약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리 변형체 포자 소체

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

이 일련의 절차의 전반적인 목표는 방사선 약독화 플라스모듐 기생충으로 마우스를 면역시키는 것입니다. 마우스 피부의 골수성 세포 동원과 림프절 배출 분석을 용이하게 합니다. 이 방법은 살아있는 약독화 기생충에 대한 선천적 면역 반응에 관여하는 세포 행위자가 무엇인지와 같은 말라리아 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

감염 후 18-25일 사이에 혈액 식사, 감염된 모기를 얼음 위의 15ml 튜브에 모아 냉간 마취합니다. 다음으로, 튜브를 얼음 위의 페트리 접시에 조심스럽게 뒤집어 곤충을 12km 용량의 감마 또는 X 방사선에 노출시킵니다. 방사선에 노출된 모기 타액선을 얼음 위에서 15마이크로리터의 DPBS에 수집합니다.

그런 다음 땀샘을 부드럽게 부수어 포자대를 방출합니다. 고농축 기생충 현탁액을 소량으로 주입하는 것이 중요하므로 녹색 형광의 강력한 발현으로 입증된 바와 같이 잘 감염된 모기에서 충분한 수의 타액선을 채취하는 것이 중요합니다. 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 맞게 조정된 35마이크로미터 스트레이너를 통해 여과하기 전에 기생충 현탁액을 다시 매달아 놓습니다.

현미경 계수 챔버를 사용하여 분리된 포자암의 총 수를 세고 기생충 현탁액을 얼음 위의 차가운 DPBS에서 마이크로리터당 농도의 8.3배에서 4배의 포자암으로 조정합니다. 포자충을 주입하기 전에 발가락 꼬집기로 실험 동물의 적절한 진정 수준을 확인하고 각막 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 그런 다음 빠르게 작업하여 투명 테이프를 사용하여 실체 현미경으로 귓바퀴의 복부 쪽을 부드럽게 고정하고 35 게이지 바늘이 장착된 10 마이크로 리터 주사기에 0.6 마이크로 리터의 재현 된 기생충을 장전합니다.

다음으로, 귀의 등쪽 표피 아래에 비스듬한 면이 위로 향하게 바늘을 조심스럽게 삽입하고 0.15마이크로리터의 포자석을 해당 부위에 주입합니다. 주사 부위에서 특징적인 구진이 관찰됩니다. 진피를 세 번 더 주입한 후 방금 시연한 것처럼 테이프를 조심스럽게 제거하고 완전히 회복될 때까지 마우스를 모니터링합니다.

포자암 접종 후 원하는 시점에 마우스를 희생하고 즉시 절차를 시작하십시오. 마우스가 임상적 사망의 징후를 보이는지 확인하십시오. 귀와 해당 목 부위를 70% 에탄올로 소독합니다.

그런 다음 멸균 가위와 집게를 사용하여 경마관-경동맥 부위를 절개합니다. 그런 다음 두 개의 집게로 절개 부위를 늘려 회색으로 보이는 배액 림프절을 노출시킵니다. 림프절 바로 위의 결합 조직을 조심스럽게 꼬집어 제거하고 그 아래에 놓인 두 번째 집게로 추출합니다.

림프절을 4.5ml의 표준 배지를 함유하고 콜라겐분해효소와 DNase를 보충한 6웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 있는 70미크론 스트레이너로 옮깁니다. 다음으로, 접종한 귀 전체를 채취하고 두 개의 집게를 사용하여 귀를 꼬집어 등쪽과 배쪽으로 분리합니다. 그런 다음 귀의 각 측면을 소화 효소가 보충된 배지 웰당 4.5밀리리터가 들어 있는 두 번째 6웰 플레이트의 웰에 넣고 각 조직이 배지에 완전히 잠기도록 주의합니다.

림프절에서 면역 세포를 분리하려면 림프 조직 플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 CO2로 부드럽게 교반하여 배양합니다. 15분 후 각 웰에 10밀리몰 EDTA를 넣고 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 다음으로, 각 림프절에 대해 새로운 5mm 주사기 플런저의 끝을 사용하고 원을 그리며 림프절을 스트레이너에 대고 눌러 조직을 분리시킵니다.

흰색 결합 조직만 남으면 FBS 및 EDTA가 포함된 500마이크로리터의 DPBS로 스트레이너를 두 번 헹구고 세척액을 15ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 보충된 DPBS 500마이크로리터로 우물을 두 번 더 세척하고 세척액을 얼음 위에 놓인 튜브로 옮깁니다. 귀에서 면역 세포를 분리하려면 귀 첨판을 섭씨 37도에서 5%의 CO2로 부드럽게 저어 배양합니다.

20분 후 조직을 더 작은 조각으로 잘라 소화를 용이하게 하고 샘플을 인큐베이터로 되돌립니다. 40분 후, 10밀리몰 EDTA로 소화를 멈추고 플레이트를 얼음 위에 놓습니다. 절단 팁이 있는 1ml 피펫을 사용하여 각 웰의 전체 내용물을 70미크론 스트레이너가 포함된 새 웰로 옮깁니다.

그리고 5밀리리터 주사기 플런저를 사용하여 방금 시연한 것처럼 원형 운동으로 귀 조직 조각을 해리합니다. 흰색 결합 조직과 머리카락만 남으면 방금 시연한 대로 DPBS와 FBS 및 EDTA로 여과기와 웰을 세척하고 세척액을 얼음 위의 50ml 튜브에 모읍니다. 마지막으로, 보충된 DPBS로 우물을 두 번 씻고 얼음 위에 놓인 튜브로 세척물을 옮깁니다.

이 비디오에서는 기생충의 피내 주입 후 15분 후에 방사선이 약독화된 포자암이 마우스 피부로 이동하는 것을 볼 수 있습니다. 피내 포자암 주사 후 24시간이 지나면 피부와 림프절에서 전체 세포가 분리됩니다. 이 그림에서 볼 수 있듯이, 피부와 배액 림프절에 있는 골수성 세포의 빈도는 미성숙한 쥐에 비해 크게 증가되어 있습니다.

기 방사선 조사에서 포자석 주사에 대한 프로토콜의 첫 번째 단계를 숙달하면 4시간 내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 모기 타액선에서 분리된 포자암이 빠르게 감염성을 잃는다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 가능한 한 빨리 주사해야 합니다.

이 동영상을 시청한 후에는 생쥐 피부와 림프절에서 골수성 세포를 분리하여 약독화 플라스모듐 기생충의 피내 주입에 대한 면역 반응을 탐색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.