개발에 미세 주입을 대상으로 기술 Xenopus의 신장

이 절차의 전반적인 목표는 발달 중인 제노푸스 신장에 미세 주입을 표적으로 삼는 것입니다. 이 방법은 신장이 어떻게 형성되는지, 이 과정에 어떤 유전자가 중요한지와 같은 발달 생물학 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미세 주입된 시약이 표적 조직에 전달되는 것을 최대화한다는 것입니다.

표적 미세주입을 위한 올바른 배반구를 식별하는 것이 중요하기 때문에 이 방법의 시각화가 중요합니다. 이 절차를 시작하기 위해 두 고환을 한 마리의 수컷 개구리에서 분리하여 10밀리리터의 고환 저장 용액으로 채워진 60mm 페트리 접시에 넣었습니다. 그런 다음 고환을 섭씨 4도에서 보관하십시오.

다음으로, 100mm 페트리 접시에 담긴 암컷 개구리의 알을 채취했습니다. 페트리 접시에서 여분의 물을 붓습니다. 그 후 고환 저장 용액에서 고환의 1/4을 잘라냅니다.

고환 조각을 계란이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 그런 다음 고환 부분을 작은 조각으로 자릅니다. 페트리 접시에 MMR과 겐타마이신을 넣어 달걀을 덮습니다.

접시를 휘젓고 섞은 다음 실온에서 수정이 이루어질 때까지 약 30분 정도 기다립니다. 수정 후에는 배아의 색소가 있는 면이 위를 향해야 합니다. 전사 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 MMR을 제거하고 배아를 덮을 수 있을 만큼 충분한 젤리 제거 용액을 추가합니다.

그 후, 배아의 젤리 코트를 녹이기 위해 몇 분 동안 접시를 휘젓습니다. 배아가 접시 중앙에서 서로 밀접하게 접촉하면 젤리 코트가 제거됩니다. 전사 피펫으로 젤리 제거 용액을 제거합니다.

다음으로, 젤리가 제거된 배아를 MMR과 겐타마이신으로 조심스럽게 붓고 접시에 새 MMR을 채워 3-5회 세척합니다. 배아를 손상시킬 수 있는 접시에서 MMR을 모두 제거하지 마십시오. 그런 다음 페트리 접시에서 수정되지 않은 난자나 고환 조각을 제거하십시오.

발달을 비틀거리게 하기 위해, 한 번의 수정으로 얻은 배아의 절반은 섭씨 14도의 페트리 접시에 넣고, 나머지 절반은 섭씨 18도의 페트리 접시에 넣는다. 배아는 섭씨 18도보다 섭씨 14도에서 더 천천히 발달합니다. 단일 수정 클러치에서 여러 세트의 주입이 가능합니다.

나노리터당 1나노그램의 점 0, 막 결합 적색 형광 단백질 mRNA를 포함하는 주입 용액을 준비합니다. 배아가 4세포 또는 8세포 단계로 발달하는 동안. 사용할 때까지 주입 용액을 얼음에 보관하십시오.

그런 다음 교체용 유리 모세관 튜브를 교체 튜브의 상단이 니들 풀러 케이스의 상단과 정렬된 상태로 니들 풀러에 로드합니다. 열 번호 2 값을 800으로, 당기기 값을 650으로 설정하고 당기기 버튼을 눌러 바늘을 당깁니다. 그런 다음 Dumont 집게로 당겨진 바늘 끝을 잘라냅니다.

마이크로피펫 콜릿을 바늘 뒤쪽에 밀어 넣습니다. 그런 다음 큰 구멍 O-링을 콜릿 뒤의 바늘 뒷면에 밀어 넣습니다. 이제 27게이지 피리 바늘을 사용하여 바늘에 미네랄 오일을 채우고 바늘에 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.

바늘을 마이크로 인젝터의 플런저에 밀어 넣고 플런저에 설치된 흰색 플라스틱 스페이서의 큰 구멍에 바늘을 장착합니다. 콜릿을 조여 바늘을 고정합니다. 그런 다음 신호음이 두 번 울릴 때까지 마이크로인젝터 제어 상자의 Empty" 버튼을 길게 누릅니다.

그 후, 3마이크로리터의 주입 용액을 파라필름 조각에 피펫으로 넣습니다. 그런 다음 바늘 끝을 파라 필름의 주입 용액 비드에 삽입합니다. 마이크로인젝터 제어 상자의 Fill" 버튼을 길게 눌러 주입 용액을 바늘로 끌어당깁니다.

미세주입을 하기 전에 xenopus 배아의 초기 세포 분열을 이해하는 것이 중요합니다. 단세포 배아는 짙은 색의 동물 기둥과 흰색과 요키한 식물 기둥을 가지고 있습니다. 두 세포 배아에서 첫 번째 분열은 일반적으로 배아의 왼쪽과 오른쪽 사이에서 발생합니다.

이 세포는 pronephric 계통에 동등하게 기여합니다. 두 번째 분열은 배아의 등쪽과 복부 반쪽을 나누어 4세포 배아로 이어집니다. 등쪽 세포는 배쪽 세포보다 작고 색소가 적습니다.

4세포 배아에 주입하는 경우, 좌측 배반구를 대상으로 좌측 배반구를 주입합니다. 세 번째 분열은 동물과 식물 측면을 이분파합니다. 그 결과 8세포 배아가 생성됩니다.

이 시점에는 4개의 동물 할구와 4개의 식물성 할구가 있습니다. 8세포 배아의 왼쪽 신장을 표적으로 삼으려면 좌측 배쪽 식물성 배반구에 주입합니다. 그런 다음 500미크론 폴리에스터 메쉬가 늘어선 60mm 페트리 접시에 MMR과 겐타마이신의 5%의 fycol을 채웁니다.

20-30개의 8세포 배아를 조심스럽게 피펫으로 접시에 넣습니다. 모발 고리를 사용하여 주입할 배반구가 바늘을 향하도록 배아를 조작합니다. 왼쪽 신장을 표적으로 삼으려면 8세포 배아의 좌측 복부 식물 할구가 바늘을 향하도록 배아를 정렬합니다.

접시에 있는 각 배아의 선택한 배반구에 10나노리터의 주사 용액을 주입합니다. 그런 다음, 주입된 배아를 MMR의 5% fycol과 겐타마이신이 함유된 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 주입된 배아를 섭씨 16도에서 약 1-2시간 동안 배양하여 주입된 할구가 치유될 수 있도록 합니다.

그 후, 미세주입된 배아를 MMR과 겐타마이신으로 채워진 배양 플레이트의 새로운 웰로 옮깁니다. 배아가 38-40단계에 도달할 때까지 섭씨 14도에서 22도에서 배아를 배양합니다. 이 과정에서 10-20개의 배아를 38-40개의 배아를 유리 바이알에 이식합니다.

바이알에 100% 에탄올에 5% 벤조카인을 10마이크로리터 첨가합니다. 바이알을 뒤집어 혼합하고 배아를 마취할 때까지 10분 동안 기다립니다. 그런 다음 바이알에서 MMR을 제거하고 MEMFA로 채웁니다.

그런 다음 실온에서 1시간 동안 3차원 흔들리는 플랫폼에 놓습니다. 1시간 후 바이알에서 MEMFA를 제거하고 100% 메탄올로 채웁니다. 그런 다음 바이알을 3차원의 흔들리는 플랫폼에 올려 실온에서 10분 동안 놓습니다.

이 세척 단계를 한 번 더 반복하고 배아를 섭씨 영하 20도에서 하룻밤 동안 100% 메탄올에 보관합니다. 이제 배아가 고정되어 면역 염색을 할 준비가 되었습니다. 이 회로도는 멤브레인 결합 적색 형광 단백질 mRNA를 추적자로 사용하여 8세포 단계에서 xenopus 배아의 왼쪽 pronephros를 표적으로 하기 위해 주입해야 하는 blastomere를 보여줍니다.

좌측 복부 식물 포반구에 주입한 후 추적자 위치화는 빨간색으로 표시되고 신장은 녹색으로 표시됩니다. 이 이미지는 신장이 항체 3G8 및 4A6으로 녹색으로 염색되었음을 보여줍니다. 다음은 추적자 loacalization을 보여주는 신장 영역의 클로즈업 이미지이며, 다음은 추적자와 신장의 공동 국소화를 보여주는 병합된 이미지입니다.

여기에 보이는 것은 3G8 및 4A6로 염색된 두 번째 배아의 신장의 컨포칼 이미지입니다. 이것은 신장과 주변 조직에서 적색 추적자의 국소화이며, 이것은 신장에서 추적자 3G8 및 4A6의 공동 국소화를 보여주는 병합된 이미지입니다. 이 절차를 수행하기 전에 초기 이종 배아에 익숙해지는 것이 중요합니다.

이를 통해 확립된 xenopus fade map을 통해 미세주입을 적절하게 표적화할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 신경관이나 심장과 같은 다른 조직을 표적으로 삼도록 조정할 수 있습니다.