Name: 타액 기능 저하의 쥐 모델에서 Retroductal 턱밑 글 랜드 점적 및 현지화 된 분획 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 쥐 턱밑샘에 역관류 투여법을 이용하여 방사선으로 인한 타액선 기능 저하 치료 효능을 평가하는 방법을. 국소 치료로 비표적 조직 부작용을 줄이고 방사선 손상으로부터 타액선 기능을 보호하거나 회복시키는 연구에 활용할 수 있습니다.

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방사선량 측정에 도움을 주신 Dr. John Chang(LSU Health Science Center, 방사선 종양학)에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 학회(American Cancer Society, 보조금 번호: 116945-RSG-09-038-01-CCE), 미국 국립보건원(National Institute of Health, 보조금 번호: R21CA173162) 및 파이스트-바일러 암 센터(Feist-Weiller Cancer Center)의 지원을 받았다.

모든 절차는 LSU 건강, 슈 리브 포트, 동물 관리 및 사용위원회의 승인 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 NIH의 지침에 따라이었다 하였다. 쥐 턱밑 침샘의 1 캐 뉼러 <ol><li> 주사기 - 튜브 어셈블리의 제조 <ol><li> 메스로 PE10 폴리에틸렌 튜브의 10cm 길이를 잘라. 집게 손가락과 엄지 손가락 사이의 관의 양쪽 끝을 잡고. 부드러운 불꽃 상기 튜브의 중간 부분을 가열, 부드럽게 양쪽을 잡아 당겨 길이를 두 배로 연화 튜브를 스트레칭. </li><li> 테이퍼 끝 각 - 2 캐 뉼러를 얻기 위해 45 오의 각도로 메스와 중간에 튜브를 잘라. 0.5 CC의 인슐린 주사기의 29 G 바늘 이상을 맞춤으로써 캐 뉼러의 비 테이퍼 끝을 확장합니다. </li><li> 정맥을 제거하고 주사기로 생리 식염수 220 μl를 그립니다. 공기 방울을 제거하기 위해 누릅니다. cannul를 장착바늘을 통해, 공기를 배출하고 정맥을 통해 솔루션의 자유로운 흐름을 보장하기 위해 주사기 플런저를 밀어 넣습니다. 200 μL에 볼륨을 조정합니다. </li></ol></li><li> 턱밑 글 랜드 덕트의 내부 구강 캐 뉼러 참고 : 오토 클레이브 악기 절차 이전에, 뜨거운 구슬 살균기 절차 사이에 소독. <ol><li> 스프 라그 돌리 쥐의 무게를 측정하고, 피하 주사기에서 계산 된 케타민의 볼륨 (42 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (8 ㎎ / ㎏) / 아세 프로 마진 (1.4 ㎎ / ㎏) 혼합 분배. </li><li> 검지 한 손의 엄지 손가락 사이의 꼬리의 기부를 파악하고 파악 몸체 위에 다른 손으로 밀어 동물을 억제. 엄지 손가락과 나머지 손가락으로 몸통을 누르고있는 동안 머리의 측면을 따라 색인과 중간 손가락을 휴식. </li><li> 뒷다리 근육에 마취제를 주입한다. 발가락 핀치와 눈꺼풀 반사에 의한 마취의 깊이를 확인합니다. 건조의 동안을 방지하기 위해 눈 윤활제를 적용동물 마취입니다. </li><li> 특수하게 설계된 플랫폼 (그림 1)에 동물을 배치하고 가로 막대의 위쪽 앞니의 치아를 참여. 아래 앞니 주위에 고무 밴드를 반복하고 플랫폼에 고정하여 아래 턱을 아래로 당깁니다. </li><li> 혀를 통해 멸균 봉합을 전달하고 구강의 바닥 인상을 올립니다. 지혈과 봉합을 고정하고 가로 가로대 위를 전달합니다. </li><li> 사용자 정의 내장 뺨 스프레더 (그림 1)과 함께 뺨을 확장하고 해부 현미경 입의 바닥에 설하 용의자를 찾습니다. </li><li> 섬세한 집게를 사용하여 예비 성형 PE10 튜브의 테이퍼 끝을 잡고. 조심스럽게 설하 유두의 유관 구멍에 정맥의 끝을 조작 할 수 있습니다. 이 3 스레드에 의해 정맥의 위치를​​ 확인 - 덕트에 5mm를; 이 장애물없이 통과 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 턱밑 글 랜드 Instillation <ol><li> 목의 목덜미에 피하 아트로핀 (0.5 ㎎ / ㎏)을 주입하고, 타액 분비의 감소를 위해 10 분을 기다립니다. </li><li> 시아 노 아크릴 레이트 (접착제)의 드롭 덕트 구멍을 캐 뉼러를 고정하고, 건조 할 수 있습니다. 천천히 50 μL / 분 ~의 속도로 시린지 플런저를 가압하여 마개 (200 μL / 샘)의 용액을 주입. </li><li> 지혈제와 튜브를 분쇄, 조심스럽게 주사기를 제거합니다. 동물이 의식을 회복 할 때까지 60 분 - 30 덕트에 튜브를 유지. 혀를 보유하고 봉합사를 제거합니다. </li><li> 별도의 케이지에 동물을 전송하고 복구하는 동안 따뜻한 유지하기 위해 가열 램프를 사용합니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 두지 마십시오. </li><li> 동물이 완전히 외래되면, 음식과 물에 대한 무제한 접근 할 수있는 동식물 사육장에서 그것을 집. </li></ol></li></ol> 2. 현지화 된 분획 조사턱밑 글 랜드의 <ol><li> 전술 한 바와 같이 동물을 억제하고, 뒷다리의 근육 내 케타민의 투여 (33 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (6 ㎎ / ㎏) / 아세 프로 마진 (1 ㎎ / ㎏)으로 마취 믹스. 마취의 깊이를 확인하고 눈에 윤활제를 적용합니다. </li><li> 선형 가속기 탁상에 동물 부정사를 놓고 머리를 기울여 목을 확장합니다. 흉골의 상단 하악골의 하부 경계에서의 영역을 포함하는 방사선 필드 (3cm 슬릿 폭)을 시준. </li><li> 이 지역에 걸쳐 1cm 조직 - 상응하는 덩어리를 놓고 방사선 소스와 100cm에 덩어리의 상단 사이의 거리를 조정합니다. </li><li> 선형 가속기의 6 MV 광자 빔을 사용하여 동물 (2.5 Gy의)을 조사한다. 노출 시간을 지시한다 표면 루스하도록 방사선 소스로부터 레이트, 필드 크기 및 거리 복용량. 설정된 전류, 동물 ~ 1 Gy의 / 분의 투여 량 비율을 조사 하였다. </li><li> 노출을 반복; 8 개의 2.5 Gy의 / 일일; 사일 / 사이에 2 일 간격으로 주. 복구하는 동안 동물을 따뜻하게 유지. 완전히 외래 후 사육장으로 동물을 이동. </li><li> 선 기능 (14)을 측정하는 방사선 후 자극 턱밑 글 랜드 타액 8 주 수집합니다. 차가운 4 % 파라 포름 알데히드 / 인산염 완충 식염수 산도 7.2의 심장 재관류에 의해 마취하에 동물을 안락사. 조직 학적 및 면역 조직 화학 (14)를 분석하기위한 턱밑 샘을 근절. </li></ol>

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</ol>

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침샘은 종종 머리 목 암, 목 노드의 선택 과목 절제, 또는 지역 혈액 종양에 대한 방사선 치료를받은 환자에서 조직 복구의 임계 값을 초과 방사선 량을받을 수 있습니다. 그랜드 유체 분비 선포 세포는 말기 분화되어 있지만, 이들은 역설적 방사선에 민감하다. 분비 기능은 만성 낮은 타액 출력에 복사하고, 돌이킬 수없는 선 피해 결과의 첫 주 이내에 삭제합니다. 가난한 선 기능과 계속된다 구강 건조를 방지하기 위해, 보존 또는 분비 기능의 회복은 매우 중요하다. 방사선 손상을 방지 또는 복구하는 소설 요법, 16 ~ 20는 1 8-11 연구되고있다. 치료의 전신 투여가 아닌 대상 조직에서 원치 않는 효과의 고유 위험을 운반합니다. 침 분비하는 것을 목표로 배달 이러한 위험을 감소. Retroductal 유전자 치료 또는 예방에 효과적방사선 관련 침샘의 고통 1, 9, 11, 16,17,20 또는 치료. 그러나, 동일한 기술을 사용하여, 침샘...

건강한 조직의 담보 파괴는 암 치료의 해로운 부작용의 다수를 차지한다. 방사선 필드 거짓말 주요 침샘의 일부 또는 전부가 불가피하게 파괴된다. 따라서, 골수 이식 전에 경부암, 자궁 경관 임파종 또는 전신 조사를위한 방사선 치료를받은 대부분의 환자들은 방사선, 침샘의 기능 저하 2-6의 일반적인 영구 부작용을 겪는다. 침샘의 유체 생산 선방 세포는 방사선에 심하게 민감하다. 침샘의 손상은 타액의 흐름과 같은 타액 기능 저하라고하는 조건의 급격한 감소하는 발생합니다. 타액의 흐름에서 만성 감소는 저작, 연하, 음성, 맛,하지만 강렬한 통증, 점막 눈물, 연하 곤란, 기회 감염의 병적 인 후유증으로 키 구강 활동을 손상 및 충치는을 악화환자의 건강과 기능 2,3. 방사선 관련 타액선 세포 손실 비가역 때문에, 구강 건조증의 더 교정 치료는 없다. 인공 타액 대체 및 prosecretory 약물로 증상을 assuaging에 초점을 맞추고 현재 치료는 장기적인 구호 6 비효율적이다. 개선 된 방사 전달 기술은 증상의 중증도를 감소 도움이되지만, 정상 조직에 독성 및 부작용은 암 치료에 -6,7- 제한 요소 남아있다. 방사선 - 관련 합병증을 예방하는 선제 대책 따라서, 표준이되고있다. DNA 수리 자유 라디칼 산소 종, 위탁 셀 다시 채우기를 청소할 또는 향상 라디오 - 보호제는 타액 기능 저하 8-11을 피하기 위해 탐구되고있다. 외분비 침샘의 분비는 주요 배설 덕트를 통해 입으로 배출. 일의 내 경구 삽관조영제의 주입을위한 전자 배설 덕트는 외래 환자 절차로 정기적으로 수행됩니다. 유사한 방법을 이용 침샘 직접 국소 치료 (12)를 대상으로 할 수있다. 이 외에 전신 부작용의 위험을 감소에서, retroductal 선 점안 혜택을 추가했다. 도관 트리 주위 타액선 세포의 단층 배열은 모든 타액 상피 세포 표적화 수 있고, 장벽 그랜드 행위 섬유상 캡슐 불필요한 치료 확산을 줄이기 위해. 본질적으로, 침샘은 방사선에 의한 타액의 기능 저하 등의 글 랜드 고통의 표적 치료를위한 최적 적합하다. 주 동안 - (2.5 Gy를 / 분수 / 일, 주 5 일 1.8) 암 치료에 대한 기존의 방사선은 작은 용량으로 제공됩니다. 따라서, 실험 모델의 장기화 조사 방식에 대한 효능을 보여줍니다 라디오 보호 치료는 큰 임상 베어링을 보유하고 있습니다. COMPRO분획 후 방사능 mised 타액 함수 작은 동물에 기록하지만, 방사선 소스, 도즈 비율 및 사용되는 프로토콜은 다양한 9,10,13이다되었다. 이 보고서에 retroductal 배달 및 환자 관련 방사선 소스 및 용량 부분을 사용하여 쥐 턱밑 샘의 지역화 된 방사선하는 방법을 설정합니다.

<table><tbody><tr><td>인트라메딕 폴리에틸렌 튜빙 (PE10)</td> <td>Becton Dickson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>1/2 cc 인슐린 주사기 U-100</td><td>Becton Dickson</td><td>309306</td><td></td></tr><tr><td>인공 눈물</td><td>밀러 수의사 공급&nbsp;</td><td>5098-9840-64</td><td></td></tr><tr><td>핫 비드 살균기</td><td>정밀 과학 도구</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Perma-Hand 실크 봉합</td>사 <td>Ethicon</td><td>K833H</td><td></td></tr><tr><td>Graefe forcep</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX16 스테레오 현미경</td><td>헌트 광학 및 이미징</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 MV 선형 가속기</td><td>Elekta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>볼루스 - 스킨리스&nbsp;</td><td>Civco</td><td>MTCB410</td><td></td></tr><tr><td>열 램프</td><td>Braintree Scientific</td><td>HL-1&nbsp; 110볼트</td><td></td></tr></tbody></table>

타액 기능 저하의 쥐 모델에서 retroductal 턱밑 글 랜드 점적 및 현지화 된 분획 조사

Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction

방사선 입구 안에 있는 정상 조직은 부주의로 손상됩니다. 타액선은 두경부 방사선 치료 중에 손상되는 경우가 많습니다. 돌이킬 수 없는 세포 손상은 기본적인 구강 활동을 손상시키고 구강 감염 및 충치의 위험을 증가시키는 만성적인 타액 기능 손실을 초래합니다. 타액 기능 저하와 그 합병증은 환자의 편안함에 심각한 영향을 미칩니다. 현재 이 질환의 증상 관리는 효과적이지 않으며, 이 질환을 완화하기 위한 새로운 치료법이 필요합니다. 
침샘은 배설관을 통해 분비물을 입으로 배출하는 외분비샘입니다. 이 관의 캐뉼레이션은 땀샘에 직접 접근할 수 있도록 합니다. 주요 타액선에 조영제를 후방으로 전달하는 것은 진단 영상을 위한 일상적인 외래 환자 절차입니다. 유사한 절차를 사용하여 땀샘의 국소 치료가 가능합니다. 그러나 작은 동물을 대상으로 한 전임상 연구에서 이 기술을 수행하는 것은 고유한 문제를 제기합니다. 이 연구에서는 Bruce Baum 박사의 실험실(NIH)1에서 개선된 절차인 쥐의 턱밑샘에 대한 후향 투여 기술을 설명하고 국소 분비선 방사선 조사 절차를 제시합니다.

최소한의 침습적 sialography 기술을 적응, 주요 침샘의 지역 치료는 가능하다. 쥐 턱밑 침샘에서 Retroductal 정부는 와튼의 덕트의 내부 경구 삽관 (그림 2)에 의해 시도되었다. 입의 바닥에있는 하위 언어 용의자에 열려 와튼의 타액 덕트,하지만 구멍은 쉽게 볼 수 없습니다. 캐 뉼러의 삽입은, 그러므로, 부드러운 프로빙에 의해 수행되었다. 캐 뉼러를 배치하는 동안 부적당 한 출혈 또는 덕트 천공을 방지하기 위해, 더 힘이 사용되지 않았다. 덕트의 캐 뉼러의 부드러운 저항 자유 통로는 튜브의 부드러운 전후 이동에 의해 확인되었다. 초기 실험 중 삽관 (그림 3) 헤 마톡 실린 또는 트리 판 블루 용액으로 선을 주입하고, 안락사 동물에서 선 염색을 평가하여 확인 하였다. 미군 병사볼륨이...

두경부 방사선 요법의 주요 부작용인 타액선 기능 저하로 환자의 삶의 질을 떨어뜨립니다. 동물 모델에서 새로운 치료법의 효능을 입증하는 것은 임상 전환 전에 전제 조건입니다. 이 프로토콜은 쥐의 턱밑샘에 대한 후향 투여 및 국소 방사선 조사에 대해 설명합니다.

타액 기능 저하의 쥐 모델에서 Retroductal 턱밑 글 랜드 점적 및 현지화 된 분획 조사

Normal tissues that lie within the portals of radiation are inadvertently damaged. Salivary glands are often injured during head and neck radiotherapy. ...

이 절차의 전반적인 목적은 치료제를 하악선에 역관으로 투여하여 타액 분비 기능 장애를 치료하는 효능을 평가하는 것입니다. 이 방법은 방사선 조사에 대해 어떤 치료제가 하악선 기능을 보호하거나 회복시킬 수 있는지와 같은 타액선 질환 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 타액선을 국소적으로 치료함으로써 비표적 조직의 부작용 위험을 줄일 수 있다는 점입니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 관 개구부가 보이지 않고 캐뉼라를 관 안으로 맹목적으로 조작해 삽입해야 하기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 절차를 시작하기 전, 메스로 PE 10 폴리에틸렌 튜브를 10cm 길이로 자른 다음, 양손의 검지와 엄지로 튜브의 양 끝을 잡고 튜브의 중앙 부분을 약한 불꽃 위에서 가열하며 양쪽으로 조심스럽게 당겨 연화된 튜브의 길이를 두 배로 늘립니다. 다음으로, 메스를 사용하여 튜브의 중앙을 45도 각도로 잘라 끝이 뾰족한 두 개의 캐뉼라를 만듭니다.캐뉼라 중 하나의 비테이퍼(non-tapered) 끝부분을 0.5cc 인슐린 주사기의 29 gauge 바늘 위에 씌워 늘려줍니다. 그런 다음 캐뉼라를 제거하고 주사기에 220 µL의 식염수를 흡입합니다. 주사기 몸통을 톡톡 쳐서 기포를 제거한 후, 바늘 위에 캐뉼라를 다시 장착합니다.플런저를 눌러 캐뉼라 내부의 공기를 배출하여 튜브를 통해 용액이 원활하게 흐르도록 하고, 시린지 내 식염수의 부피를 200 microliters로 조절합니다. 이제 발가락 집기 및 촉각 반사를 통해 쥐의 진정 수준이 적절한지 확인하고, 노출된 각막에 안구 윤활제를 도포합니다. 동물을 특수 설계된 고정 플랫폼 위에 놓고 상악 절치로 가로대를 물게 합니다.고무줄을 아래쪽 절치에 걸어 턱을 아래로 당깁니다. 고무줄을 플랫폼에 고정합니다. 다음으로 멸균 봉합사를 혀를 통해 통과시킨 후, 위로 들어 올려 구강저를 높입니다.그 다음 지혈鉗(hemostat)를 사용하여 봉합사를 고정하고 지혈鉗를 횡단바 위로 넘깁니다. 이어서 맞춤 제작된 볼 확장기(cheek spreader)를 이용해 볼을 확장하고, 해부 현미경을 사용하여 구강 바닥의 설하 유두(sublingual papilli) 위치를 찾습니다. 정밀 핀셋을 사용하여 미리 성형된 PE 10 튜브의 가늘어지는 끝부분을 잡고, 캐뉼라의 팁을 설하 유두의 관 구멍(ductal orifice) 안으로 조심스럽게 삽입합니다

retroductal-submandibular-gland-instillation-localized-fractionated

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 cannulation을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 본 실험은 trypan 푸른 솔루션은이 기법을 효과적으로 타겟 선에 혼합을 제공하는 방법을 보여줍니다하고, 침샘의 재생을위한 잠재적인 약물 임상 / 세포 치료 등이 새로운 접근 방법의 신뢰성을 제안하는 다이로 사용됩니다.

와튼의 덕트를 통해 마우스 턱밑 침샘의 Cannulation

보툴리눔 독소는 시알로레아 치료를 위해 타액선에 주입됩니다. 이하선과 턱밑샘 모두에 초음파 유도 보툴리눔 독소 주사는 지속적인 효능과 심각한 부작용이 없음을 보여줍니다.

보툴리눔 독소-A 주사를 초음파 유도 : Sialorrhea을 치료하는 방법

침 샘 hypofunction는 자가 면역 질환과 방사선 치료의 빈번한 결과 이다. 이러한 질병 마우스 모델에서 침 샘 기능의 재현 평가 기술 도전 이다. 여기, 쥐에 타 액 생산의 정확 하 고 재현 가능한 측정을 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

쥐에 있는 침 샘 기능의 측정 하는 방법

우리는 수술 노출 하 고 안정화 murine submandibular 침 샘 intravital 이미징 똑바로 intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 머리와 목 지역 쥐 및 다른 작은 설치류의 다른 전 동맥에 쉽게 적응 합니다.

똑바로 Intravital 현미경 Murine Submandibular 침 샘의 준비

Submandibular 동맥을 지역 약물 전달 및 새로운 치료제의 개발에 대 한 이해 침 샘 생물학에서입니다. 선물이 배달 정확성과 실험의 재현성을 향상 시키는 업데이트 및 상세한 retroductal 주입 프로토콜. 여기에 소개 하는 응용 프로그램은 고분자 나노 입자의 배달.

Retroductal 나노 Murine Submandibular 동맥에 주입

선물이 murine tracheostomy 등 3 개의 주요 침 샘의 침 컬렉션을 수행 하는 자세한 접근.

Pilocarpine 자극 다음 통해 murine 침 기능 평가 분류 한 방사선

3 차원 유기 typic 문화권을 사용 하 여 타 액 선의 형태학 및 기능적인 마커를 시각화 하는 것은 방사선을 따르는 조직 손상의 기계 장치에 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기에서 설명 하는 프로토콜은 이온화 방사선에 노출 되기 전에 섹션, 문화, 방사선, 얼룩 및 이미지 50-90 μ m 두께의 타 액 선 섹션에 관한 것 이다.

하 악 및 파 타 액 땀 샘에서 유기 유형 배양의 방사선 치료는 생체 내 특성의 핵심

타액선은 유전자 치료를 위한 조직 표적 사이트로서, 특히 유전자 전달에 의한 예방 접종 영역에서 제안되었다. 역행 마루드 주입을 활용한 비인간 영장류 모델에서 유전자 전달을 시연합니다.

벡터 유전자 전달을 위한 비인간 영장류에서 스텐센의 덕트를 통한 역행 파로티드 글랜드 주입

면역형광 이미징은 복잡하고 시간에 따라 달라지는 생물학적 과정을 단 한 번의 스냅샷으로 관찰할 수 있는 능력에 제약을 받습니다. 이 연구는 정밀하게 절단된 쥐의 턱밑샘 절편에 대해 수행된 실시간 이미징 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 접근법을 통해 항상성 중 세포-세포 상호 작용과 재생 및 복구 과정을 실시간으로 관찰할 수 있습니다.

Ex vivo Live Cell Imaging을 통한 타액선의 세포 간 상호 작용 조사

이 프로토콜은 입술 고정 장치를 음순 침샘 생검에서 사용하는 방법론과 그에 따른 장점을 설명합니다.

입술 고정 장치는 셰그렌병에 대한 입순 침샘 생검을 지원합니다

배우세요 쥐 턱밑샘에 역관류 투여법을 이용하여 방사선으로 인한 타액선 기능 저하 치료 효능을 평가하는 방법을. 국소 치료로 비표적 조직 부작용을 줄이고 방사선 손상으로부터 타액선 기능을 보호하거나 회복시키는 연구에 활용할 수 있습니다.

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