Name: 약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리 변형체 포자 소체 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 배우세요 마우스 피부와 배수 림프절에서 골수 세포를 분리하는 방법으로, 방사선 약독화된 Plasmodium 변형체 포자 소체를 피내 접종한 후 면역 반응을 분석합니다. 이 기술은 말라리아 면역학 연구와 백신 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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저자는 마우스 피부에 포자 소체의 운동의 생체 내 이미징에서 교육에 대한 사진과 바울 Formaglio을 복용에 도움을 패트리샤 Baldacci, 바네사 Lagal과 사빈 Thiberge 중요한 읽기, 이리나 Dobrescu 보낸 및 사빈 Thiberge 감사합니다. 우리는 또한 모기 양육에 대한 생산 및 아노 펠 레스 (CEPIA - 파스퇴르 연구소)의 감염에 대한 마렉 Szatanik와 센터를 감사의 말씀을 전합니다. 본 연구는의 Laboratoire 디부 우수상 &quot;전염병을 신흥의 통합적인 생물학&quot;에서 AXA 연구 기금과 기금에 의해 지원되었다 (아니. ANR-10 LabX에-62-IBEID을 부여).

<html> 모든 절차는 파스퇴르 연구소의위원회와 지역 동물 실험에 대한 윤리위원회 (윤리위원회 IDF-파리 1, 파리, 프랑스,​​ 계약 번호 : 2012-0015)에 의해 승인하고, 해당 지침과 규정에 따라 수행. 1. 재료 및 시약 <ol><li> 이전 21 설명 된대로 3~5일 출현과 후면 후 감염된 쥐에 먹이 여성 아노 펠 레스 stephensi 모기 (Sda500 변형)를 사용합니다. </li><li> 사용 기생충 구성 적 열 충격 단백질 70 (HSP70) 프로모터의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 발현 변형체 berghei ANKA 클론. 이 기생충의 라이프 사이클에 걸쳐 22 밝은 형광을 산출한다. </li><li> 사용 여성 C57BL / 6JRj 마우스 (7 주령). 참고 : 설명 프로토콜에 사용 된 모든 시약은 재료 / 장비의 수 T에 나열되어 있습니다. </li></ol>_title &quot;&gt; 2. 방사선 감쇠 모기 침샘에서 포자 소체 격리 <ol><li> 전염성 혈액 식사 후 18~25일 사이에 수집하고 이전 21 설명 된 바와 같이 얼음에 15 ML 튜브로 모기를 초기 마취. 조심스럽게 튜브를 반전하여 페트리 접시에 그들을 전송합니다. 얼음에 곤충을 유지하고 γ- 또는 X-조사의 12 krad 용량에 모기를 노출합니다. </li><li> 조사 된 모기의 침샘에서 감쇠 포자 소체를 격리는 이전 21 설명했다. 포자 소체를 해제하도록 호감을 부드럽게 얼음에 배속 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 (15 μl의 주위에) 작은 볼륨에 감염된 침샘을 수집합니다. 참고들의 강력 발현에 의해 입증 비판적 소량의 고농도 기생충 현탁액의 주입, 미리 선택된 잘 감염된 모기의 높은 번호로부터 침샘의 충분한 수를 채취하는 것이 중요녹색 형광. </li><li> 덩어리 모기 파편을 제거하기 위해 낮은 밀착성 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로 구성된 35 μm의 셀 스트레이너 캡을 통해 포자 소체 현탁액 필터. </li><li> 이전 21 바와 같이 절연 포자 소체의 총 수를 계산하고 83000 포자 소체 / μL를 얻는 냉간 1X DPBS로 기생충 현탁액의 농도를 조절한다. 다음 단계를 계속하는 동안 얼음에 기생충을 저장합니다. </li><li> 음성 대조군으로 사용하고 단계 2.2 및 2.3에 설명 된대로 샘플을 처리한다 감염되지 않은 모기의 침샘에 해당하는 번호를 수집합니다. 서스펜션의 침샘 추출물의 비슷한 농도를 얻기 위해 전술 한 바와 같이 샘플을 희석. 주 : 포자 소체 2 시간의 최대 얼음에 저장 될 수있다. 그러나 이상적으로 그들은 침샘을 분쇄 한 후 시간 이내에 주입된다. </li></ol> 진피 라에 포자 소체 3. 주입귀 YER <ol><li> 케타민의 복강 내 주사 (50 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏)의 혼합물로 동물을 마취. 마우스가 의식 불명의 상태에 각막 건조를 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 적용하는 5-8 분을 기다립니다. 모두 후방 발에 부드러운 발가락 핀치를 수행하여 마취의 깊이를 평가합니다. 주 : 마취 투여 량 미만에서 20 분 동안 지속되므로, 다음과 같이 신속하게 수행되어야한다. </li><li> 이전에 실체 (그림 1A) 아래에 위치 명확한 테이프로 복부 측면을 고정하여 마우스의 귀 날개를 안정. 조심스럽게 혈관의 손상을 방지하기 위해 귀를 누릅니다. </li><li> 재현 탁 기생충 (10)의 0.6 μL와 10 μL 주사기 / 35 게이지 비스듬한 바늘을 넣습니다. </li><li> 와, 조심스럽게 표피 아래, 귀 (그림 1A)의 등쪽면에 바늘을 삽입하여 4 주입 사이트 (사이트 당 0.15 μL)의 포자 소체 서스펜션을 제공베벨까지, 모든 혈관을 피하기 위해주의하면서. 몇 초를 제거하기 전에 주입 물의 역류를 방지하기 위해 바늘이 진피에 남아있을 수 있습니다. 절차 (도 1b 및도 1c)의 단부에 각각 주사 부위 구진 특성을 관찰한다. </li><li> 주입 후, 조심스럽게 테이프에서 귀를 제거합니다. </li><li> 단계 3.2-3.4의 기생충에 따라 동일한 용량과 반대측 귀 주입한다. </li><li> 단독 주입 및 진피 모기 재료의 증착에 의해 매개되는 염증 반응을 평가하기 위해 1X DPBS 0.6 μL 또는 비감염 모기에서 1X DPBS + 침샘 추출물 0.6 μL 중 2 부가 마우스 주입. </li><li> 새장에 다시 배치하기 전에 마취에서 마우스 복구를 모니터링합니다. 주 : 피부 적절한 포자 소체 증착 형광 현미경 (도 2a 및도 2b로 모니터링 할 수있다previsously 23 설명 참조)는, 마우스가 준비되고있다. </li></ol> 4. 피부와 배수 림프절의 해부 <ol><li> 표준 매체 (SM)를 준비 다음과 같이 둘 베코의 수정 독수리 중간 (DMEM) + 25 mM의 4- (2- 히드 록시 에틸) 400 U 보충 -1 - 라진 에탄 산 (HEPES) / ㎖ 콜라게나 제 50 μg의 / ㎖ 디옥시리보 뉴 클레아 제 (DNase의) . </li><li> DLN 샘플 잘 당 + 70 μm의 셀 스트레이너 4.5 ml의 SM (플레이트 A) 및 피부 샘플 웰 당 4.5 ML의 SM (플레이트 B)와 얼음이 6도 평면 바닥 조직 배양 플레이트를 준비합니다. </li><li> 포자 소체 접종 다음 원하는 시점에서 깊이 복강 주사 케타민 (125 ㎎ / ㎏) / 자일 라진 (12.5 ㎎ / ㎏)의 혼합물 종래 경추 탈구하여 마우스를 마취. 마우스가 임상 죽음의 흔적을 보여줍니다 확인하고 즉시 절개를 시작합니다. 참고 : 골수 세포 모집의 반응 속도는 INJ 후 서로 다른 시간에 검사 할 수ection (즉, 2 시간, 4 시간 이전 14 설명 된 바와 같이 24 시간). </li><li> 오염의 가능성을 줄이기 위해 귀 접종하고 70 % 에탄올로 대응 목 부위를 소독. </li><li> 멸균 가위와 집게를 사용하여 무균 주변의 지방을 수집하지 않고 근위 귀의 DLN을 해부하다. jugulo-carotidian 고랑의 첫 번째 절개를 수행하고 운영 필드에서 머리카락을 제거합니다. 주변 조직에 비해 잿빛 나타나는 DLN을 노출이 집게로 절개 스트레치. </li><li> 그것의 제거를 용이하게하기 위해 집게와 DLN의 상단에 조심스럽게 결합 조직을 꼬집어. 림프 조직 (그림 3a 및 3b) 밑에 집게를 배치하여 DLN의 압축을 풉니 다. 잘 포함하는 4.5 ml의 SM + 70 μm의 셀 스트레이너 (플레이트 A)에 DLN를 놓습니다. </li><li> 멸균 날카로운 가위와 집게 (그림 4A)를 사용하여 전체 접종 귀를 수확. Separ곤란과 두 개의 집게 (- 4E 그림 4B)로 끝나는 컷 떨어져 간격으로 귀 지느러미와 복부 측면을 먹었다. 두 조직이 완전히 매체에 몰입 확인하고 잘 포함하는 4.5 ml의 SM (플레이트 B)로 배치합니다. 참고 실험의 신뢰도를 향상시키고 관심 셀의 수를 증가시키기 위하여, 풀 2 샘플 당 동일한 마우스 귀에서 2 dLNs 주입. </li><li> 귀 및 1X DPBS 또는 침샘 추출물 중 하나를 접종 마우스의 dLNs 병렬 수확 및 처리. 음의 단일 얼룩 보상 컨트롤 순진 마우스에서 수확이 추가 귀 림프절 샘플을 포함합니다. </li></ol> 림프절 5. 세포 분리 <ol><li> 부드러운 교반하면서 15 분 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 림프절 (플레이트 A)를 품어. 콜라게나 제와 DNase의 ACTI을 중화 잘 당 10 mM의 최종 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 추가vities. 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용 림프절 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다. </li><li> 500 ㎕의 1X DPBS + 2 % 소 태아 혈청 (FBS) + 2mM의 EDTA 회 셀 스트레이너 헹군다. 15 ML 튜브에 잘의 전체 볼륨을 전송합니다. </li><li> + 2 % FBS + 2mM의 EDTA 500 μl의 1X DPBS로 잘 두 번을 씻어 15 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. </li></ol> 귀의 피부 6. 세포 분리 <ol><li> 부드러운 교반하면서 1 시간 동안 37 ° C + 5 % CO 2의 귀 전단지 (플레이트 B)를 품어. 참고 : 배양 20 분 후, 조직 소화를 촉진하고 나머지 40 분 동안 인큐베이터에 다시 샘플을 넣어 작은 조각으로 가위로 귀 전단지를 잘라. 단일 세포 배양 시간의 끝에서 배지에서 관찰 될 수있다. </li><li> 10 mM의 최종 추가<html> 물론 당 EDTA는 콜라게나 제와 DNase의 활동을 무력화합니다. 얼음에 다음 단계를 수행합니다. </li><li> 새가 아니라 1 ㎖ 피펫을 사용하여 70 μm의 셀 스트레이너를 포함에 귀 조직 파편과 매체의 전체 볼륨을 전송합니다. 쉽게 귀 조직 단편을 수집 팁의 단부로부터 2 ~ 3 mm를 잘라. </li><li> 5 mL의 주사기 플런저의 선단을 사용하여 귀 조직 단편 해리. 남아있는 모든 때까지 스트레이너에 대한 원형 운동을 누르고 흰색 결합 조직이다. </li><li> 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 두 번 셀 스트레이너를 씻어. </li><li> 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 50 ㎖ 튜브에 잘 전체 볼륨을 전송합니다. </li><li> 잘 500 μL 1X DPBS + 2 % FBS와 + 2 mM의 EDTA를 씻어 50 ML 튜브에 볼륨을 전송합니다. 얼음에 튜브를 유지합니다. 참고 : 다른 단계는 피부에서 총 세포를 분리하고 DLN 조직은 그림 5에 요약되어있다. </li></ol>제목 &quot;&gt; 7. 백작과 생존 수집 세포의 <ol><li> 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 피부와 DLN 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 사용하여 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구를 사용하여 피부 DLN으로부터 분리 된 세포의 총 수를 계산하기 위해 각각의 샘플의 작은 양을 수집한다. 0.04 %에게 세포 생존을 결정하는 트리 판 블루를 추가합니다. </li></ol> 8. 비 차단 항원 특이 적 결합 <ol><li> 라벨이없는 CD16 / CD32 된 Fc 블록 항체의 10 ㎍ / ML을 추가합니다. (더 이상 갈 수있다) 4 ° C에서 20 분을 품어. </li><li> 차가운 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 2 ㎖를 추가합니다. 4 ° C에서 450 XG에서 5 분 동안 샘플을 원심 분리기 및 상층 액을 버린다. 부드럽게 + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA 300 μl의 1X DPBS로 펠렛을 재현 탁하고 얼음에 샘플을 유지한다. </li></ol> 9. 염색 피부와 림프절 골수성 세포 <ol><li> 이전에 차단 스키를 품어n 및 DLN 라이브 / 죽은 추적기 (즉, 4 &#39;, 6-diamidino-2-페닐 인돌 또는 DAPI), 항 CD45 및 안티 CD11b를 특정 항체와 세포입니다. 주 : 관심의 골수 세포 개체군 특히 진귀한 농축하기 위해, CD45 + 세포 및 림프구는 각각 피부로부터 정제 될 수 있거나 또는 자기 비드 촉진 셀 소팅에 의해 DLN 120408. DLN 분리 대부분의 셀 이후 + CD45, 항 CD45의 사용이 필수적이다 아니다. 다른 마커는 양 또는 음의 게이팅 전략으로 관심 골수 세포 개체군을 식별하기 위해 포함될 수있다. 이 프로토콜에서, DLN에 모집 골수 세포 CD8α + 세포를 제외하여 농축 하였다 (전체 T 세포 구획 항 CD3 특이 적 항체를 사용하여 타겟팅 될 수있다). </li><li> 어둠 속에서 4 ° C에서 30 분을 품어. 4 ° C에서 450 XG에 500 μl의 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA, 원심 분리기 샘플 5 분을 추가하고 공중으로 폐기rnatant. 두 번 세척 단계를 반복합니다. </li><li> 300 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 함께 샘플을 재현 탁. 35 μm의 세포 여과기를 통하여 FACS 튜브 내의 전체 볼륨을 전송. 100 μL 1X DPBS + 2 % FBS + 2 mM의 EDTA를 가진 필터를 씻어. </li><li> 유동 세포 계수기에서 염색 된 세포를 실행합니다. 게이트가 하나의 세포에게 살 (DAPI - FSC-W) 죽은 세포와 이중선을 제외 할. DLN (그림 6B)에 대한 CD11b를가 + 이벤트 - 피부 (도 6a)와 (CD45의 +) CD8α에 대한 플롯 CD45 + CD11b를가 + 이벤트. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

전체 포자 소체 말라리아 백신을 사용한 인간의 대규모 예방의 관점에서 극복하는 주요 문제점 중 하나는 성공적인 면역 보호 (24, 25)을 위해 최적화 된 경로와 기생충 투여 방법을 개발하는 것이다. 인간에서, 약독 기생충 (LAP)에 의해 매개되는 예방 효과의 평가는 다음 천연 모기 수행 된 2뿐만 아니라, 피내, 피하 25, 26 및 27 IV 면역 물린. 설치류 (28) 및 비 - 인간 영장류 (25)에보고 된 바와 같이, LAP의 IV 투여는 전술 한 노선에 비해 더 강력한 보호 성 면역 반응을 유도한다. 그럼에도 불구하고, 바늘 및 주사기를 사용하여 투여 이외 IV 경로는 여전히 인간 질량 접종 적합 남아 노력은 현재 자신의 보호 효능을 최적화하도록 이루어지고있다. 마우스에서 실시 최근 연구에서 입증특히, ID 경로의 경우에는 D, 즉 큰 부피로 희석...

말라리아는 매년 50 만 명이 사망 세계에서 가장 치명적인 전염병 중 하나입니다. 변형체, 질병의 원인 에이전트에 의한 감염은 미리 적혈구 (PE) 단계에 의해 시작된다. 이 단계에서, 여성 Anopheline 모기에 의해 숙주의 피부에 주입 포자 소체는 혈류를 통한 간 도달 질병의 증상을 적혈구를 감염 원인 기생충 형태로 내부 간세포 분화. 변형체의 PE 단계는 항 말라리아 예방 접종에 대한 권한이 대상을 나타냅니다. 실제로, 방사선 감쇠 포자 소체 (RAS) 이러한 단계에 대한 약독 화 백신, 살, 유전자 체포 기생충 (GAP) 또는 화학적 예방 및 포자 소체 (CPS)는 설치류와 인간의 호스트 1-9을 보호하기 위해 자신의 능력을 증명하고있다. 설치류 모델에서 대부분의 백신 연구는 정맥 내 면역화를 이용하는 실시하고보호 효과의 측면에서 황금 표준이되는 것입니다. 그러나, 피부 단계의 설명 및 보호를 유도에서 피부 - 관련 배수 림프절 (DLN)의 중요성은 PE상의 우리의 인식 변화와 주사 피내 경로의 중요성을 강조 하였다. P.의 생체 내에 영상 쥐의 피부에 주입 berghei의 포자 소체는 접종의 ~ 25 %가 혈류를 통해 간 도달 한 것을 도시하고있다. ~ 나머지 75 %는 작은 비율이 피부 세포 (12, 13)의 내부 주 동안 살아 변환하고 남아있을 수 근위 DLN (~ 15 %)과 피부 (~ 50 %) 10, 11, 사이에 분배한다. 또한, 후속 연구는 피내 접종 후 효과적인 보호 면역의 설립은 주로 기생충 특정 CD8 + T 세포가 활성화되어 피부 DLN에서 발생, 만 소폭 비장이나 간 dLNs 14, 15에 있음을 설명했다. 동안대부분의 연구는 보호 면역 반응의 확립에 연루 이펙터 세포의 특성에 집중 한 덜은 선천성 면역계와의 상호 작용, 특히 피부에 주입 약독 기생충의 운명에 대해 공지되어있다. 특히, CD8 + T 세포 기생충 항원 흡수, 처리 및 표시에 관련된 항원 제시 세포의 특성화 PE 항원 취득 피부 DLN 구획 모두에서 발생할 수 있다는 것을 아는 것은 매우 중요하다. 이전 생체 내에 이미징 연구는 포자 소체와 수지상 세포 사이의 초기 상호 작용이 DLN 10,17에서 관찰하는 동안 감염 모기에 물린 16 다음 피부에 밝은 형광리스-GFP 양성 세포의 초기 유입을 설명했다. 더 최근에는 모기에 의해 피부에 접종하여 포자 소체가 피부에 모두 돌기 규제 T 세포의 운동성을 증가시키는 것으로보고되어있다마우스, 항원 제시 세포의 감소 된 수는 18 DLN 관찰하면서. 우리는 더 정확하게 식별하고, 백혈구의 서브 세트에 피부에 모집 RAS (19)의 투여가 면역 피내 주사 다음 기생충과 상호 작용하는 것과 같이 잘 DLN 대응 정량화 목적. 이러한 맥락에서, 우리는 모두 조직에서 골수 세포 (CD45 + CD11b를 +)를 분리하고 세포 계측법 = 다중 매개 변수 흐름에 의해 관심의 개체군을 특징으로한다. 슈만 편모충 주요 피부 감염 (20)의 초기 단계에 설명 된 면역 반응과 일치, 분사를 포자 소체하는 기본 호스트 응답은 염증성 단핵 세포 (CD45 + CD11b를 다음 다형 핵 호중구 (CD45 + CD11b를 + Ly6G + Ly6C의 INT)의 연속 모집으로 구성 + Ly6G - differenti에 기초하여 식별 Ly6C +)Ly6G 및 Ly6C 표면 마커의 알 식입니다. 우리는 마우스 피부에서 골수 세포를 분리하고 DLN 감염된 모기의 침샘에서 추출 RAS의 용량을 면역의 피내 주사를 다음 여기 프로토콜을 설명합니다. 재현 피내 주사 및 조직 처리는 감염된 조직 내에서 세포 인구 침투의 표현형 변화를 정량화하는 중요한 단계이다. 아래에 설명 된 접근 방식은 신뢰성있는 분석은 말라리아 기생충의 피부 DLN 염증 반응을 평가하기 위해 각종 실험 시스템으로 확장 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>케타민: Imalgene&reg; 1,000</td><td></td> <td>Merial-50</td> <td>mg/kg: 사전 포자광 주사

125 mg/kg: 이전 희생</td></tr><tr><td>자일라진: Rompun&reg; 2%</td><td>Bayer-5</td><td></td> <td>mg/kg: 이전 스포로조이트 주입

12.5 mg/kg: 사전 희생</td></tr><tr><td>NanoFil 주사기 + 35 게이지 바늘</td><td>세계 정밀 기기&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Omnican&reg; 50 인슐린 주사기 0.5 ml/50 I.U.</td><td>B. 브라운 메디컬&nbsp;</td><td></td><td>9151125-MultiwellTM</td></tr> <tr><td>6웰 조직 배양 플레이트 &ndash; 플랫 바텀</td><td>BD 팔콘&nbsp;</td><td></td><td>353046-70</td></tr> <tr><td>&마이크로; M 세포 스트레이너&nbsp;</td><td>BD 팔콘&nbsp;</td><td>352350-2</td><td></td></tr> <tr><td>ml 주사기</td><td>Terumo</td><td>SS-02S-BLUE</td><td></td></tr> <tr><td>MAXTM 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352097-BLUE</td></tr> <tr><td>MAXTM 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브</td><td>BD Falcon&nbsp;</td><td></td><td>352098-5</td></tr> <tr><td>ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브 35 &micro; m 셀 스트레이너 캡</td><td>BD 팔콘&nbsp;</td><td></td><td></td>352235-DPBS</tr> <tr><td>1x CaCl2- 및 MgCl2--free</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>1x + GlutaMAXTM</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021-Clostridium</td><td></td></tr> <tr><td>histolyticum의 콜라겐분해효소, Type IV 0.5-5.0 FALGPA 단위/mg 고체&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>C5138</td><td>400 U/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 Deoxyribonuclease I, type IV&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>D5025</td><td>50 &마이크로; g/ml</td></tr><tr><td>EDTA 디소듐 염</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>E-5134</td><td>10 mM 또는 2.5 mM</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biowest</td><td>S1810-500-HEPES</td><td></td></tr> <tr><td>버퍼 용액 (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Trypan 블루 스테인 (0,4%)</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>희석 1:10&nbsp;</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD16 / CD32 (2.4G2 클론)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>10 &micro; g/ml 최종 (1:50)</td></tr><tr><td>DAPI FluoroPureTM 등급</td><td>Life Technologies</td><td>D21490</td><td>1 &micro; g/ml 최종</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD45 (30-F11 클론)</td><td>BD Biosciences</td><td>559864</td><td>&nbsp; 희석 1:200</td></tr><tr><td>안티-마우스 CD11b (M1/70 클론)</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td>&nbsp; 희석 1:400</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD8&알파; (5H10 클론)</td><td>생명 기술</td><td>MCD0830</td><td>&nbsp; 희석 1:100</td></tr><tr><td>암컷 C57BL/6JRj 마우스 (7주령)&nbsp;</td><td>Janvier Laboratories</td> <td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리<em&gt; 변형체</em&gt; 포자 소체

Myeloid Cell Isolation from Mouse Skin and Draining Lymph Node Following Intradermal Immunization with Live Attenuated Plasmodium Sporozoites

변형체의 포자 소체 단계는 모기에 물린 통해 포유 동물 숙주의 피부에 접종 할 때 말라리아 감염이 시작됩니다. 고도의 운동성이 기생충뿐만 아니라 간세포에 침입 및 적혈구-감염 형태로 변환 할 수있는 간 도달한다. 또한 피부에 그것을 인식하고 상주 및 / 또는 보충 골수 세포에 의해 분해 될 수있는 주사 부위를 배출 근위 림프절로 이동한다. 생체 내에 영상은 밝은 형광리스-GFP 긍정적 인 피부 백혈구 및 배수 림프절의 포자 소체와의 CD11c + 세포 사이의 상호 작용의 초기 모집을보고했다. 우리는 여기서, 복구 식별하고 마우스 피부에 모집 및 쥐 모델에서 포자 소체의 용량을 면역의 피내 주사 다음과 림프절을 배출하는 골수 세포 하위 집합을 열거 할 수있는 효율적인 방법을 제시한다. 표현형 특성을 사용하여 다중 매개 변수 흐름 세포 계측법 제공신뢰할 수있는 분석은 말라리아 감염에 염증 반응시 초기 동적 세포 변화를 평가한다.

우리는 최근 P.의 면역 용량의 바늘 주사기 주입을 입증 마우스 피부는 피부와 DLN (19)의 염증성 단핵구 다음 다형 핵 호중구의 연속 채용을 유도에 berghei은 포자 소체. 프로토콜 절 위에 성공적으로 이어 진피 포자 소체의 다수의 다중 분사 다음 두 조직으로부터 살아있는 골수 세포를 분리하기 위해 사용 된 절차에 상세 설명 (도 1 및도 2). 계측법 멀티 파라 흐름에 의해 세포의 침윤을 분석하여도 5에 요약 된 바와 같이 처음 24 시간 이내에, DLN (도 3)와 피부 주사 부위 (도 4) 및 절연 처리 하였다. 전반적으로,이 기술은 평균 104 CD45 + CD11b를 +와 2.10 4...

여기에서는 Plasmodium sporozoites의 피내 주사 후 마우스 피부에서 골수성 세포를 분리하고 림프절을 배출하는 프로토콜을 설명합니다. 수집된 세포의 유세포 분석은 기생충에 대한 피부 및 배액 림프절 염증 반응을 특성화하기 위한 신뢰할 수 있는 분석을 제공합니다.

Malaria infection begins when the sporozoite stage of Plasmodium is inoculated into the skin of a mammalian host through a mosquito bite. The highly ...

이 일련의 절차의 전반적인 목적은 방사선으로 약독화된 플라스모디움(plasmodium) 기생충으로 마우스를 면역화하는 것입니다. 이를 통해 마우스 피부와 배수 림프절에서의 골수성 세포 모집 분석을 용이하게 합니다. 이 방법은 살아있는 약독화 기생충에 대한 선천성 면역 반응에 관여하는 세포 작용제가 무엇인지와 같은 말라리아 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.감염 혈액 섭취 후 18-25일 사이에 감염된 모기를 수집하여 얼음 위에 놓인 15 milliliter 튜브에서 저온 마취합니다. 그다음, 튜브를 조심스럽게 뒤집어 얼음 위에 놓인 페트리 접시에 모기를 옮기고 12 kilorad 용량의 감마선 또는 X선을 조사합니다. 조사된 모기의 타액선을 15 microliters의 DPBS에 수집하여 얼음 위에 보관합니다.그런 다음, 선을 부드럽게 으깨어 스포로조이트(sporozoites)를 방출시킵니다. 소량의 부피에 고농도의 기생충 현탁액을 주입하는 것이 매우 중요하므로, 강한 녹색 형광 발현으로 확인된 감염이 잘 된 모기에서 충분한 수의 침샘을 채취하는 것이 중요합니다. 1.5 milliliter 마이크로원심분리 튜브에 장착된 35 micrometer 스트레이너로 여과하기 전에 기생충 현탁액을 다시 부유시킵니다.현미경 계수기를 사용하여 분리된 sporozoite의 총 수를 세고, ice 위에서 차가운 DPBS를 이용해 parasite 현탁액의 농도를 8.3 × 10⁴ sporozoites/µL로 조정합니다. sporozoite를 주입하기 전에 발가락 집기(toe pinch)를 통해 실험 동물의 진정 수준이 적절한지 확인하고, 각막 건조를 방지하기 위해 안연고를 도포합니다. 그 후, 신속하게 실체 현미경 하에서 투명 테이프를 사용하여 귓바퀴의 복측을 조심스럽게 고정하고, 35 gauge 바늘이 장착된 10 µL 시린지에 재현탁된 parasite 0.6 µL를 충전합니다.다음으로, 바늘의 사면(bevel)이 위를 향하게 하여 귀의 등쪽 표피 아래로 조심스럽게 삽입한 후, 해당 부위에 0.15 microliters의 포자소체(sporozoites)를 주입합니다. 주입 부위에 특징적인 구진(papule)이 관찰될 것입니다. 방금 시연한 것과 같이 진피에 세 번 더 주입한 후, 테이프를 조심스럽게 제거하고 마우스가 완전히 회복될 때까지 관찰하십시오.스포로조이트 접종 후 원하는 시점이 되면 마우스를 희생시키고 즉시 절차를 시작하십시오. 마우스가 임상적 사망 징후를 보이는지 확인하십시오. 귀와 해당 목 부위를 70% 에탄올로 소독하십시오.다음으로, 멸균 가위와 포셉을 사용하여 경경동맥 부위에 절개창을 냅니다. 그런 다음 두 개의 포셉으로 절개 부위를 벌려 회색으로 보이는 배출 림프절을 노출시킵니다. 림프절 바로 위의 결합 조직을 조심스럽게 집어 제거하고, 아래쪽에 배치한 두 번째 포셉으로 림프절을 추출합니다.콜라게나아제(collagenase)와 DNase가 첨가된 4.5 milliliters의 표준 배지가 들어있는 6-웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 있는 70 micron 스트레이너로 림프절을 옮깁니다. 다음으로, 접종된 귀 전체를 수확하고 포셉 두 개를 사용하여 귀를 등쪽(dorsal)과 배쪽(ventral) 측면으로 집어 분리합니다. 그런 다음, 각 조직이 배지에 완전히 잠기도록 주의하면서, 소화 효소가 첨가된 배지가 웰당 4.5 milliliters씩 들어있는 두 번째 6-웰 플레이트의 각 웰에 귀의 각 측면을 넣습니다.림프절에서 면역 세포를 분리하려면, 림프 조직이 담긴 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건에서 완만하게 교반하며 배양하십시오. 15분 후, 각 웰에 10 mM EDTA를 첨가하고 플레이트를 얼음에 놓으십시오. 다음으로, 각 림프절에 대해 새로운 5 mm 주사기 플런저 끝부분을 사용하여 림프절을 스트레이너에 대고 원을 그리며 눌러 조직을 해리시키십시오.흰색 결합 조직만 남았을 때, FBS와 EDTA가 포함된 DPBS 500 µL로 거름망을 2회 헹구고 세척액을 15 mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 그 다음, 보충된 DPBS 500 µL로 웰을 2회 더 세척하고 세척액을 얼음 위에 놓인 튜브로 옮깁니다. 귀에서 면역 세포를 분리하기 위해, 귀 엽(ear leaflets)을 37 °C 및 5% CO2 조건에서 완만하게 흔들어주며 배양합니다.20분 후, 조직의 소화를 돕기 위해 조직을 더 작은 조각으로 자르고 샘플을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 40분 후, 10 mM EDTA를 사용하여 소화를 중단시키고 플레이트를 얼음 위에 둡니다. 팁 끝을 자른 1 mL 피펫을 사용하여 각 웰의 전체 내용물을 70 µm 스트레이너가 포함된 새 웰로 옮깁니다.방금 시연한 것과 같이 5 mL 시린지 플런저를 사용하여 원형 동작으로 귀 조직 파편들을 분리합니다. 흰색 결합 조직과 털만 남았을 때, 방금 시연한 대로 DPBS에 FBS와 EDTA를 추가하여 스트레이너와 웰을 세척하고, 세척액을 얼음 위에 놓인 50 mL 튜브에 모읍니다. 마지막으로, 보충된 DPBS로 웰을 두 번 세척하고 세척액을 얼음 위에 놓인 튜브로 옮깁니다.본 영상에서는 기생충을 피부 내 주사한 지 15분 후, 방사선 감쇠된 포자소포자가 마우스 피부로 이동하는 모습을 확인할 수 있습니다. 피부 내 포자소포자 주사 24시간 후, 피부와 배출 림프절에서 총 세포를 분리합니다. 이 그림에서 관찰되는 바와 같이, 피부와 배출 림프절 내 골수성 세포의 빈도는 naive 마우스와 비교하여 강력하게 증가합니다.숙련되면, 모기 조사부터 스포로조이트 주입까지의 프로토콜의 첫 단계들을 4시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때, 모기 침샘에서 분리된 스포로조이트는 감염력을 빠르게 상실한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서 가능한 한 빨리 주입해야 합니다.이 영상을 시청한 후에는, 살아있는 약독화 플라스모디움 기생충의 피내 주사에 대한 면역 반응을 탐구하기 위해 생쥐의 피부와 배출 림프절에서 골수성 세포를 분리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

myeloid-cell-isolation-from-mouse-skin-draining-lymph-node-following

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

특정 마우스 변종은 myelin 기본 단백질과 함께 실험적인 면역 encephalomyelitis (EAE)의 유도에 저항 할 수 있습니다. 여기에서 설명한 것은 응답하지 않는 문제를 역으로 여러 전형 EAE 모성 마우스 얼룩에 중풍 질환을 유도하는 간단한 예방 접종 프로토콜입니다.

입양 이전 및 Antigenic 챌린지에 의해 실험적 면역 Encephalomyelitis (EAE) 모성 마우스 변종에 응답하지 않는 문제를 극복

이 비디오는 마우스에서 Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG에 발판 감염 후 수지상 세포 이동을 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. 세균 감염 시 활성화된 피부 DC 세포는 세포 투과성 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 염료로 표지됩니다. 슬와골 배출 림프절로의 DC 이동을 위한 적절한 간격 후, 노드 세포를 분리하고 DC 특이적 표면 마커에 대한 면역 염색을 실시합니다. 마이그레이션된 DC의 식별은 유세포 분석을 사용하여 수행됩니다.

감염된 마우스에서 배출 림프절로의 피부 수지상 세포 이동을 모니터링하기 위한 CFSE 기반 분석

이 비디오는 생쥐 모델에 살아있는 약독화 포자형성물을 면역시키기 위한 분석을 보여줍니다. 방사선 감쇠된 Plasmodium sporozoites는 쥐 귀의 등쪽에 주입됩니다. 양쪽 귀의 여러 위치에 주사를 맞은 후 마우스가 회복할 수 있습니다.

마우스 모델에서 약독화 포자조산을 이용한 피내 면역

예방 및 치료 백신은 종종 노드와 면역 세포의 결과로 가난한 참여 림프로 인해 백신의 주 배수에 강한 면역 반응을 자극하는 데 실패합니다. 림프절 백신의 직접 주사에 의해, 소위 intralymphatic 주입은 백신 효능 강하게 개선 될 수 있으며, 백신의 투여 량을 저감 할 수있다.

마우스의 Intralymphatic 면역 및 예방 접종

피부는 복잡한 면역 세포 네트워크의 본거지입니다. 우리는 단일 세포 현탁액을 얻고 유세포 분석을 통해 피부에 거주하는 다양한 백혈구 집단을 분석하기 위해 동물의 신체의 여러 부분에서 마우스 피부를 소화하기 위한 효율적인 방법론을 설명합니다.

다른 마우스 피부 지역에서 Cytofluorimetric 분석을위한 단일 세포 현탁액의 준비

염증 부위에서 이펙터 CD4 T 세포의 삽입 운동을 제어하는​​ 메카니즘은 상대적으로 알려져 있지 않다. 우리는 시각화 현장에서 이러한 세포의 동적 거동의 연구를 허용 염증 귀 진피의 시험 관내 -primed CD4 T 세포에서 조작하는 비 침습적 방법을 제시한다.

염증이 진피의 이미징 CD4 T 세포 간질 마이그레이션

이 프로토콜은 영양이 풍부한 배지에서 마우스 피부의 효소 분해 후 백혈구를 분리하기 위한 구배 분리를 설명합니다.  이렇게 파생된 세포는 다양한 다운스트림 응용 분야에 사용할 수 있습니다. 이것은 조직 해리 기계와 더 가혹한 트립신 및 디스파제 기반 조직 소화 프로토콜에 대한 효과적이고 경제적이며 개선된 대안입니다.

효소 다이제스트 및 그라데이션 분리를 사용하여 마우스 피부에서 침투 백혈구의 분리

뚜렷한 수지상 세포 부분 집합은 림프 기관에서 드문 집단으로 존재하므로 면역학 실험을 위한 충분한 수와 순도로 분리하기가 어렵습니다. 여기에서는 현재 알려진 마우스 비장 수지상 세포의 모든 주요 부분 집합을 분리하기 위한 고효율, 고수율 방법에 대해 설명합니다.

마우스 수지상 세포 하위 집합의 분리를위한 효율적이고 높은 수율 방법

피부에서 배출 림프절로의 세포 이동을 추적하기 위한 마우스의 분석법이 설명되어 Bacille Calmette-Guérin에 발바닥 패드 감염 후 림프절로 동원된 피부 수지상 세포의 특성을 분석할 수 있습니다.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

여기서 우리는 감염의 혈액 단계에서 Plasmodium 에 대한 세포 면역의 메커니즘을 밝히는 데 도움이되는 새로운 방법을 설명합니다. 이것은 세포 독성 림프구에 의한 감염된 적혈구 사멸을 측정하는 시험관 내 분석입니다.

체외 세포독성 림프구에 의한 변형체 감염 적혈구 사멸 분석

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

배우세요 마우스 피부와 배수 림프절에서 골수 세포를 분리하는 방법으로, 방사선 약독화된 Plasmodium 변형체 포자 소체를 피내 접종한 후 면역 반응을 분석합니다. 이 기술은 말라리아 면역학 연구와 백신 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

약독 화와 피내 접종에 따라 마우스의 피부와 배수 림프절에서 골수 세포 분리

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