시토크롬을 캡슐화

이 절차의 전반적인 목표는 cytochrome c를 실리카 솔-젤(Silical sol-gels)에 캡슐화하는 것입니다. 이러한 젤을 초임계 공정으로 처리하여 바이오 에어로젤을 형성하고, 이 바이오 에어로젤을 사용하여 기상 반응을 통해 일산화질소를 빠르게 인식하는 것입니다. 이 방법은 고다공성 에어로젤에 캡슐화되었을 때 cytochrome c가 활성을 유지하기 위해 어떤 조건이 필요한가와 같은 바이오센싱 및 바이오 분석 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 기술의 의의는 단백질 캡슐화가 쉽지 않았던 매트릭스 내에 단백질을 캡슐화하는 간단한 절차라는 점에 있습니다. 이 방법은 cytochrome c에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 향후 바이오 분석 기기에 활용될 가능성이 있는 다른 단백질의 에어로젤 캡슐화를 위한 절차적 발전을 이끌 수 있습니다. Cytochrome c 농도가 0.7에서 millimolar 범위인 용액을 제조하십시오.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 희석된 0.105 millimolar cytochrome c 용액을 준비합니다. 그다음, 일회용 50 milliliter 폴리프로필렌 비커에 '비커 A'라고 표시합니다. 분석 저울의 팬 위에 비커를 올리고, 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 비커에 1.88 grams의 tetra methoxy silane을 넣습니다. 저울의 영점을 조절합니다.

그런 다음 메탄올 2.88 g을 비커 A에 피펫으로 넣습니다. 비커 A를 파라필름으로 덮습니다. 이어서 Beaker B라고 표시된 일회용 50 mL 폴리프로필렌 비커에 마그네틱 스터 바를 넣고 분석 저울의 팬 위에 올립니다. 유리 피펫을 사용하여 물 0.75 g과 메탄올 3.00 g을 추가한 후, 비커 B를 파라필름으로 덮습니다.

흄 후드 내의 교반기 위에서 비커 B의 내용물을 교반하기 시작합니다. 그런 다음, 교반하는 동안 주사기를 사용하여 파라필름 덮개를 통해 28.0~30.0% 수산화암모늄 용액 5 µL를 혼합물에 주입합니다. 이 단계가 완료되는 즉시, 비커 A의 내용물을 비커 B에 넣습니다. 파라필름으로 덮은 상태에서 혼합물을 20분 동안 교반합니다.

실리카 솔 혼합물이 섞이는 동안, 8~9개의 폴리프로필렌 신틸레이션 바이알과 해당 캡을 준비합니다. 바이알의 캡 쪽 끝에 플라스틱 랩을 씌워 겔이 형성될 수 있는 평평한 표면을 만듭니다. 그 위에 캡을 덮습니다.

플라스틱 랩이 캡 내부에 온전하게 유지되도록 합니다. 바이알의 캡 부분이 벤치 탑을 향하게 하고 열려 있는 바닥 부분이 위를 향하도록 정렬합니다. 그런 다음 각 바이알을 덮는 데 사용할 파라필름 조각들을 자릅니다.

졸 혼합이 완료되면, 깨끗한 일회용 50 milliliter 폴리프로필렌 비커에 졸 혼합물 3 milliliters를 넣습니다. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 0.105 millimolar로 희석된 cytochrome c 용액 500 microliters를 약 1분에 걸쳐 비커 벽면을 따라 3 milliliter의 졸 혼합물 속으로 매우 천천히 떨어뜨립니다. 이때 큰 붉은색 덩어리가 형성되는 것을 방지하기 위해 cytochrome c를 추가하면서 혼합물을 부드럽게 소용돌이치듯 섞어줍니다.

결과물인 cytochrome c 실리카 졸 0.5 milliliters를 준비된 각 몰드에 피펫으로 분주합니다. 또한, 초임계 건조 과정 중 대조군 샘플로 사용하기 위해 남은 일반 실리카 졸 0.5 milliliters를 한두 개의 몰드에 분주합니다. 몰드의 위쪽 개구부를 파라필름으로 덮고, 솔-젤을 생성하기 위해 냉장고에 하룻밤 또는 최소 12시간 동안 보관합니다.

냉장고에서 몰드를 꺼냅니다. cytochrome c 솔 겔이 들어 있는 몰드 하나에서 상단의 파라필름을 제거하고, 하단의 캡과 플라스틱 랩도 제거합니다. 세척병의 에탄올을 몰드 안에 약간 넣은 후, 시린지 플런저의 원형 디스크 끝부분을 사용하여 겔을 몰드 밖으로 조심스럽게 밀어내어 약 5 milliliters의 에탄올이 들어 있는 깨끗한 20 milliliter 유리 신틸레이션 바이알에 옮깁니다.

모든 cytochrome c 겔이 바이알에 담기고 모든 실리카 겔이 별도의 바이알에 담길 때까지 이 겔 제거 절차를 반복하십시오. 그 후 바이알의 상단까지 에탄올을 채웁니다. 캡을 닫고 2 및 8 °C 사이에서 보관하십시오.

하루 동안 4시간마다 냉장고에서 겔을 꺼냅니다. 겔 위에 있는 에탄올을 따라내어 버리고, 신선한 에탄올로 교체합니다. 이후 3일 동안 젖은 솔-겔을 아세톤에 담그고, 하루에 세 번 아세톤을 따라내고 신선한 아세톤을 추가합니다.

부착된 순환기의 온도를 8°C로 설정하여 임계점 건조 장치를 10°C까지 냉각합니다. 장치가 10°C에 도달하면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 장치의 누출 테스트를 수행합니다. 장치에 누출이 없음을 확인한 후, 신틸레이션 바이알에 들어있는 젖은 겔과 아세톤의 대부분을 전송 보트의 세 개의 긴 섹션에 조심스럽게 붓습니다.

장치 내부의 보트를 밀봉하기 전에 모든 겔이 아세톤에 완전히 잠겼는지 확인하고, 필요 시 아세톤을 더 추가하십시오. 장치의 충전 밸브를 열어 이산화탄소를 주입합니다. 장치 창을 통해 이산화탄소가 장치 바닥으로 가라앉는 것이 관찰되면, 배수 밸브를 열어 5분 동안 아세톤을 배출하십시오.

아세톤이 바닥으로 스며 나오는 현상은 장치가 이산화탄소로 완전히 채워지기 전에 발생합니다. 따라서 배출하는 동안 충전 밸브를 열어두어 장치에 계속해서 충전이 이루어지도록 하십시오. 그 다음, 배출 밸브를 닫으십시오.

충전 밸브를 약간만 열어 둡니다. 아세톤이 무수 상태가 아니기 때문에, 처음 배출되는 혼합물에는 물이 포함되어 있습니다. 배수 튜브 내에서 동결, 막힘 및 압력 상승이 발생할 수 있습니다.

막힘이 감지되면 막힌 부분이 녹을 때까지 배수 밸브를 닫으십시오. 5분 후, 배수 밸브를 다시 열어 5분 동안 유지하고, 배수 시간 내내 장치 내부가 가득 찬 상태를 유지할 수 있도록 주입 밸브의 개도량을 조절하십시오. 5분 후, 배수 밸브를 닫고 주입 밸브는 약간만 열어 둔 상태로 유지하십시오.

그 다음, 5분 후에 이 배출 단계를 한 번 더 반복합니다. 배출 단계가 모두 완료되면 충전 밸브를 닫고 액체 이산화탄소를 배출하여, 장치 창을 통해 보트의 프롱 바로 위에 액체 레벨이 보이도록 유지합니다. 다음으로, 액체 이산화탄소가 임계 온도와 임계 압도 이상으로 상승하도록 장치에 연결된 순환기의 온도를 40 °C로 설정합니다.

약 15분 후, 보트의 프롱 상단에 있는 액체 메니스커스가 사라지면서 액체가 초임계 유체로 전이되는 과정을 장치 창을 통해 관찰하십시오. 최소 15분 동안의 평형 시간을 거친 후, 벤트 밸브를 소량 열어 초임계 유체를 방출하기 시작합니다. 약 45분에 걸쳐 벤트 밸브를 점진적으로 더 넓게 계속 열어, 유체가 방출되는 낮고 일정한 쉿 하는 소리가 들리고 압력계의 수치가 천천히 0으로 감소하는 것을 확인하십시오.

장치의 압력이 0으로 떨어지면, 장치 도어를 엽니다. 보트를 꺼냅니다. 그리고 핀셋을 사용하여 새로 건조된 에어로젤을 깨끗한 유리 신틸레이션 바이알에 옮깁니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 특성 분석을 마친 cytochrome c 실리카 에어로젤을 이제 일산화질소 가스의 존재를 검출하는 데 사용할 준비가 되었습니다. 4.4 millimolar, 40 millimolar 및 70 millimolar 인산칼륨 완충액에서 15 micromolar cytochrome c를 캡슐화한 에어로젤을 10센트 동전과 비교하여 보여줍니다. 여기에서는 다양한 조건 하에서 에어로젤에 캡슐화된 cytochrome c와 완충액 내의 cytochrome c를 비교한 대표 스펙트럼을 보여줍니다.

409 nanometers에서의 cytochrome c soret 피크는 에어로젤 내에서 기본적으로 이동하지 않으며, 바이오 에어로젤이 기상 일산화질소에 노출될 때 특성적인 적색 이동을 나타냅니다. 이 영상을 시청한 후에는 실리카 졸-겔을 합성하고, 이 졸-겔 내에 cytochrome c를 캡슐화하며, 이러한 복합 졸-겔을 건조시켜 에어로젤로 만드는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 바이오 에어로젤의 특성 분석 및 기상 일산화질소 검출을 위한 바이오 에어로젤 사용에 관한 자세한 정보는 텍스트 프로토콜에서 확인할 수 있습니다.