Name: 개발에 미세 주입을 대상으로 기술 Xenopus의 신장 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-03T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 배우세요 Xenopus laevis 배아의 특정 분열구에 미세주입을 수행하여 신장 발달을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 유전자 기능 분석과 장기형성 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 텍사스 맥거번 의과 대학 소아과에서 건강 NIDDK 부여 (K01DK092320) 및 시작 기금의 국립 연구소에 의해 지원되었다.

(: HSC-AWC-13-135 프로토콜 #) 다음 프로토콜은 기관 관리 및 사용위원회의 역할을 실험 동물 의학 동물 복지위원회, 휴스턴의 센터에서 텍사스 건강 과학 센터의 대학에 의해 승인되었습니다. 신장 타겟 주사에 대한 Blastomeres을 1. 식별 및 선택 <ol><li> 배아를 생성하기 전에, 배아의 초기 세포 분열의 배향을 이해 Xenopus의 개발 (21)의 정상 표를 사용한다. 또한, Xenbase 11 Xenopus의 초기 발달 단계의 액세스도. </li><li> 마이크로 인젝션 대상이 될 할구 선택 Xenbase (11)의 상호 작용 Xenopus의 세포 운명의지도에 액세스 할 수 있습니다. </li><li> 단세포 배아가 어둡게 착색 된 동물 극과 흰색과 노른자위의 인 식물 극을 가지고 있음을 관찰한다. 참고 난황 전자로 알려진 보호막,nvelope, 배아를 다루고 있습니다. </li><li> 제 절단은 전형적으로 배아의 왼쪽과 오른쪽 사이에서 발생하는 것을 알 수 있습니다. 이러한 세포는 pronephric 리니지 동등 기여한다. </li><li> 두 번째 분열은 4 셀 배아로 이어지는, 지느러미 및 배아의 복부 절반을 분할합니다. 지느러미 세포는 작고 복부 세포 (그림 2A 그림 3A)보다 안료가있다. <ol><li> 왼쪽과 오른쪽에, 지느러미보다 개발 신장에 더 기여 (D, 작은, 빛 세포) 할구 (그림 2A), 복부 할구 (큰, 어두운 세포 V)를 확인합니다. </li><li> 4 셀 배아에 주입하면, 왼쪽 신장 (그림 3A 및 제 3 항)을 대상으로 왼쪽 복부 할구를 주입. </li></ol></li><li> 세번째 절단는 8 세포 배아 발생, 동물 및 식물의 측면을 이등분. 이 시점에서, 네 동물 할구는 [가 왼쪽 복부 오른쪽(V1)과 지느러미 (D1)] 네 식물 할구 [왼쪽과 복부 오른쪽 (V2)와 지느러미 (D2) (도 2b 및도 3b). <ol><li> 복부, 식물 할구 (V2)를 찾습니다. 이 할구는 다른 셀이 단계 (그림 2B)에서 개발 신장에 더 많은 기여한다. 8 세포 배아의 왼쪽 신장을 목표로, 왼쪽 V2의 할구 (그림 3b 및 제 3 항)에 주입. </li></ol></li><li> 네 번째와 다섯 번째 분열은 동물과 식물 할구를 이등분 것을 알 수 있습니다. 두 자손 16 세포 배아 발생, 각 할구로부터 생성된다. 세포는 그들의 전임자의 이름을 따서 명명된다. 예를 들어, 8 세포 단계에서 V2의 할구는 16 세포 단계 (도 2c)에서 V2.1 및 V2.2 자손을 일으킨다. 16 세포 단계에서 V2.2 셀 현상 신장에 기여하는 세포의 대부분을 제공한다. </li><li> 여섯 번째와 일곱 번째 분열 32 셀 엠브리 결과 참고영형. 다시 말하지만,이 자손들은 이전 다음 명명 된 각각의 할구에서 생성됩니다. 예를 들어, 16 세포 단계에서 V2.2의 할구 32 세포 단계에서 V2.2.1 및 V2.2.2을 일으킨다. 가 셀 (식물로 동물)에서 A, B, C, 및 D와 같은 네 개의 행에서 식별되는 32 세포 단계에서 대체 네이밍 시스템은, 4 열 1, 2, 3, 4 (AS 지느러미)에서 복부에. 따라서, 개발 pronephros에 가장 기여하는 V2.2.2의 할구는,이 대안 네이밍 시스템 (그림 2D)에서 C3라고합니다. </li></ol> 배아 2. 준비 <ol><li> (8.0 pH로 2 % 시스테인, 수산화 나트륨) Dejelly 용액 50 ㎖를 준비합니다. </li><li> 표준 프로토콜 (14)에 따른 단일 남성 개구리에서 두 고환을 분리합니다. 0.1 M의 NaCl, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 황산, 2 mM의 10 ml의 고환 스토리지 솔루션 (1 배 마크의 수정 링거 [MMR 가득 60mm 페트리 접시에 고환을 배치CaCl2를 5 mM의 HEPES pH를 8, 0.1 mM의 EDTA] (12), 1 % 소 혈청 알부민, 50 μg의 / ㎖ 젠타 마이신). 4 ° C에서 고환을 저장합니다. 주 : 고환 약 7 일 동안 저장 될 수있다 - 39 ° C에서 10 일이지만 시비 효율 고환이 저장되어있는 이상 감소한다. </li><li> 표준 프로토콜 14에 따라 알을 얻기 위해 여성 개구리 짠다. 100mm의 페트리 접시에 계란을 수집합니다. 초과 물을 붓는다. </li><li> 이 집게와 면도날을 사용하여 고환 스토리지 솔루션에있는 동안 고환의 ¼을 잘라. 알을 함유하는 페트리 접시에 정소의 단편을 전송. 정소는 저장된 얼마나 고환의 크기를 고려하여 사용하는 정소 부분의 크기를 조정하고, 얼마나 많은 계란 시비하여야한다. 일반적으로 계란 한 클러치를 비옥하게하기 위해 갓 해부 고환의 1/3에 ¼ 사용합니다. </li><li> 집게와 면도날을 사용하여 작은 조각으로 고환 부분을 잘라. 충분히 0.3 배의 MMR 추가페트리 접시에 + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신은 계란을 포함합니다. 섞어 접시에 MMR 소용돌이 친다. </li><li> 수정은 실온에서 일어날 때까지 약 30 분을 기다립니다. 동물 반구 (배아의 색소 측) 효과적인 수정시 배아의 꼭대기에 앉아 않습니다. 이어서, 전사 피펫을 사용하여 배양 접시에서 MMR 제거. 배아를 충당하기 위해 요리에 충분한 Dejelly 솔루션을 추가합니다. </li><li> 다음 몇 분 동안 부드럽게 간헐적으로 접시를 소용돌이 친다. 이 때 접시의 격렬한 흔들림 축 결함의 원인이 될 수 있습니다. &#160; 배아의 젤리 코트 용해하고, 배아는 소용돌이 치는 동안 접시의 중앙에 모이는 것입니다. 배아가 밀접하게 접시의 중앙에 서로 닿지되면, 전송 피펫으로 Dejelly 솔루션을 제거합니다. 이상 5 분 동안 Dejelly 솔루션의 배아를 두지 마십시오, 또는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 0.3 배에서 5 배 - dejellied 배아 3을 씻으십시오조심스럽게 쏟아져 또는 MMR 오프 피펫과 새로운 MMR과 접시를 작성하여 MMR은 + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신. 접시에서 MMR을 모두 제거하지 마십시오, 또는 배아가 손상 될 수 있습니다. </li><li> 전송 피펫을 사용하여 페트리 접시에서 모든 미 수정 계란 또는 고환의 조각을 제거합니다. </li><li> 14, 22 °의 C 사이의 배아를 품어. 주 : 낮은 온도에서 성장 된 배아 높은 온도에서 성장 된 배아보다 느리게 개발한다. 발달 단계의 타이밍 Xenbase (22)에서 찾을 수 있습니다. <ol><li> 자신의 개발 밖으로 공간, 페트리 접시에 한 수정에서 배아의 장소 반은 14 ° C로 유지하고, 페트리 접시에 배아의 나머지 절반은 18 ° C로 유지. 이는 단일 시비 4 셀, 8 셀 배아 내로 주사 두 집합을 허용한다. </li></ol></li></ol> 사출 솔루션 및 태아의 미세 주입 3. 준비 <ol><li> 0.01를 함유하는 주사액을 제조NG / NL 막 결합 적색 형광 단백질 (RFP-MEM)의 mRNA 9 배아 4 셀, 8 셀 스테이지 개발하고있다. 주입 할 준비가 될 때까지 얼음에 주입 솔루션을 저장합니다. </li><li> &quot;. 바늘 풀러 케이스의 상단에 정렬 교체 튜브의 상단에, 바늘 풀러로 교체 유리 모세관 튜브 (800)에 열 # 2 값을 설정하고 (650)을 눌러 당김 값은&quot;7을로드 당겨 &quot;버튼을 눌러 바늘을 당겨. 이는 단일 7에서 2 바늘을 만들 것&quot;유리 모세관. </li><li> 뒤몽의 포셉 한 쌍으로 뽑아 바늘의 끝을 싹둑. 참고 : 바늘을 당기는 후, 팁 차단을 밀봉 오픈 절단해야합니다. 바늘 끝이 될 직경이 작을 것이 절단 바늘의 지점에 가까워. 팁의 직경은 여기에 사용 된 마이크로 인젝션 시스템과 주입 부피에 영향을주지되지만, 더 큰 직경을 갖는 팁이 배아가 손상 할 가능성이있다. </li><li> m 개의 슬립바늘의이면 상 icropipette 콜레트. 다음에, 콜레트 뒤에 바늘의 후방에 큰 구멍 O 링 슬립. </li><li> 미네랄 오일이 바늘에 공기 방울을 얻을 않도록주의하면서, 27 게이지 피하 주사 바늘을 이용하여 바늘을 입력합니다. </li><li> 플런저에 설치되어있는 흰색 플라스틱 스페이서의 큰 구멍에 바늘을 좌석의 마이크로 인젝터의 플런저에 바늘을 슬립. 플런저 흰색 스페이서 큰 구멍 O 링과 콜릿 뒤에 마이크로 인젝터의 몸에 가까운 작은 O 링을 가져야한다. 콜레트를 조여 바늘을 고정합니다. 제대로 고정되어 있는지 확인하기 위해 바늘에 부드럽게 잡아 당깁니다. </li><li> 이 비프 음이 될 때까지 눌러은 마이크로 인젝터 제어 상자의 &quot;빈&quot;버튼을 누르고 있습니다. </li><li> 파라 필름의 조각 위에 주입 솔루션의 피펫 3 μL. 파라 필름에 주사 용액의 구슬로 바늘의 끝을 삽입합니다. 언론과는이 microi 버튼을 &quot;작성&quot;개최njector 컨트롤 박스는 바늘로 주사 솔루션을 그립니다. </li><li> 0.3 배의 MMR + 30 mg을 / ㎖ 겐타 마이신 5 % 피콜 메쉬 500 미크론 폴리 에스테르 늘어서 60mm 페트리 접시를 입력합니다. 접시에 30 4 셀 또는 8 셀 배아 - 조심스럽게 20 피펫. </li><li> 모발 루프 (14)를 사용하여, 바늘 할구를 향 분사 될 수 있도록 조작 배아. , 왼쪽 신장을 대상으로 4 셀 배아 또는 8 세포 배아의 왼쪽 V2의 할구의 왼쪽 복부 할구가 바늘을 마주 보도록 배아를 정렬합니다. </li><li> 디쉬 각 배아 선택된 할구로 주사액 10 NL 주입한다. 주 : 배양 접시의 바닥에 메쉬는 배아를 안정화시키고 그들을 안정화 모발 루프를 사용하지 않고 삽입 될 수 있도록 구르는을 방지한다. </li><li> 전송 0.3 배의 MMR + 30 mg을 / ㎖ 겐타 마이신 5 % 피콜 충전 된 문화 판의 우물에 배아를 주입. 주입 된 배아를 품어적어도 한 시간 동안 16 ° C에서의이 주입 된 할구 치유 할 수 있도록합니다. </li><li> 단계 9 (전 낭 배기로)으로 0.3 배의 MMR + 30 ㎎ / ㎖ 겐타 마이신 충전 된 새로운 문화 판의 우물에 치유 배아를 전송합니다. </li><li> 40 21 - 배아 단계 38에 도달 할 때까지 22 °의 C - 14 배아를 품어. </li></ol> 4. 고정 및 태아의 면역 염색 <ol><li> MOPS / EGTA / 황산 마그네슘 50 ㎖를 준비 / 포름 알데히드 버퍼 [MEMFA : 100 mM의 MOPS (PH 7.4), 2 mM의 EGTA, 1 mM의 황산, 3.7 % (v / v)의 포름 알데히드]. </li><li> 유리 병에 40 배아 - 20 단계 (38) - 전송 피펫을 사용하여, 10을 넣어. 혼합 유리 병 및 반전 바이알에 100 % 에탄올에 10 ㎕의 5 % 벤조 카인을 추가합니다. 배아를 마취 10 분을 기다립니다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 유리 병에서 MMR을 제거합니다. 동시에 다수의 튜브를 처리하는 경우, 바이알을 24 웰 세포 배양 플레이트에 수직으로 유지 될 수있다. </li><li> 유리 파이프TTE, MEMFA와 유리 병을 채 웁니다. 실온에서 1 시간 동안 입체 요동 플랫폼 바이알을 놓는다. </li><li> 유리 피펫을 사용하여 유리 병에서 MEMFA를 제거합니다. 100 % 메탄올 병을 채 웁니다. 실온에서 10 분 동안 입체 요동 플랫폼 바이알을 놓는다. 이 세척 단계를 한 번 더 반복하고, -20 ° C에서 100 % 메탄올 하룻밤에 배아를 저장합니다. </li><li> 준비 1X 인산 완충 생리 식염수 - 소 혈청 알부민 트리톤 (PBT) 1X PBS, 2 ㎎ / ㎖ 소 혈청 알부민, 0.1 % 트리톤 X-100. </li><li> 1X PBT 1 10 %의 염소 혈청과 : 차 항체 솔루션을 준비 마우스 단일 클론의 5 희석 4A6 항체, 마우스 모노클로 날 항체 3G8의 1:30 희석합니다 (중간 말단과 연결 세관 (20)의 막을 레이블을) 그리고 1 (근위 세뇨관 (20)의 라벨 루멘에) : 토끼 폴리 클로 날 RFP 항체의 250 희석합니다 (MEM-RFP의 추적 라벨을합니다). 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> seconda 준비공예 항체 용액 : 10 % 염소 혈청과 1X PBT, 1 : 500 알렉사 488 염소 항 - 마우스 IgG (재고 농도 2 ㎎ / ㎖, 라벨 4A6 및 3G8로), 1 : 500 알렉사 555 염소 항 - 토끼 IgG를 (주 농도 2 ㎎ / ㎖하며 MEM-RFP의 추적 라벨을). 저장 4 ° C에서, 호일에 튜브를 다루는 것은 빛으로부터 보호 할 수 있습니다. </li><li> 또한, 염색 후 기본 및 보조 항체를 수집하고, 미래의 실험에서 재사용 4 ° C에 저장합니다. 항체는 재사용을 위해 저장되어야하는 경우, 0.01 %의 아 지드 화 나트륨을 추가한다. </li><li> 설립 된 프로토콜 (18)을 사용하여 배아를 발현 사이. </li></ol> 태아 및 대상 Pronephric 조직의 분석 5. 시각화 <ol><li> 올바른 할구는 1X에서 형광 실체 현미경 하에서 추적의 형광을 확인하여 주입되었는지 확인하기 위해 면역 염색 배아를 화면 (전체 배아를 볼 수)과 5 배 확대 (신장를 볼 수 있습니다). 우리와 멀티 웰 유리 접시에 장소 배아1X PBT는 끝이 전송 피펫을 사용하여 가득 재편이 차단. 헤어 루프 배아를 조작 할 수 있습니다. 배아의 왼쪽에있는 pronephros의 공동 주입 추적 존재가있는 경우에만 배아를 사용합니다 (그림 3C, F 및 그림 4C, F) 유전자 과발현 또는 최저 분석. </li><li> 유리 병에 배아를 놓고 머레이의 취소와 함께 유리 병을 작성하여 : 또는 머레이의 지우기의 배아 (1 부 벤질 알코올이 부분 벤질 벤조 에이트)을 취소합니다. 유리 웰 플레이트를 사용하여 배아를 시각화합니다. 참고 : 머레이의 삭제는 유기 용매 및 취급시주의해야한다. 장갑을 착용하고 만 머레이의 투명 유리 튜브 및 피펫을 사용합니다. </li><li> 삼주 - 2 4 ° C 1 배에서 PBT에서 보관 배아. 배아의 장기 저장을 위해 10 분 동안 실온에서 100 % 메탄올을 두 번 세척하여 배아 탈수. 100 % 메탄올에서 -20 ° C에서 배아를 저장합니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Xenopus의 배아를 개발하는 pronephros을 타겟팅 확인하고 올바른 할구 주입에 의존합니다. 8 셀 배아의 V2의 할구의 주입 왼쪽 pronephros (18)을 목표로하고있다. 이 내부 통제와 반대편 오른쪽 pronephros을 떠난다. 모르가 녹다운 또는 RNA 과발현이 신장 개발을 변경하는 데 사용되는 경우, 반대측 pronephros 오른쪽 왼쪽 pronephros에 유전자 녹다운 또는 과발현의 효과를 비교하기 위해 사용될 수있다. 이 경우, 이러한 불일치 제어 모르 지배적 네거티브 RNA 구조체와 같은 적절한 제어 유전자 발현의 변화의 결과를 분석하는 반대쪽 내부 제어에 부가하여 사용해야한다. 인해 Xenopus의 배아의 상대적 투명성, 신장 결함 쉽게 여러 기술을 이용하여 정량화 할 수있다. 예를 들어, 유전자 녹다운 또는 과발현은 단순히 배아 pronephric 인덱스를 산출함으로써 정량 할 수있다배아의 분사 제어 측면에서 근위 세뇨관의 개발을 비교 항체...

Xenopus의 배아 신장의 pronephros은 신장 개발 및 질병 연구를위한 좋은 모델입니다. 배아 외부 개발 크기가 크며, 대량으로 제조 할 수 있고, 용이하게 미세 주사 또는 수술을 통해 조작된다. 또한, 포유류와 양서류의 신장 발달을 지배하는 유전자가 보존되어있다. 배아 양서류가 pronephros이 성인 양서류가 metanephros을하면서 pronephros, mesonephros 및 metanephros 1 : 포유류의 신장은 세 단계를 통해 진행. 이러한 신장 형태의 기본 필터링 유닛 네프론이며, 포유류 양서류 모두 nephrogenesis (2, 3)를 거쳐 동일한 시그널링 캐스케이드 및 유도 이벤트를 요구한다. 아프리카 발톱 개구리 pronephros는 근위, 중간의 선단과 세관의 접속 이루어지는 단일 네프론 포함 및 (포유 동물 사구체와 유사)는 사구 1, 4-6 (그림 1 </str옹&gt;). Xenopus의의 pronephros에서 하나의 큰 네프론 존재는 신장 개발 및 질병 과정에 관여하는 유전자의 연구에 대한 간단한 모델로 적합합니다. 세포 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립, 자유롭게 Xenbase 7-11에서 온라인으로 사용할 수있다. 동일한 기술은 같은 심장이나 눈과 같은 다른 조직을 대상으로 적용 할 수 있지만, 여기, 우리는 개발 Xenopus의의 pronephros을 대상으로 계보 추적자의 미세 주입하는 기술에 대해 설명합니다. 리니지 추적자는 초기 할구에 주입 될 수 있으며, 개발하는 동안 그 셀의 자손의 시각화를 허용 (중요한 염료, 형광 표지 된 덱스 트란, histochemically 검출 효소와 mRNA를 형광 단백질을 코딩 포함) 라벨이다. 이 프로토콜은 MEM-RFP의 mRNA는, 인코딩 막은 계보 추적으로, 적색 형광 단백질 (12)를 대상으로 사용합니다. 대상 미세 주입 기술여기에 설명 된 4 - 8 세포 배아의 개별 할구에 대한 niques 관심의 유전자를 과발현하는 유전자 발현, 또는 외인성 RNA와 함께 아래로 노크 morpholinos와 함께 주입을 위해 이용 될 수있다. 복부, 식물 할구에 주입하여, 주로 배아의 pronephros이 발달 컨트롤로 반대편 pronephros를 떠나, 타겟이 될 것입니다. 추적자의 공동 주입 올바른 할구 주입 된 것을 확인하고, 태아에 어떤 조직이 쇼는 pronephros의 대상 확인, 주입 된 할구에서 일어났다. pronephros의 면역 염색은 pronephric 세관을 대상으로 한 얼마나 잘 시각화 할 수 있습니다. 과발현 녹다운 효과는 발달 제어 역할 배아의 반대쪽에 대해 획득 될 수 있고, 13 pronephric 인덱스를 계산하는데 사용될 수있다. 세포 운명 맵의 가용성이 타겟 마이크로 인젝션 기술 OTH 조직을 대상으로 사용될 수 있도록어 pronephros, 형광 추적자의 공동 주입보다는 각 조직의 표적 미세 주입 분석하기 전에 확인할 수 있도록합니다. 배아 미세 주입 동안 발육 온도 단단히 통제 Xenopus의 발생률이 14에 크게 의존한다는 주어져야한다. 개발 시간이 둔화되기 때문에 4- 및 8 셀의 주사에 대해 - (16 °의 C (14)) 배아는 낮은 온도에서 배양한다. 22 ° C, 1 단계 (1 셀)에서 개발 시간에서 16 ° C 개발 시간에서 3 약 4 시간입니다 무대 동안 3 (4 셀), 약 2 시간입니다 무대입니다. 그것은 22 ° C에서 8 셀 (단계 4) 배아에 4 셀 배아에서 이동 약 15 분 걸리지 만 16 ℃에서 약 30 분 정도 소요됩니다. 마찬가지로, 22 ° C에서, 만 16 세포 배아 (단계 5)으로 진행하는 8 세포 배아 30 분 정도 걸립니다. 이 시간은 16 ° C 45 분으로 증가한다. 그만큼refore, 배아 16 세포 단계로 진행하기 전에 8 세포 단계에서 주입을위한 충분한 시간을 사용하는 배아의 발전 속도를 느리게하는 것이 유용하다. 또한, 성장 온도는 속도를 높이거나 신장이 완전히 개발 될 때까지 배아 발달을 느리게 조절 될 수있다. 올챙이 단계 Xenopus의 배아의 표피 조직 (15)의 절개 또는 청산하지 않고 개발 pronephros 쉽게 영상을 허용, 상대적으로 투명하다. 인해 Xenopus의 배아의 상대적 투명성, 생균 촬상 16,17 또한 가능하다. 이후 Xenopus의 배아 18-20에서 유전자 발현의 조작을 대상으로 pronephric 개발 평가 수 (40) 배아 - pronephros을 시각화하는 면역 염색하면, 중간 원위 인접, 무대의 연결 세관 (38) 레이블을 설립 항체 가능한 항목의 마운트.

<table><tbody><tr><td>나트륨 염화</td>물 <td>Fisher</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 염화</td>물 <td>Fisher</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-500</td><td></td></tr><tr><td>겐타마이신 용액, 50 mg/ml</td><td>Amresco</td><td>E737-20ML</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine, 99%+</td><td>Acros Organics</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher</td><td>BP525-100</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Mini Fridge II</td><td>Boekel 260009</td><td></td><td>배아용 벤치탑 인큐베이터.</td></tr><tr><td>Gap43-RFP 플라스미드</td><td></td><td></td><td>추적자 RNA 제조용. 참조: Davidson et al., 2006.</td></tr><tr><td>로다 민 덱스트란, 10,000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D1817</td><td>트레이서.</td></tr><tr><td>분자 생물학 등급, USP 멸균 정제</td>수 <td>Corning</td><td>46-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>7" 드러먼드 교체 튜브</td><td>드러먼드</td><td>3-000-203-G/XL</td><td>마이크로 주입 바늘.</td></tr><tr><td>바늘 풀러</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td>미세 주입 바늘 팁을 파괴하기 위해.</td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>드러먼드</td><td>3-000-204</td><td>마이크로인젝터.</td></tr><tr><td>미네랄 오일, 바늘 용 무거운</td><td>피셔</td><td>CAS 8042-47-5</td><td>오일.</td></tr><tr><td>27 G Monoject 피하 주사 바늘</td><td>Covidien</td><td>8881200508</td><td>microinjection 바늘로 광유 적재를 위해.</td></tr><tr><td>5ml Luer-Lok 주사기</td><td>BD</td><td>309646</td><td>마이크로 주입 바늘에 미네랄 오일을 적재합니다.</td></tr><tr><td>60mm x 15mm 페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>800미크론 폴리에스터 메쉬</td><td>소형 부품</td><td>CMY-0800-C</td><td></td></tr><tr><td>이송 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-711-7M</td><td>배아 이식용. 배아가 피펫에 쉽게 흡수되도록 팁을 잘라냅니다.</td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Acros Organics</td><td>67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td></td><td>Fisher BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>15 mm x 45 mm 나사산 바이알</td><td>Fisher</td><td>03-339-25B</td><td>배아 고정, 염색 및 보관용.</td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Nest Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benzocaine</td><td>Spectrum</td><td>BE130</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 1x 분말</td><td>Fisher</td><td>BP661-50</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>3D 미니 로커, 모델 135</td><td>Denville Scientific</td><td>57281</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청, 뉴질랜드 유래</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Fisher</td><td>S227I-25</td><td></td></tr><tr><td>단클론 3G8 항체</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>표지 근위 1차 항체 세뇨관.</td></tr><tr><td>단클론 4A6 항체</td><td>European Xenopus Resource Centre</td><td></td><td>중간, 원위 및 연결 세뇨관을 라벨링하는 1차 항체.</td></tr><tr><td>anti-RFP pAb, 정제된 IgG/rabbit</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td>Gap43-RFP 추적자를 표지하는 1차 항체.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11001</td><td>신장 세뇨관 라벨링에 대한 2차 항체.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 염소 항토끼 IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21428</td><td>Gap43-RFP 추적자 표지 2차 항체.</td></tr><tr><td>9 캐비티 스폿 플레이트</td><td>Corning</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>벤질 벤조 에이</td>트 <td>피셔</td><td>105862500</td><td>옵션 - 배아 제거 용</td></tr><tr><td>벤질 알코올</td><td>Fisher</td><td>A396-500</td><td>옵션 - 배아 제거 용</td></tr></tbody></table>

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; xenopus의</em&gt; 신장

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

제노 laevis의 (개구리)에 pronephros의 배아 신장은 하나의 네프론 구성 및 신장 질환에 대한 모델로서 사용될 수있다. 제노 배아 외부 개발 크고, 쉽게 미세 주입 또는 외과 수술에 의해 조작 될 수있다. 또한, 운명의지도는 초기 Xenopus의 배아 설립되었습니다. 결국 기관 또는 조직의 관심을 야기한다 개별 할구로 타겟 마이크로 인젝션 선택적 배아의 나머지의 차 효과를 감소 또는 과발현이 제한된 영역 내에서 유전자 발현을 녹아웃하기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에서는, 우리는 4 - 8 세포 배아의 특정 할구에 미세 주입을 통해 개발 Xenopus의 신장합니다 (pronephros)를 대상으로 설립 Xenopus의 운명 맵을 활용하는 방법에 대해 설명합니다. 계보 추적자의 주입은 주입의 구체적인 타겟팅의 확인을 할 수 있습니다.배아 38 무대 개발 후 - 40 전체 마운트 면역 염색을 pronephric 개발 시각화 사용되고 pronephros 타겟팅 세포에 의한 기여가 평가 될 수있다. 동일한 기술은 pronephros 외에 다른 조직 유형을 표적으로하도록 할 수있다.

MEM-RFP의 mRNA와 4- 및 8 셀 Xenopus의 배아의 Microinjections는 pronephros을 대상으로 서로 다른 수준을 보여줍니다.도 4 단계 올바른 MEM-RFP mRNA 발현 패턴 (40) 배아 그림. 배아는 왼쪽 복부 할구 (그림 4A)에 주입하고, MEM-RFP의 mRNA의 적절한 발현 패턴 분류 하였다. 중간 근위 말단에서 MEM-RFP를 발현하고, 신장 세관의 접속뿐만 아니라, 적절하게 주입 배아 머리, 몸통 및 꼬리 표피에서 형광을 표시 할 것으로 기대된다. 그들은 또한 otocyst에 형광, 시멘트 선, proctodeum 및 somites (그림 4C)를 표시해야합니다. 8 적절히 주입 배아 신장 MEM-RFP 형광의 분포 형광 실체 현미경 (도 4b)로 측정 하...

여기에서는 운명 지도와 계통 추적자를 사용하여 Xenopus laevis 배아의 신장을 생성하는 개별 할구에 주입하는 프로토콜을 제시합니다.

개발에 미세 주입을 대상으로 기술<em&gt; Xenopus의</em&gt; 신장

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

이 실험 과정의 전반적인 목표는 발달 중인 제노푸스(xenopus) 신장을 대상으로 미세주입을 수행하는 것입니다. 이 방법은 신장이 어떻게 형성되는지, 그리고 이 과정에서 어떤 유전자가 중요한지와 같은 발생 생물학 분야의 핵심 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 미세주입된 시약이 표적 조직에 최대한 전달되도록 한다는 점입니다.표적 미세주입을 위해 정확한 할구를 식별하는 것이 매우 중요하므로, 이 방법의 시각화가 중요합니다. 이 절차를 시작하려면 수컷 개구리 한 마리에서 양쪽 정소를 모두 분리하여 10 mL의 정소 보관 용액이 채워진 60 mm 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음 정소를 4 °C에서 보관하십시오.다음으로, 100 millimeter 페트리 접시에서 암컷 개구리의 알을 수집합니다. 페트리 접시에서 과잉의 물을 따라냅니다. 그 후, Testes Storage Solution 내에서 정소의 4분의 1을 절단합니다.정소 조각을 알이 들어 있는 페트리 접시에 옮깁니다. 이어서, 정소 부분을 작은 조각으로 자릅니다. 알이 잠길 정도로 MMR과 Gentamycin 혼합액을 페트리 접시에 추가합니다.디쉬를 부드럽게 돌려 섞어준 후, 실온에서 수정이 이루어질 때까지 약 30분 동안 기다립니다. 수정 후 배아의 색소가 있는 쪽이 위를 향해야 합니다. 트랜스퍼 피펫을 사용하여 페트리 디쉬에서 MMR을 제거하고 배아를 덮을 수 있을 만큼의 탈젤리 솔루션을 추가합니다.그 후, 배아의 젤리 코트를 녹이기 위해 몇 분 동안 접시를 가볍게 흔들어 줍니다. 배아들이 접시 중앙에 서로 밀착되면 젤리 코트가 제거된 것입니다. 전이 피펫을 사용하여 탈젤리 용액을 제거합니다.다음으로, MMR과 Gentamycin 혼합액을 조심스럽게 따라내고 새로운 MMR로 채우는 과정을 3~5회 반복하여 탈젤 처리된 배아를 세척합니다. 배아가 손상될 수 있으므로 디쉬 내의 MMR을 완전히 제거하지 마십시오. 그 후, 페트리 디쉬에서 수정되지 않은 난자나 정소 조각을 제거합니다.발달 시기를 조절하기 위해, 단일 수정란 집단의 절반은 14 °C로 유지되는 페트리 접시에 넣고, 나머지 절반의 배아는 18 °C로 유지되는 페트리 접시에 넣습니다. 배아는 18 °C보다 14 °C에서 더 느리게 발달합니다. 이를 통해 한 번의 수정란 집단으로부터 여러 차례의 주입 실험 세트를 수행할 수 있습니다.0.01 ng/nL의 세포막 결합 적색 형광 단백질(Membrane-bound Red Fluorescent Protein) mRNA가 포함된 주입 용액을 준비하십시오. 배아가 4세포기 또는 8세포기로 발달하는 동안 준비하며, 주입 용액은 사용 전까지 얼음 위에 보관하십시오.그런 다음, 7인치 교체용 유리 모세관을 니들 풀러(needle puller)에 장착하고, 교체용 튜브의 상단이 니들 풀러 케이스의 상단과 일직선이 되도록 맞춥니다. 가열 값 2(heat number two)를 800으로, 풀 값(pull value)을 650으로 설정한 후 풀 버튼을 눌러 니들을 뽑아냅니다. 그 후, Dumont 포셉을 사용하여 뽑아낸 니들의 끝부분을 잘라냅니다.마이크로피펫 콜렛을 바늘 뒷부분에 끼웁니다. 다음으로, 콜렛 뒤쪽 바늘 뒷부분에 큰 구멍의 O-링을 끼웁니다. 이제 27 gauge 하이포더믹 바늘을 사용하여 바늘 내부에 미네랄 오일을 채우되, 바늘 안에 기포가 들어가지 않도록 주의하십시오.마이크로인젝터의 플런저에 바늘을 끼우고, 플런저에 설치된 흰색 플라스틱 스페이서의 큰 구멍에 바늘이 밀착되도록 합니다. 콜렛을 조여 바늘을 고정합니다. 다음으로, 마이크로인젝터 제어 박스의 "Empty" 버튼을 두 번의 비프음이 들릴 때까지 길게 누릅니다.그 후, 파라필름 조각 위에 주입액 3 µL를 피펫으로 분주합니다. 그런 다음, 파라필름 위의 주입액 방울 속에 바늘 끝을 넣습니다. 마이크로인젝터 제어 박스의 "Fill" 버튼을 길게 눌러 바늘 안으로 주입액을 흡입합니다.미세주입을 수행하기 전, 제노푸스 배아의 초기 세포 분열을 이해하는 것이 중요합니다. 단세포 배아는 어둡게 색소가 침착된 동물극과 희고 노른자가 많은 식물극을 가지고 있습니다. 2세포 배아의 경우, 첫 번째 난할은 일반적으로 배아의 좌우 측면 사이에서 일어납니다.이 세포들은 전신(pronephric) 계보에 동일하게 기여합니다. 두 번째 난할은 배아의 등쪽 절반과 배쪽 절반을 나누어 4세포기 배아를 형성합니다. 등쪽 세포는 배쪽 세포보다 크기가 더 작고 색소가 적습니다.4세포기 배아에 주입하는 경우, 왼쪽 신장을 표적으로 하기 위해 왼쪽 복측 할구에 주입하십시오. 세 번째 난할은 동물극과 식물극 쪽을 이등분하며, 그 결과 8세포기 배아가 됩니다.이 시점에서 동물극 할구 4개와 식물극 할구 4개가 존재합니다. 8세포기 배아의 왼쪽 신장을 표적으로 하려면 왼쪽 복측 식물극 할구에 주입하십시오. 그 다음, 500 micron 폴리에스터 메쉬가 깔린 60 millimeter 페트리 접시에 Gentamycin을 첨가한 MMR 및 5% fycol 용액을 채우십시오.8세포기 배아 20~30개를 디쉬에 조심스럽게 피펫팅합니다. 헤어 루프를 사용하여 주입할 할구가 바늘을 향하도록 배아를 조작합니다. 왼쪽 신장을 타겟팅하려면, 8세포기 배아의 왼쪽 복측 식물극 할구가 바늘을 향하도록 배아를 정렬합니다.디시 내 각 배아의 선택된 할구에 주입 용액 10 nanoliters를 주입합니다. 그런 다음, 주입된 배아를 5% fycol이 포함된 MMR plus Gentamycin이 들어있는 배양 플레이트의 웰로 옮깁니다. 주입된 할구가 회복될 수 있도록 주입된 배아를 16 °C에서 약 1~2시간 동안 배양합니다.그 후, 미세주입된 배아를 Gentamycin이 첨가된 MMR로 채워진 배양 플레이트의 새 웰로 옮깁니다. 배아가 38~40단계에 도달할 때까지 14~22°C에서 배양합니다. 이 과정에서 38~40단계의 배아 10~20개를 유리 바이알로 옮깁니다.100% ethanol에 5% benzocaine이 포함된 용액 10 µL를 바이알에 추가합니다. 바이알을 뒤집어 섞어준 후, 배아를 마취시키기 위해 10분 동안 기다립니다. 그다음, 바이알에서 MMR을 제거하고 MEMFA로 채웁니다.그다음, 이를 3차원 로킹 플랫폼(rocking platform) 위에 올려놓고 실온에서 1시간 동안 반응시킵니다. 1시간 후 바이알에서 MEMFA를 제거하고 100% 메탄올로 채웁니다. 그런 다음, 바이알을 3차원 로킹 플랫폼 위에 올려놓고 실온에서 10분 동안 반응시킵니다.이 세척 단계를 한 번 더 반복하고 배아를 100% 메탄올에 넣어 -20 °C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 이제 배아는 고정되었으며 면역 염색 준비가 완료되었습니다. 이 도식은 Membrane-bound Red Fluorescent Protein mRNA를 추적자로 사용하여 8세포기 xenopus 배아의 왼쪽 전신(pronephros)을 표적하기 위해 어느 할구를 주입해야 하는지 보여줍니다.왼쪽 복측 식물극 할구에 주입한 후의 추적자 국소화는 빨간색으로 표시되었으며, 신장은 녹색으로 표지되었습니다. 이 이미지는 3G8 및 4A6 항체로 인해 신장이 녹색으로 염색되었음을 보여줍니다. 여기는 추적자 국소화를 보여주는 신장 영역의 확대 보기이며, 여기는 추적자와 신장의 공동 국소화를 보여주는 병합 이미지입니다.여기에 3G8 및 4A6로 염색한 두 번째 배아 신장의 공초점 이미지가 나와 있습니다. 이는 신장과 주변 조직 내 적색 추적자의 국소화 모습이며, 이 이미지는 신장에서 추적자 3G8과 4A6의 공국소화를 보여주는 병합 이미지입니다. 이 절차를 수행하기 전에 초기 제노푸스 배아에 익숙해지는 것이 중요합니다.이를 통해 기정의된 제노푸스(xenopus) fade map을 사용하여 미세주입 위치를 정확하게 지정할 수 있습니다. 이 기술을 숙달하면 신경관이나 심장과 같은 다른 조직을 대상으로 하는 방법으로 응용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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배우세요 Xenopus laevis 배아의 특정 분열구에 미세주입을 수행하여 신장 발달을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 유전자 기능 분석과 장기형성 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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