엽 줄기 세포의 사용 외에, 또한 주민 조직 중간 엽 줄기 세포의 복구에 대한 관심과 회생 가능성이 증가하고있다. 또한, 그들은 가능​​성이 정상 장기 발전에 역할을, 질병의 역할, 섬유 성 자연과 특히 때문이라고했다. 이러한 상주 조직 엽 줄기 세포의 연구를위한 주요 장애물은 이러한 세포의 분리 및 식별을위한 명확한 마커의 부족이다. 여기에 설명 된 분리 기술은 폐 상주 중간 엽 줄기 세포 (L-중간 엽 줄기 세포)의 여러 특성을 적용합니다. 쥐의 희생에, 폐를 제거하고 혈액을 제거하기 위해 여러 번 세척한다. 메스에 의한 기계적 해리 후에, 폐 콜라겐 타입 I, 중성 프로테아제 및 DNase의 유형 I. obtaine의 혼합을 사​​용하여 2-3 시간 동안 소화D는 단일 세포 현탁액을 연속적으로 세척하고, 밀도 구배 배지 (밀도 1.073 g / ㎖) 위에 적층된다. 원심 분리 후, 계면에서 세포를 세척 및 문화 처리 된 플라스크에 도금. 세포는 생리 5 % O 2 4 내지도 7 일간 5 % CO 2 조건에서 배양했다. 섬유 아 세포 (CD146을 -) 고갈 및 CD146 + 세포 만 L-중간 엽 줄기 세포 (CD146 +), 긍정적 인 선택의 인구를 보장하기 위해 자기 비드 선택을 통해 수행된다. 요약하면,이 절차는 확실하게 더 시험관 연구와 조작을위한 기본 L-중간 엽 줄기 세포의 인구를 생성합니다. 때문에 프로토콜의 특성 때문에 용이하게 다른 실험 동물 모델로 변환 할 수있다.

중간 엽 줄기 세포 밀도 및 플라스틱 접착의 가장 신뢰할 수있는 물리적 특성 둘, L-엽 줄기 세포를 포함하는 폐 중간 엽 세포 분획을 얻기 위해이 프로토콜의 첫번째 부분에서 사용된다. 밀도 구배 상간 폐 중간 엽 세포뿐만 아니라 단핵구 및 대 식세포를 포함 할 것이지만, 플라스틱 접착 배양 3-5 일까지 만 폐 중간 엽 세포 유지되도록 하였다. 실제로이 세포 인구는 고전 MSC 표면 마커 CD73, CD90 및 CD146을 표현하고 더 이상 어떤 백혈구 존재가 있음을 표시하지 마커 CD34, CD45, 주요 조직 적합성 복합체 유형 II (MHCII) -RT1B, CD11b를하고 CD79a에 대한 부정적 세포 집단 (도 2A). 관심 CD146 + 서브 세트에서, 44.4-65.7 %의 범위는 CD73 + 및 CD90 + (데이터는 도시하지 않음)는 것이다. 또한,이 세포 집단을...

이 프로토콜은 소화 효소, 밀도 구배 분리, 수지 밀착성 및 CD146 + 자성 비드의 선택을 이용하여, 래트에서 일차 폐 상주 간엽 기질 세포를 얻기위한 분리 기술을 설명한다.

CD146의 분리<sup&gt; +</sup쥐 폐에서&gt; 주민 폐 중간 엽 기질 세포

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

이 절차의 전반적인 목표는 효소 소화, 밀도 구배 분리, 플라스틱 부착 및 비드 소팅의 조합을 사용하여 쥐 폐에서 분리한 CD146 양성 상주 중간엽 기질 세포(Mesenchymal Stromal Cell, MSC)를 인비트로(invitro) 특성화하는 것입니다. 이 방법은 폐 MSC가 질병 상태에서 어떻게 감염되는지, 그리고 면역 조절 및 조직 복구에 어떻게 기여하는지에 대한 폐 질환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 속도가 빠르고 재현성이 높으며, 다양한 실험 동물 종이나 조직에 쉽게 적용할 수 있다는 점입니다.제 절차의 첫 단계는 저희 실험실의 연구원인 Arul Vadivel이 시연하겠습니다. 흉강에서 폐를 제거하려면 작은 포셉으로 기관을 잡고 외과용 가위로 앞쪽(rostral side)의 기관을 분리하십시오. 그다음, 폐 덩어리를 흉강 밖으로 조심스럽게 끌어당기면서 늑골을 따라 등쪽(dorsal side)에 있는 결합 조직을 잘라내십시오.횡격막을 따라 절개하여 폐를 대동맥 및 식도와 분리하고, 거즈를 사용하여 폐 조직에 남아 있는 혈액을 부드럽게 제거합니다. 가위로 기관과 기관지를 제거한 후, 혈액과 부스러기를 제거하기 위해 차가운 CPDA 항응고제와 PBS 35 mL가 담긴 50 mL 튜브에 폐엽을 조심스럽게 넣습니다. 5분 후, 폐를 실온의 멸균 PBS 35 mL가 담긴 새로운 50 mL 튜브로 옮깁니다.그다음 부드럽게 뒤집어 시트르산(citrate)을 제거합니다. 5분 후, sodium pyruvate와 glucose가 첨가된 상온의 멸균 Dulbecco's PBS 35 mL가 담긴 새로운 50 mL 튜브에서 폐를 헹구고 부드럽게 뒤집어 줍니다. 그런 다음 폐를 또 다른 50 mL 튜브로 옮기고, 메스를 사용하여 튜브 벽면에서 조직을 잘게 다집니다.최대한의 세포 수율을 확보하기 위해서는 조직을 아주 작은 조각으로 자르는 것이 매우 중요합니다. 또한, 강력한 세포 생존력을 보장하기 위해 빠르게 작업해야 합니다. 조직을 모두 잘게 다졌으면, 갓 준비한 효소를 튜브에 넣고 뚜껑을 단단히 닫으십시오.그런 다음 조직 조각을 38 °C에서 적절한 소화 시간 동안 부드럽게 흔들어주며 배양합니다. 배양이 끝나면 200 µL의 멸균 여과된 EDTA를 넣어 소화를 중단시킵니다. 조직 슬러리에 FBS가 보충된 PBS 20 mL를 추가하고, 전체 현탁액을 100 µm 세포 스

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

쥐 MSCS는 대퇴골과 tibias으로부터 격리하고 자기 세포 분류에 의해 풍부하게되었다. 정렬 세포 유동세포계측법에 의해 표면 마커의 표현에 대해 확인했다. 이러한 세포는 하나의 식민지를 형성 clonal 밀도에 교양 있었다 그리고 이들 식민지는 복제 실린더로 구분했다.

분리 및 랫 Mesenchymal 줄기 세포의 농축 (MSCS)와 MSCS를 유래 단일 식민지의 분리

이 문서에서 우리는 murine 주민 폐 mesenchymal 줄기 세포 (MSC 폐), 그들의 확장, 특성화 및 immunomodulatory 속성의 분석의 절연을 보여줍니다.

Hoechst의 분리 및 특성 낮은 CD45 부정적인 마우스 폐 Mesenchymal 줄기 세포

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

이 기사에서는 신생아 마우스에서 일차 폐 내피 세포를 분리하고 배양했습니다.

일차 마우스 폐 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 Sprague Dawley 쥐에서 지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포(MSC)를 분리하고 식별하는 방법론을 설명합니다.

Sprague Dawley 쥐의 지방 조직에서 유래한 중간엽 줄기 세포의 분리 및 식별

턱뼈 골수에서 채취한 중간엽 줄기세포는 다양한 분화, 자가 재생, 면역 조절에 중요한 기능을 합니다. 그들은 유전자 치료, 조직 공학 및 재생 의학에서 전구 세포의 중요한 저장소로 부상했습니다. 여기에서는 쥐에서 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포를 분리하는 독특한 방법을 제시합니다.

Technique for Isolation and Culture of Rat Jaw Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells(쥐 턱뼈 골수 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양 기법)

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

아래에 설명된 프로토콜은 특이적 레티노이드 자가형광을 사용하고 형광 활성화 세포 분류를 사용하여 매우 이질적인 폐 세포 집단에서 레티노이드 함유 세포를 분리하는 간단하고 효과적인 방법입니다.

세포 분류에 의한 폐 레티노이드 함유 세포의 분리

이 프로토콜은 실험 이식을 위해 autologous 쌍을 생성하는 동물의 혈청을 사용하지 않고 고립과 mesenchymal stromal 세포와 내피 세포의 콜로니 형성 이후의 확장을 설명합니다.

인간 탯줄의 분리 및 동물 혈청 무료 확장 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCS)와 내피 콜로니 형성 전구 세포 (ECFCs)을 유래

기본 hepatocytes는 생리학 관련 실험 시스템의 생화학, 분자, 그리고 신진 대사 기능을 평가하는 유용한 도구를 제공합니다. 우리는 지속적으로 to1.0 × 10 백업 실행 가능한 hepatocytes를 생성 원위치 간 재관류에 쥐에 대한 신뢰할 수있는 프로토콜을...

쥐 간장 세포의 분리 및 차 문화

학습하세요 효소 소화, 밀도 구배 분리, 플라스틱 부착 및 CD146+ 자기 비드 선별을 사용하여 쥐 폐에서 거주하는 중간엽 기질 세포(MSCs)를 분리하는 방법을. 이 기술은 폐 질환 연구에서 면역 조절 및 조직 복구 메커니즘을 이해하는 데 활용됩니다.

CD146의 분리

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